桑椹防治肝腎陰虛型冠心病成分與作用機制分析

宋曉漫，李文林,2?，楊麗麗，曾 莉

（1. 南京中醫(yī)藥大學 針灸推拿養(yǎng)生康復學院，江蘇 南京 210023；2. 南京中醫(yī)藥大學，江蘇省中藥資源產業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心，敬文圖書館，江蘇 南京 210023；3. 南京中醫(yī)藥大學 第一臨床醫(yī)學院，江蘇 南京 210023）

冠心?。╟oronary heart disease, CHD）又稱冠狀動脈粥樣硬化性心臟病，是由于血脂異常、動脈粥樣硬化等因素致使管腔狹窄或閉塞，進而引發(fā)心肌缺血、缺氧或壞死的一種復雜慢性炎癥性疾病[1]。中醫(yī)將其歸為“胸痹”“心悸”“真心痛”等范疇。近年來，隨著社會壓力的增大，不健康生活方式的流行，心血管患病率逐年提升。據世界衛(wèi)生組織報道[2]，全球有7.3億人死于CHD，預計到2030年將達到23.3億人次。在我國，CHD是造成城鄉(xiāng)居民死亡的主要病因之一，截止到2016年死亡病例數高達173.6萬，已成為心血管疾病中威脅人類健康的第二大疾病[3]。研究表明，食品是影響機體功能和健康狀態(tài)的主要因子[4]，CHD的發(fā)生、發(fā)展及防治與其有著密切的關系，日常攝取對于CHD的防治具有重要意義。

桑椹（Mori Fructus）是桑樹的成熟果實，又名桑果、桑棗等，性寒，味甘、酸，歸心、肝、腎經，具有“滋陰補血，生津潤燥”的功效，主治肝腎陰虛證[5]，也是國家衛(wèi)生部首次批準的“藥食同源”物品之一，不僅可以應用于臨床，亦可以用于食品、茶飲料等貫穿于日常生活。古代醫(yī)籍中有較多其防病治病的記載，《新修本草》述其“單食，止消渴”[6]，《養(yǎng)生類纂》記載其“補五臟，和經脈，通血氣”[7]?，F代已有藥理研究指出桑椹中含有多糖類、黃酮類、花色苷、白藜蘆醇等多種化學成分，對于肥胖、血脂、血壓等心血管相關疾病存在較好的調節(jié)作用，結合其性味歸經，推測其在防治肝腎陰虛型CHD方面具有較大的開發(fā)價值[8-12]。

網絡藥理學是基于系統(tǒng)生物學理論對中藥進行多成分、多靶點、多通路的挖掘，與中醫(yī)學整體觀念和辨證論治思想存在諸多相似之處，是中醫(yī)藥新藥研發(fā)和向現代化邁進的新方法，已廣泛應用于中醫(yī)藥研究領域[13]。因此，本研究運用網絡藥理學方法并結合分子對接對桑椹防治肝腎陰虛型冠心病成分與作用機制進行挖掘，以期為防治肝腎陰虛型冠心病功能食品的開發(fā)以及桑椹的廣泛應用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 桑椹活性成分及候選靶基因的收集

運用中藥系統(tǒng)藥理學數據庫和分析平臺（Traditinal Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform, TCMSP, http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php）及中醫(yī)藥綜合數據庫(Traditional Chinese Medicines Integrated Database,TCMID, http://www.megabionet.org/tcmid/)，以“桑椹”或“SANG SHEN”為檢索詞，檢索其全部化學成分，以口服生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18為篩選條件并結合文獻報道獲得桑椹有效活性成分信息。

1.2 活性成分對應靶基因的預測

利用 TCMSP以及 Swsiss Target Prediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）數據庫預測桑椹有效活性成分的潛在作用靶基因。其中，Swsiss Target Prediction數據庫設置種屬為“homo sapiens”，選擇probability＞0.1的靶基因，并將其在 UniProt（https://www.unitprot.org/）數據庫中進行基因名稱的標準化處理。

1.3 肝腎陰虛型冠心病相關基因的獲取

以“coronary heart disease”為關鍵詞，檢索GeneCards數據庫和在線《人類孟德爾遺傳》數據庫(Online Mendelian Inheritance in Man, OMIM)，獲得冠心病相關疾病靶基因，由于 GeneCards數據庫中基因較多，故篩選Relevance score≥20的部分，OMIM靶點則全部納入，然后去除二者重復的靶基因，建立冠心病疾病基因數據集。

參照《中藥新藥臨床研究指導原則》[14]的相關內容制定肝腎陰虛型冠心病的辨證要點：（1）胸悶隱痛、心悸盜汗；（2）心煩不寐、頭暈耳鳴；（3）腰膝酸軟；（4）舌紅少津，脈細數。利用 GeneCards數據庫以“chest tightness and pain”、“night sweats and palpitations”、“upset and insomnia”、“dizziness and tinnitus”、“sore waist and knee”、“red tongue”、“pulse counting”為檢索詞依次檢索其相應的靶基因，去重合并后與冠心病疾病基因進行整合，即為肝腎陰虛型冠心病的疾病基因。再將肝腎陰虛型冠心病的疾病基因與桑椹活性成分對應靶基因取交集，交集基因即為桑椹防治肝腎陰虛型冠心病的潛在作用靶標。

1.4 構建可視化網絡圖

剔除重復的且與疾病沒有關聯(lián)的靶基因，建立藥物-活性成分-靶點-疾病數據文件，再導入Cytoscape3.7.2構建桑椹活性成分-靶點-疾?。╟ompounds-targets-CHD network，C-T-CHD）網絡圖，以展示桑椹活性成分、靶點與肝腎陰虛型冠心病之間的相互作用關系。

1.5 桑椹-肝腎陰虛型冠心病蛋白質相互作用（protein protein interaction, PPI）網絡的構建

將桑椹與肝腎陰虛型冠心病的交集靶點輸入STRING數據庫（http://string-db.org），物種設定為“人”，獲得蛋白質相互作用關系，然后將所得數據導入 Cytoscape3.7.2軟件中，利用插件“Generate Style from Statistics”得到PPI網絡圖。再利用“Network Analyzer”插件分析網絡拓撲參數，選取度值（degree centrality, DC）、中介中心度（betweenness centrality, BC）、接近中心性（closeness centrality, CC）均大于平均值的節(jié)點作為核心作用靶蛋白。同時利用 Cytoscape 的MCODE插件，以degree cut off=2，node score cut off=0.2，K-score=2，max depth=100為篩選條件篩選網絡中重要的蛋白互作模塊。

1.6 GO功能注釋與KEGG通路富集分析

將桑椹與肝腎陰虛型冠心病交集靶點導入DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）數據庫獲得交集靶基因基因本體（gene ontology, GO）功能注釋和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)通路富集分析。根據 P值（P＜0.05），錯誤發(fā)現率（FDR＜0.05）對生物過程、細胞組分、分子功能以及代謝通路進行篩選，再進行相關分析。

1.7 分子對接

首先從 PubChem數據庫下載桑椹候選成分3D結構信息，從PDB數據庫（http://www.rcsb.org/）下載候選靶蛋白晶體結構信息（PDB ID: 4GV1、6NJS、4KZN），并導入薛定諤軟件（Schr?dinger Maestro），利用Protein Preparation Wizard模塊對靶蛋白受體進行加氫、結構優(yōu)化、能量優(yōu)化等處理，最后采用 Glide模塊進行分子對接運算及分析，對接方法為標準精度法（Standard Precise,SP），具體參數均按默認設置，再利用Pymol 2.1軟件進行可視化分析。

2 結果與分析

2.1 桑椹活性成分的篩選

從 TCMSP中收集到桑椹化學成分 91種，TCMID中 83種，根據篩選條件 OB≥30%，DL≥0.18并結合文獻報道得到活性成分55種，再根據各自的 SMILES通過 TCMSP和 Swiss Target Prediction數據庫進行相應成分靶基因的預測，刪除同疾病無關聯(lián)和沒有靶基因的成分，最終獲得有效成分14個，包括槲皮素、山奈酚、亞油酸等（具體見表1），對應候選靶基因475個，提示桑椹中黃酮類、酚酸類、生物堿類化合物可能多靶點的對機體發(fā)揮防治作用。

表1 桑椹有效活性成分表Table 1 Active ingredients of mulberry

2.2 桑椹防治肝腎陰虛型冠心病的潛在作用靶基因

通過TCMSP和Swsiss Target Prediction數據庫，獲得桑椹有效活性成分最終作用靶基因 475個，GeneCards數據庫獲得冠心病相關靶基因868個，OMIM數據庫547個，剔除重復值后獲得冠心病最終作用靶基因1 345個。將肝腎陰虛型相關基因與冠心病最終作用靶基因取交集，獲得肝腎陰虛型冠心病候選靶基因884個。再利用Venn圖將桑椹有效活性成分最終作用靶基因與肝腎陰虛型冠心病候選靶基因進行映射，最終獲得 134個交集靶基因（圖1），即為桑椹防治肝腎陰虛型冠心病的潛在作用靶基因，表明桑椹可以多靶點的防治肝腎陰虛型冠心病。

圖1 桑椹與肝腎陰虛型冠心病的交集靶基因Fig. 1 Intersection target genes of mulberry and CHD of liver and kidney yin deficiency syndrome

2.3 桑椹-活性成分-疾病-靶基因網絡圖的構建（C-T-D）

將桑椹與肝腎陰虛型冠心病134個交集靶基因信息導入 Cytoscape3.7.2進行藥物-成分-靶點-疾病（C-T-D）的網絡可視化（見圖 2）。圖 3中共有150個節(jié)點（1個藥物、1個疾病、14個活性成分、134個與疾病相關的靶基因），282條邊線，其中圓形代表化學成分，菱形代表交集靶點，三角形代表藥物與疾病，度值越高，節(jié)點越大。如圖所示，環(huán)（L-酪氨?；?L-苯丙氨?；?、槲皮素、蛻皮甾酮、7-羥基香豆素、亞油酸及山奈酚等的度值較高，提示桑椹中這幾個活性成分在防治肝腎陰虛型冠心病方面發(fā)揮著關鍵作用。

圖2 C-T-D網絡圖Fig.2 C-T-D network

2.4 蛋白質與蛋白質相互作用關系（PPI）網絡的構建

將134個交集靶蛋白導入String數據庫獲得這些靶蛋白的 PPI網絡數據，設置最低置信度為0.9，將結果以 tsv形式導出。再把數據導入Cytoscape3.7.2軟件進行相關分析及網絡可視化。如圖3所示，圖中116個靶蛋白之間具有548種相互作用關系，圓形節(jié)點代表靶蛋白，圓圈越大、顏色越亮表明靶蛋白度值越大，線條越粗、顏色越亮表明蛋白之間相互作用關系越密切。再利用“Network Network”插件分析網絡拓撲參數，選取度值（degree centrality, DC）中介中心度（betweenness centrality, BC）、接近中心性（closeness centrality, CC）均大于平均值的節(jié)點作為核心靶蛋白。網絡中各節(jié)點度值平均值為9.448，中介中心度平均值為 0.015，接近中心性平均值為0.374。網絡中DC、BC、CC均大于平均值的靶蛋白共 26個（表 2），包括 STAT3、PIK3CA、PIK3R1、SRC、VEGFA、AKT1、MAPK1、PTPN11、HSP90AA1、EGFR、MAPK3、TP53、EGF、APP、TNF、MAPK8、INS、ESR1、MAPK14、F2、RB1、MMP9、PLG、MMP2、NOS2、PTGS2，提示這些可能是桑椹防治肝腎陰虛型冠心病的關鍵作用靶蛋白。同時運用 Cytoscape3.7.2軟件中的MCODE插件對桑椹靶蛋白PPI網絡進行聚類分析（圖4），得到作用較顯著的2個模塊（見圖4、表 3）。

表2 核心作用靶蛋白信息Table 2 Information of core role target proteins

表3 桑椹PPI網絡聚類分析結果Table 3 Clustering analysis results of Mulberry PPI network

圖3 藥物-疾病相關蛋白靶點PPI網絡Fig.3 Drug-disease related protein target PPI network

圖4 基于MCODE的蛋白互作模塊Fig.4 Protein interaction module based on MCODE

2.5 GO生物過程分析

利用 David（https://david.ncifcrf.gov/）數據庫對 134個交集基因進行 GO功能注釋，根據P＜0.05，FDR＜0.05篩選出生物過程228條、細胞組分35條、分子功能51條，以圖形的形式分別展示前 15個條目（圖 5）。其中，生物過程主要涉及一氧化氮生物合成過程正調控、對缺氧的反應、細胞遷移正調控、凋亡過程負調控以及對藥物的反應等方面；細胞組分主要涉及細胞外空間、細胞表面、小窩、膜筏及細胞外泌體等方面；分子功能則主要涉及與酶、受體、血紅素、蛋白質的結合及蛋白質酪氨酸激酶活性等方面，體現出桑椹防治肝腎陰虛型冠心病多途徑的作用效果。

圖5 GO生物過程、細胞組分、分子功能分析Fig.5 GO biological process, cell component, molecular function analysis

2.6 KEGG通路富集分析

利用 DAVID數據庫對桑椹防治肝腎陰虛型冠心病的交集靶基因進行KEGG通路富集分析，共獲得 110條通路信息（P＜0.05，FDR＜0.05），結合文獻找出與肝腎陰虛型冠心病相關的通路，并展示 15個條目（見圖 6）。其中與炎癥、免疫相關通路4條：TNF信號通路、NOD樣信號通路、Toll樣信號通路、MAPK信號通路；與凋亡、代謝相關信號通路3條：PI3K/Akt信號通路、FoxO信號通路、mTOR信號通路；與血液循環(huán)相關信號通路2條：HIF-1信號通路、VEGF信號通路。結果表明桑椹可能通過作用于這些信號通路發(fā)揮防治肝腎陰虛型冠心病的作用。

圖6 KEGG通路富集條形圖Fig.6 KEGG pathway enrichment bar graph

2.7 分子對接結果驗證

利用薛定諤軟件中的 Glide模塊進行分子對接，對接結果見表4、圖7（圖中A、B顯示化合物與 AKT1的結合模式，C、D顯示化合物與STAT3的結合模式，E、F顯示化合物與VEGFA的結合模式）。

表4 桑椹關鍵活性成分與靶蛋白對接結果Table 4 Results of docking of key active components of mulberry with target protein

圖7 化合物與目標靶蛋白結合方式Fig.7 The binding mode of compound with target protein

3 討論

作為慢性非傳染性疾病，冠心病的發(fā)病機制尚不明確，目前廣泛研究的有脂肪浸潤學說、內皮損傷反應學說、炎癥學說等，與肥胖、高血脂、高血壓等危險因素密切相關[15]。桑椹作為典型的藥食兩用中藥材，現代藥理研究已指出其多種化學成分對于肥胖、血脂、血壓等心血管相關疾病存在較好的調節(jié)作用，彰顯出其在防治冠心病方面的獨特優(yōu)勢。本研究進一步結合其性味歸經，運用網絡藥理學和分子對接方法對其防治肝腎陰虛型冠心病成分與作用機制進行系統(tǒng)的驗證與探討。

成分靶點結果顯示，桑椹中環(huán)（L-酪氨酰基-L-苯丙氨?；?、槲皮素、蛻皮甾酮、7-羥基香豆素、亞油酸及山奈酚等活性成分在防治肝腎陰虛型CHD方面發(fā)揮關鍵作用。

據報道，槲皮素具有抗炎、抗氧化、降血脂、保護心血管等多重生物活性，能夠抑制炎癥細胞因子的產生，減輕冠狀動脈結扎大鼠的缺血再灌注損傷，同時亦能夠舒張血管，改善內皮細胞并抑制低密度脂蛋白氧化[16-17]。蛻皮甾酮在心血管疾病方面存在積極的改善和治療作用，能夠通過抑制細胞凋亡和氧化應激，改善心律失常及心肌梗死發(fā)揮心血管保護作用[18]。作為人體必需脂肪酸的亞油酸，主要參與機體脂肪分解、新陳代謝及免疫調節(jié)，降低血清膽固醇，進而抑制動脈血栓的形成，在預防動脈粥樣硬化和心血管疾病方面具有良好作用[19]?，F有研究指出飲食一定劑量的亞油酸與 CHD患病風險呈負相關[20]。山奈酚具有十分明顯的抗氧化功能和抗炎活性，能夠清除自由基，抑制脂質過氧化，增強抗氧化酶活性，還能夠調節(jié)促炎酶活性和炎癥相關基因表達，抑制炎癥的發(fā)生發(fā)展[21]。由此可見，桑椹中黃酮類、脂肪酸及植物甾醇等成分具有不同程度的抗炎、抗氧化、降血脂等生物功能，對冠心病危險因素如高血脂、動脈粥樣硬化等以及冠心病引起的炎癥反應、氧化應激、血管損傷產生直接或間接的防治作用。此外，本次研究還預測出環(huán)（L-酪氨?；?L-苯丙氨酰基）和7-羥基香豆素對于肝腎陰虛型CHD的防治作用較顯著，但目前關于其文獻報道較少，故對其進行進一步的分子對接驗證。

其次通過構建、分析 PPI網絡并結合文獻報道發(fā)現，桑椹防治肝腎陰虛型CHD的核心靶蛋白有STAT3、VEGFA、AKT1等。其中，STAT3是STAT蛋白家族成員，是細胞內重要的信號傳遞分子，有報道稱STAT3及其相關通路參與慢性炎癥、細胞生長、凋亡等多種生命活動，在動脈粥樣硬化及心血管相關疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的調控作用[22]。研究顯示，敲除STAT3基因小鼠主動脈粥樣硬化面積較對照組小鼠明顯減少，且當心肌缺血缺氧時，JAK通路被激活，進而磷酸化STAT3，調控凋亡基因表達，抑制心肌細胞凋亡，延緩心肌損傷[23-24]。VEGF是一種高度特異性的促血管內皮細胞生長因子，VEGFA作為其中一個亞型是血管生成和血管通透性的主要調節(jié)劑，對缺氧和營養(yǎng)匱乏情況下心血管生成作用尤為顯著，其亦被認為是一種促炎細胞因子，在動脈粥樣硬化及斑塊不穩(wěn)定性中具有一定作用[25-27]。臨床研究表明[28]，發(fā)生心肌梗死患者體內VEGFA分泌增加，進而促進血管生成和內皮細胞增殖，加快自我修復保護心臟，而低水平的 VEGFA則是主要不良心血管事件的獨立危險因素。AKT1是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬于蛋白激酶B家族成員之一，具有調控炎癥反應、細胞代謝、基因轉錄、新生血管形成等多種生物學功能，在諸如動脈粥樣硬化等心血管病理過程中發(fā)揮重要作用[29]。AKT1基因的缺失誘發(fā)血管內皮細胞功能障礙及平滑肌細胞遷移與存活能力的降低，加速動脈粥樣硬化、冠狀動脈阻塞及斑塊的脫落，進而對機體產生不可逆的影響[30]。此外，通過對桑椹靶蛋白PPI網絡聚類分析后得到2個作用模塊，其中作用較顯著的a模塊中包含有MAPK8、MAPK14、JAK2、IL6、CXCR4及PIK3CA、BCL2等與炎癥和凋亡相關的基因，進一步提示桑椹可能是通過調節(jié)炎癥、凋亡反應來發(fā)揮防治作用。

進一步的，KEGG通路富集分析結果表明，桑椹對肝腎陰虛型 CHD的防治作用涉及與炎癥免疫，凋亡代謝，血液循環(huán)相關的多條信號通路。如 TNF信號通路、NOD樣信號通路、PI3K/Akt信號通路、FoxO信號通路、HIF-1信號通路等。

據報道，炎癥在動脈粥樣硬化及冠心病病理過程中起著關鍵作用[31]。TNF作為具有多種生物效應的細胞因子，可介導細胞凋亡及各種炎癥性反應。研究表明，激活TNF信號通路不僅能夠誘導血管內皮細胞、平滑肌細胞損傷，誘導單核細胞遷移并與內皮細胞黏附以及泡沫細胞的形成，同時還能夠促進炎癥因子的釋放，影響斑塊的穩(wěn)定性，加重動脈粥樣硬化的發(fā)生[32]。NOD樣受體是一種胞漿識別受體，家族成員有NOD1、NOD2、NLRP3等，主要參與機體免疫應答和炎癥反應，病理狀態(tài)下其通路的激活能夠活化 NF-kB和MAPK信號通路，誘導細胞凋亡釋放炎性因子，加速內皮細胞損傷，導致血管炎癥及結構改變，促進動脈疾病的發(fā)生發(fā)展[33]。細胞凋亡參與冠心病病理過程，且與冠狀動脈病變嚴重程度呈正相關。PI3K/AKT信號通路作為重要的凋亡通路，在CHD、代謝紊亂等多種疾病的病理形成過程中發(fā)揮重要作用。PI3K/AKT信號通路不僅可以直接抑制其下游調節(jié)細胞凋亡及存活靶基因，減少凋亡，保護心肌細胞，而且可以磷酸化FoxO蛋白亞型，降低其轉錄活性，間接抑制細胞凋亡[34-35]。mTOR作為PI3K/AKT通路下游重要調控分子，是該通路的能量代謝控制中心，在維持心血管穩(wěn)態(tài)調節(jié)方面發(fā)揮重要作用，PI3K/AKT/ mTOR通路的激活能夠減輕細胞凋亡，緩解心肌缺血再灌注大鼠的心肌細胞損傷[36-37]。此外，HIF-1信號通路亦介導冠心病的發(fā)生發(fā)展，其成員HIF-1α作用尤為顯著。當心肌缺血缺氧時，HIF-1α可結合血管內皮生長因子（VEGF），促進新生血管形成，改善心肌血供；同時上調VEGF表達，調節(jié)血氧利用，提高心臟對缺氧的耐受[38]。

最后，本研究對小分子化合物環(huán)（L-酪氨?；?L-苯丙氨?；?、7-羥基香豆素進行分子對接驗證，結果表明二者與冠心病相關靶蛋白 AKT1、STAT3、VEGFA存在較強的結合作用，結合能均小于-6 kcal/mol。研究表明[39]，結合能越低，其構象越穩(wěn)定，結合能≤-5.0 kcal/mol則說明有較好的結合活性。由此可見，7-羥基香豆素、L-酪氨?；?L-苯丙氨酰基亦均是潛在的有活性的化合物小分子。

4 結論

本研究采用網絡藥理學及分子對接方法對桑椹防治肝腎陰虛型 CHD成分與作用機制進行系統(tǒng)的驗證與探討。結果表明桑椹對肝腎陰虛型CHD的防治作用涉及多個成分、靶點及通路，并進一步調控機體炎癥、凋亡反應以及血液循環(huán)。此外，本研究還預測出環(huán)（L-酪氨?；?L-苯丙氨?；┖?7-羥基香豆素對于肝腎陰虛型 CHD具有較顯著的防治作用，分子對接結果亦顯示二者與冠心病相關靶蛋白結合度較好，是潛在的有活性的化合物小分子，值得考慮對其進行進一步的實驗研究。