基于p38MAPK信號(hào)通路探討中醫(yī)藥防治腦缺血再灌注損傷

張奎明， 葛鸞蝶， 張林悅， 侯露陽(yáng)， 馬瑞紅， 崔應(yīng)麟

（1.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南鄭州 450002；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海 200032；3.河南省中醫(yī)院，河南鄭州 450002）

缺血性腦卒中是指因腦供血?jiǎng)用}嚴(yán)重狹窄或急性閉塞，導(dǎo)致局部腦組織缺血、缺氧性壞死，該病具有高患病率、高致殘率、高致死率的特點(diǎn)[1]。血管再通療法雖能恢復(fù)血供、消除有毒代謝物，但亦會(huì)加重神經(jīng)功能缺損，這種病理過程被稱為腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemiareperfusion injury，CIRI）。其損傷機(jī)制與炎癥、氧化應(yīng)激、線粒體損傷、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、谷氨酸興奮毒性、細(xì)胞凋亡有關(guān)[2]，這些病理改變可加劇神經(jīng)炎癥，促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞激活，釋放多種促炎介質(zhì)如細(xì)胞黏附因子及趨化因子，參與血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）通透性的改變，導(dǎo)致水腫、細(xì)胞凋亡或細(xì)胞壞死。

絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）是一類分化保守的絲氨酸、蘇氨酸絲裂原活化蛋白激酶。由MAPK激酶激酶（MAPKKK）、MAPK 激酶（MAPKK）、MAPK 等三級(jí)酶聯(lián)機(jī)制相關(guān)的細(xì)胞外信號(hào)和細(xì)胞內(nèi)生化反應(yīng)，可參與細(xì)胞的多種病理生理機(jī)制[3]。p38MAPK作為MAPK家族成員，可調(diào)控細(xì)胞核內(nèi)基因表達(dá)，在細(xì)胞炎癥、氧化應(yīng)激、凋亡等生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用。p38MAPKα 和p38MAPKβ 在神經(jīng)退行性病變動(dòng)物模型中可被激活，其中p38MAPKβ 主要存在于星形膠質(zhì)細(xì)胞，p38MAPKα 主要在小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)[4]。p38MAPK 通路與CIRI 病理改變密切相關(guān)，以下就其關(guān)系進(jìn)行探討，以期為中醫(yī)藥防治CIRI提供理論依據(jù)。

1 p38MAPK對(duì)CIRI的作用機(jī)制

1.1 促進(jìn)炎癥反應(yīng)腦缺血后，腦組織所需的氧和葡萄糖減少，三磷酸腺苷（ATP）合成不足，離子失衡，細(xì)胞膜去極化，Ca2+通道激活，興奮性谷氨酸的釋放加速Ca2+內(nèi)流，導(dǎo)致氨基酸毒性及鈣超載，誘發(fā)炎癥及細(xì)胞凋亡，形成以細(xì)胞壞死為核心的梗死區(qū)及細(xì)胞損傷為主的缺血半暗帶[5]。腦缺血初期，局部梗死區(qū)域釋放大量損傷蛋白，激活炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，趨化因子及炎性細(xì)胞介質(zhì)釋放。此外，腦組織損傷促進(jìn)炎性因子如白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）及白細(xì)胞介素6（IL-6）等的表達(dá)。以上炎性因子在缺血后釋放，改變血腦屏障通透性，外周免疫細(xì)胞因血腦屏障的通透性增加而富集于病灶，病灶組織的免疫表型暴露，與淋巴細(xì)胞發(fā)生免疫反應(yīng)，形成免疫損傷，最終導(dǎo)致腦組織壞死[6-7]。

p38MAPK 作為應(yīng)激誘導(dǎo)激酶，可調(diào)控炎癥因子的表達(dá)與釋放。研究[8]表明，CIRI模型組大鼠腦組織磷酸化p38MAPK 顯著增多，而山楂葉總黃酮可拮抗p38活化，抑制下游炎癥反應(yīng)，減少炎癥因子的釋放，從而減輕腦組織損傷。在CIRI 模型中，p38α 下游靶點(diǎn)MAPK 激活蛋白激酶2（MAPKactivated protein kinase 2，MK2）基因剔除小鼠腦組織中IL-1β、TNF-α的含量明顯低于對(duì)照組，而MK2 是p38MAPK 調(diào)控炎性細(xì)胞因子表達(dá)的關(guān)鍵下游激酶[9]。亦有研究[10]證實(shí)，CIRI 損傷可增加p38MAPK 磷酸化水平，促進(jìn)其內(nèi)源性抑制劑的降解，且與腦中IL-1β、TNF-α 和IL-6 水平的下調(diào)相一致。Srivastava A 等[11]研究脂多糖誘導(dǎo)的炎癥小鼠模型，結(jié)果顯示，相較于對(duì)照組小鼠，絲裂原活化蛋白激酶MKK3 基因缺陷組小鼠磷酸化p38MAPK 及促炎因子表達(dá)水平明顯降低、抗炎細(xì)胞因子IL-10 顯著升高，說明MKK3 是p38MAPK活化的重要上游激酶。p38MAPK 已被確定為神經(jīng)炎癥信號(hào)通路中的特異性標(biāo)記，在CIRI 炎癥免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用[12]。

1.2 抑制氧化應(yīng)激生理?xiàng)l件下，低水平活性氧簇（ROS）在細(xì)胞生命活動(dòng)中充當(dāng)信號(hào)分子；病理狀態(tài)下，內(nèi)源性抗氧化機(jī)制無(wú)法清除過量ROS，高水平ROS 通過氧化核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及細(xì)胞器，改變其結(jié)構(gòu)而損傷細(xì)胞[13]。

神經(jīng)元具有高耗氧性。缺氧可導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙、氧自由基過度生成，而大腦富含磷脂，與ROS 發(fā)生化學(xué)反應(yīng)可產(chǎn)生過氧化氫自由基，使膜脂質(zhì)過氧化而損傷細(xì)胞[14]。陳松[15]研究電針預(yù)處理心肌缺血再灌注大鼠模型發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，電針預(yù)處理組大鼠心肌組織中ROS、丙二醛、超氧化物歧化酶、p38、絲裂原活化蛋白激酶MKK3及MKK6 表達(dá)顯著降低，而經(jīng)p38MAPK 通路阻滯劑SB203580 預(yù)處理大鼠的丙二醛、超氧化物歧化酶及p38MAPK 表達(dá)無(wú)明顯差異，MKK3 及MKK6表達(dá)則降低，提示p38MAPK 信號(hào)通路參與氧化應(yīng)激過程。實(shí)驗(yàn)研究表明，黃酮類化合物通過抑制磷酸化p38MAPK（p-p38MAPK）的表達(dá)而激活Nrf2通路，促進(jìn)酶類抗氧化劑的表達(dá)[16]。青蒿琥酯對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用可能與調(diào)節(jié)ROS 的生成有關(guān)[17]。

1.3 調(diào)控細(xì)胞凋亡神經(jīng)元具有高代謝活性和能量?jī)?chǔ)存有限的特點(diǎn)，對(duì)缺血性損傷尤為敏感，因此神經(jīng)元凋亡是CIRI 的主要病理結(jié)果。磷酸化p38MAPK 促進(jìn)炎性細(xì)胞因子釋放而觸發(fā)缺血神經(jīng)元凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，加重腦組織神經(jīng)損傷[18]。促凋亡基因Bax 和抗凋亡基因Bcl-2 是調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞生命進(jìn)程的關(guān)鍵因素。Bax促進(jìn)細(xì)胞色素C或促凋亡相關(guān)因子的釋放，觸發(fā)胱天蛋白酶（cysteinyl aspartate specific proteinase， caspase）凋 亡 級(jí) 聯(lián) 反 應(yīng)，caspase-9及caspase-3被激活，可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[19]。

p38MAPK 通過激活環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白，上調(diào)Bcl-2 基因表達(dá)，而Bcl-2 與Bax 表達(dá)比值決定缺血神經(jīng)元的生命進(jìn)程，比值上升可阻止Bax活化及移位，從而維持線粒體功能，抑制細(xì)胞凋亡，而其比值降低則促使線粒體Bax 同源寡聚，誘發(fā)線粒體外膜通道的損傷，繼而激活細(xì)胞色素C 介導(dǎo)的凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)[20]。實(shí)驗(yàn)研究[21]表明，阿魏酸通過p38MAPK 通路限制Bax 轉(zhuǎn)位，從而保持線粒體的完整性，發(fā)揮腦保護(hù)作用。亦有學(xué)者研究p38MAPK 信號(hào)在游離膽紅素孵育的神經(jīng)元中的激活，結(jié)果發(fā)現(xiàn)游離膽紅素孵育可促進(jìn)MKK3/MKK6 及p38MAPK 的磷酸化，隨后啟動(dòng)核因子κB（NF-κB）的激活、轉(zhuǎn)位，導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡[22]。caspase-3 作為多種凋亡途徑的共同下游產(chǎn)物，是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白酶，p38MAPK 作用于caspase-3的上游，活化的caspase-3可裂解基因修復(fù)酶、抑制受損基因的修復(fù)，加速缺血神經(jīng)細(xì)胞的凋亡[23]。

p38MAPK 在腦缺血再灌注損傷機(jī)制中的作用見圖1。

圖1 p38MAPK在腦缺血再灌注損傷機(jī)制中的作用Figure 1 Role of p38MAPK in the mechanism of cerebral ischemia-reperfusion injury

2 基于p38MAPK信號(hào)通路探討中醫(yī)藥防治CIRI的機(jī)制

CIRI 可歸屬于中醫(yī)學(xué)的缺血性中風(fēng)范疇。其形成機(jī)制是在肝腎虧虛、氣血不足的基礎(chǔ)上，風(fēng)、火、痰、瘀、虛互相搏結(jié)，上逆犯腦，導(dǎo)致腦脈痹阻、氣機(jī)不通，因而發(fā)病。缺血性中風(fēng)具有起病急驟、變化迅速、中老年多發(fā)的特點(diǎn)?！鹅`樞·刺節(jié)真邪》云：“虛邪偏客于身半，其入深，內(nèi)居榮衛(wèi)，榮衛(wèi)稍衰，則真氣去，邪氣獨(dú)留，發(fā)為偏枯?！敝赋鲶w虛為中風(fēng)之始，在此基礎(chǔ)上，歷代醫(yī)家加以闡發(fā)。金元時(shí)期的李杲首次提出氣虛為內(nèi)風(fēng)之本；清代的王清任集粹百家，博采眾長(zhǎng)，于《醫(yī)林改錯(cuò)·半身不遂本源》進(jìn)一步闡明氣虛中風(fēng)的基礎(chǔ)，并在《醫(yī)林改錯(cuò)·論抽風(fēng)不是風(fēng)》中創(chuàng)新性地提出“因虛致瘀，氣虛血瘀”理論。津血同源，血瘀津凝，津凝痰生，痰濁血瘀可相互轉(zhuǎn)化、互為因果，終導(dǎo)致“痰瘀同病”。清代葉桂在《臨證指南醫(yī)案·中風(fēng)》中闡明氣虛津停，津停則痰濕內(nèi)生的機(jī)制，認(rèn)為氣虛中風(fēng)者多兼見痰濁、水濕。由此可見，痰、瘀、虛是缺血性中風(fēng)的主要證候因素。動(dòng)脈粥樣硬化是缺血性中風(fēng)的常見原因，臨床研究表明大多數(shù)CIRI 患者具有動(dòng)脈粥樣硬化病史，磁共振成像顯示腦血管斑塊性狹窄[24]，這與中醫(yī)氣虛血脈失充，痰瘀阻滯而氣失升降的機(jī)制相合。因此，缺血性中風(fēng)的主要病機(jī)為氣虛血瘀、痰瘀互阻，治療當(dāng)以益氣活血、通脈祛濁為主。

2.1 益氣活血法氣虛血瘀為缺血性中風(fēng)發(fā)病的基礎(chǔ)。研究表明，益氣活血法能有效擴(kuò)張腦血管，改善腦組織缺血缺氧狀態(tài)及舌象、脈象、血象指標(biāo)，促進(jìn)血管新生蛋白表達(dá)[25]。益氣通脈方是崔應(yīng)麟教授根據(jù)多年臨證經(jīng)驗(yàn)研制的院內(nèi)制劑，該方藥簡(jiǎn)力專，療效顯著，以人參、丹參、三七、水蛭、土鱉蟲、大黃組成，人參培補(bǔ)元?dú)?，氣旺脈通，血行瘀化，扶正祛邪，是為君藥；丹參活血通經(jīng)、祛瘀止痛，配伍三七化瘀止血、補(bǔ)虛生新，使瘀去新生、循經(jīng)有序，是為臣藥；水蛭活血通經(jīng)，配合土鱉蟲破血逐瘀，引藥入經(jīng)，循行周身，行中有和，破而不峻，是為佐藥；大黃苦寒，瀉下降濁，涼血逐瘀，攻守兼?zhèn)?，既可清瀉君藥之熱，亦可通血?dú)?、和五臟，推陳致新，是為佐使之藥。諸藥合用，標(biāo)本兼治，共奏益氣活血、化瘀通絡(luò)之功。

藥理學(xué)研究證實(shí)，益氣通脈方中的部分組成藥物可通過p38MAPK 信號(hào)通路抑制炎癥反應(yīng)、改善氧化應(yīng)激、控制細(xì)胞凋亡，減輕缺血半暗帶損傷[26-27]。人參天然活性成分Rg1 具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用，其對(duì)CIRI的保護(hù)機(jī)制，是基于p38MAPK抗氧化應(yīng)激相關(guān)的凋亡效應(yīng)、抑制炎癥免疫刺激的壞死效應(yīng)和調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞周期3個(gè)方面[28]。丹參可減輕氧化性損傷，改善能量代謝，從而抑制中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，減少缺血腦組織p38MAPK 的磷酸化，調(diào)控其下游原癌基因的表達(dá)，改變凋亡基因caspase-3 介導(dǎo)的凋亡，也能抑制一氧化氮合酶，下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)，保護(hù)受損血腦屏障[29-30]。三七能抑制p38MAPK上游靶點(diǎn)MAPK14蛋白活化，從而抑制p38MAPK磷酸化，減少ROS含量，增加缺氧復(fù)氧細(xì)胞內(nèi)的超氧化物歧化酶表達(dá)，降低細(xì)胞內(nèi)丙二醛含量及乳酸脫氫酶漏出，緩解細(xì)胞氧化及炎癥損傷[31-32]。水蛭提取物通過p38MAPK信號(hào)通路調(diào)節(jié)Bcl-2及Bax蛋白含量，降低腦細(xì)胞凋亡率；還能提高血清或腦組織中超氧化物歧化酶活性，降低丙二醛及一氧化氮含量，減少細(xì)胞間黏附分子1、血管細(xì)胞黏附分子1 及血小板衍生生長(zhǎng)因子等細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而減輕CIRI的腦損傷[33-34]。土鱉蟲提取液能明顯延長(zhǎng)腦缺血缺氧小鼠存活時(shí)間，增強(qiáng)缺血缺氧小鼠腦組織超氧化物歧化酶活性，提高丙二醛含量，降低一氧化氮合酶活性，減少一氧化氮生成，其腦保護(hù)機(jī)制與其通過p38MAPK 通路發(fā)揮抗氧化作用有關(guān)[35]。大黃治療CIRI 的有效成分為大黃酚，能清除CIRI 產(chǎn)生的大量ROS，有效降低一氧化氮介導(dǎo)的細(xì)胞毒性，抑制p38MAPK 的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，減少血栓形成及血小板聚集和黏附，并通過p38MAPK 通路降低Bax 及caspase-3 表達(dá)，減輕神經(jīng)細(xì)胞損傷[36-37]。

2.2 溫陽(yáng)通脈法缺血性中風(fēng)患者頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊患病率約為76.9%，可見動(dòng)脈粥樣硬化斑塊是缺血性中風(fēng)的主要危險(xiǎn)因素。穩(wěn)定或消除動(dòng)脈粥樣硬化斑塊對(duì)防治CIRI 具有重要意義[38]。頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊在中醫(yī)理論中無(wú)固定病名，有學(xué)者依據(jù)其部位命名為“人迎脈積”[39]。中醫(yī)認(rèn)為，“人迎脈積”的病機(jī)為氣虛血瘀。氣虛則血滯，滯積則為瘀，瘀血壅滯則血脈不通、氣機(jī)不利；血瘀則津停，津液失布則結(jié)聚成痰，痰為瘀之漸，瘀為痰之果，相互膠著則為痰瘀，痰瘀互阻，膠著沉附而成斑塊[40]。臨床表現(xiàn)如頭痛、頭暈、肢體麻木、思維遲鈍等可反映動(dòng)脈硬化負(fù)荷程度，預(yù)測(cè)腦血管梗死狀況。崔應(yīng)麟教授通過大量臨床實(shí)踐，發(fā)現(xiàn)痰瘀互阻型頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊最為常見，并依據(jù)《黃帝內(nèi)經(jīng)》“陽(yáng)化氣，陰成型”理論及陰陽(yáng)升降學(xué)說，將頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的發(fā)病機(jī)制總結(jié)為“陽(yáng)微氣弱，痰濕不化；濁陰阻脈，通降失常。”其以“溫下通消法”論治，通陽(yáng)祛濁以復(fù)氣機(jī)升降，化痰散瘀以復(fù)血脈通利，創(chuàng)立通脈祛濁散（主要由桂枝、生大黃、生水蛭、生山楂組成）治療頸動(dòng)脈粥樣硬化性腦缺血，療效顯著[41]。方中桂枝溫陽(yáng)化氣、平?jīng)_降逆，大黃逐瘀通經(jīng)、瀉下降濁，二藥升降互用，攻下而不傷正，共祛濁陰，通達(dá)陰陽(yáng)升降之路；水蛭力專走竄、破血通經(jīng)，山楂行氣散瘀、化濁降脂，二藥通消兼施，清化瘀血痰濁。諸藥相配，通陽(yáng)祛濁，消痰散瘀。現(xiàn)代藥理研究表明，桂枝具有擴(kuò)張血管、增加循環(huán)血容量、抗凝血、抗血小板聚集的作用，并通過p38MAPK 通路抑制成纖維細(xì)胞合成IL-6，降低血管平滑肌細(xì)胞增殖能力，從而減少斑塊炎癥損傷[42-43]。大黃能降低甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白水平，增加乳酸脫氫酶的活性進(jìn)而減少脂質(zhì)積累，改善體內(nèi)生化指標(biāo)，降低血液黏稠度，改善微循環(huán)[44-45]。水蛭中的水蛭素作用于凝血過程的不同靶點(diǎn)，可抑制血小板聚集、組織纖溶途徑，發(fā)揮抗血栓作用，并能降低p38MAPK 磷酸化水平，抑制巨噬細(xì)胞向血管內(nèi)膜下層遷移，控制脂質(zhì)條紋、纖維斑塊的形成，防治動(dòng)脈粥樣硬化[46-47]。山楂可抑制甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶及磷脂酸磷酸水解酶活性，降低血清總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇水平，促進(jìn)膽固醇代謝，其作用機(jī)制與p38MAPK 抗氧化活性及抑制炎性因子釋放有關(guān)[48-49]。

3 討論與展望

p38MAPK 通過多種途徑參與腦缺血再灌注損傷（CIRI）的病理改變，其水平在CIRI 腦組織中明顯升高，對(duì)腦組織造成二次損傷且證實(shí)其抑制劑在腦缺血急性期可保護(hù)腦組織免受傷害。但p38MAPK 在CIRI 的確切作用機(jī)制尚待深入研究。國(guó)內(nèi)外基礎(chǔ)研究多集中于p38MAPK 蛋白，對(duì)其上下游靶點(diǎn)關(guān)注較少，臨床研究尚缺乏大樣本支撐且新藥開發(fā)周期長(zhǎng)、作用機(jī)制模糊。中醫(yī)臨床注重整體觀念與理法方藥的統(tǒng)一，中藥復(fù)方具有多靶點(diǎn)、多功效、全方位的治療特點(diǎn)，基于p38MAPK 信號(hào)通路探討中醫(yī)藥干預(yù)CIRI，可為臨床防治缺血性腦卒中的實(shí)驗(yàn)研究與臨床治療提供思路。