基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接技術(shù)探討白芍治療早發(fā)性卵巢功能不全的作用機制

陸巖， 黃旭春， 曹曉靜， 王小云

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510405；2.廣東省中醫(yī)院，廣東廣州 510120）

早發(fā)性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI）又稱為卵巢早衰，是指女性在40 歲之前卵巢活動衰退的臨床綜合征，以月經(jīng)紊亂（如停經(jīng)或稀發(fā)月經(jīng)）伴有高促性腺激素和低雌激素為特征。有調(diào)查表明，我國女性的POI發(fā)病率為2.8%，呈現(xiàn)逐年升高趨勢，并有向低齡化發(fā)展的勢態(tài)[1-3]。西醫(yī)治療以激素替代療法（HRT）為主，可改善低雌激素癥狀、預(yù)防遠(yuǎn)期并發(fā)癥。盡管HRT 臨床療效肯定，但有研究指出長期使用HRT 將增加乳腺癌、中風(fēng)和心血管疾病等的發(fā)病風(fēng)險[4]。中醫(yī)藥在改善月經(jīng)異常及女性生殖能力方面取得了良好療效，且安全、副作用少[5]。其中，白芍為毛茛科植物芍藥Paeonia lactifloraPall.的干燥根，有養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、斂陰止痛、平抑肝陽之功效，主治血虛萎黃、月經(jīng)不調(diào)等病證[6]。醫(yī)家張錫純《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》中累計使用藥物頻次，白芍居于首位[7]。POI 用藥規(guī)律的研究結(jié)果顯示，白芍為常用高頻藥物[8-9]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一門在系統(tǒng)層面揭示中藥對機體調(diào)控網(wǎng)絡(luò)作用的學(xué)科，內(nèi)容涉及多向藥理學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)、網(wǎng)絡(luò)分析等多個學(xué)科領(lǐng)域，通過網(wǎng)絡(luò)在線數(shù)據(jù)庫檢索、計算機軟件等構(gòu)建“化合物-基因-疾病”相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，系統(tǒng)詮釋藥物與疾病間的關(guān)聯(lián)性，為研究傳統(tǒng)中藥與現(xiàn)代藥理學(xué)之間的相互關(guān)系搭建了橋梁[10-11]。其整體性、系統(tǒng)性和注重藥物間相互作用的特點與中醫(yī)藥學(xué)的基本特點相吻合。為臨床應(yīng)用白芍治療POI提供證據(jù)，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接技術(shù)進(jìn)一步探討白芍多成分、多靶點、多通路的協(xié)同作用治療POI的機制，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1. 1白芍活性成分的篩選以“白芍”為關(guān)鍵詞，通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺（TCMSP，https://tcmspw.com/tcmsp.php）檢索，獲取白芍的主要活性成分。因中藥多為口服制劑，故以藥代動力學(xué)參數(shù)（ADME）為依據(jù)，設(shè)置藥物口服生物利用度（OB）≥30%，藥物相似度（DL）≥0.18，篩選出活性成分。結(jié)合文獻(xiàn)研究[12-14]挖掘，最終確定白芍的主要活性成分。

1.2 白芍活性成分作用靶標(biāo)的篩選應(yīng)用TCMSP數(shù)據(jù)庫中的“靶點預(yù)測”功能，預(yù)測白芍活性成分的作用靶標(biāo)。再利用perl 軟件（http://www.perl.org/）對收集的化學(xué)成分及作用靶標(biāo)添加基因名。

1.3 POI疾病靶標(biāo)的獲取與收集GeneCards數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）是一個分析人類基因數(shù)據(jù)的綜合數(shù)據(jù)庫；在線“人類孟德爾遺傳”數(shù)據(jù)庫（OMIM，Online Mendelian Inheritance in Man，https://omim.org/）記錄了所有已知疾病的遺傳成分，并可以預(yù)測它們與人類基因組中相關(guān)基因的關(guān)系。將“Premature Ovarian Insufficiency”輸入GeneCards 與OMIM 數(shù)據(jù)庫中檢索獲取與POI 相關(guān)的靶標(biāo)，并去除重復(fù)部分。然后運用R軟件（https://www.rproject.org/）將與白芍有效成分相關(guān)的靶標(biāo)和疾病靶標(biāo)取交集，獲得白芍活性成分治療POI的靶標(biāo)，并繪制韋恩（Venn）圖。

1.4 藥物-成分-靶標(biāo)-疾病網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建將白芍活性成分所對應(yīng)的靶標(biāo)和POI 相關(guān)的靶標(biāo)取交集，獲得的靶標(biāo)即為白芍治療POI 的關(guān)鍵靶標(biāo)。使用Cytoscape 3.7.2 軟件（http://www.cytoscape.org）構(gòu)建“藥物-成分-靶標(biāo)-疾病”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)中的“節(jié)點”代表白芍藥物、有效成分與關(guān)鍵靶標(biāo)；“邊”代表藥物-成分、成分-靶標(biāo)、靶標(biāo)-疾病之間的連接。整個網(wǎng)絡(luò)展示了藥物-成分-靶標(biāo)-疾病之間的聯(lián)系，通過這一網(wǎng)絡(luò)可以深入分析白芍治療POI 的作用機制。以網(wǎng)絡(luò)節(jié)點度（degree）值和中介中心度（betweenness centrality）為篩選條件，挖掘網(wǎng)絡(luò)核心節(jié)點。

1. 5靶標(biāo)蛋白相互作用（PPI）的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建使用STRING 數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org）預(yù)測蛋白質(zhì)之間的相互作用。選擇“Multiple Proteins”功能，選擇“物種”為人類（Homo Sapiens），將白芍治療POI 的關(guān)鍵靶標(biāo)導(dǎo)入數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，即可構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)。STRING 數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)還可以對預(yù)測結(jié)果進(jìn)行評分，分值越高，表示PPI 結(jié)果的置信度越高。本研究設(shè)定評分分值＞0.40，獲得節(jié)點度值等反映靶點之間相互關(guān)系的信息。

1.6 關(guān)鍵靶標(biāo)的生物功能注釋與通路分析先用perl軟件將白芍治療POI的關(guān)鍵靶點名稱轉(zhuǎn)換成entrez ID，然后進(jìn)入Bioconductor（http://www.bioconductor.org/）找到R 軟件。Bioconductor 是目前最常用的高通量基因組數(shù)據(jù)分析工具之一，它以R 軟件為平臺提供了19個物種（含人類）的基因本體論（GO）注釋信息。ClusterProfiler是基因數(shù)據(jù)分析的R語言工具之一，結(jié)合entrez ID，得到GO 注釋信息和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集信息。運用上述工具，以P＜0.05為條件，進(jìn)行信號通路富集分析及結(jié)果可視化。

1.7 分子對接根據(jù)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建的拓?fù)浣Y(jié)果，用分子對接模擬研究配體在復(fù)雜分子網(wǎng)絡(luò)中的潛在相互作用。從RCSB數(shù)據(jù)平臺（PDB，www.rcsb.org）檢索PPI 網(wǎng)絡(luò)中核心靶標(biāo)的3D 結(jié)構(gòu)PDB 格式文件。再從ZINC 數(shù)據(jù)庫（http://zinc.docking.org）下載網(wǎng)絡(luò)圖中度值居前列的藥效分子的Mol2 格式文件。采用Autodock 進(jìn)行核心成分與核心靶標(biāo)間的分子對接驗證。利用結(jié)合能來評估分子與靶點的結(jié)合能力，結(jié)合能＜0 表明能自發(fā)結(jié)合，結(jié)合能≤-5 kcal/mol表明結(jié)合良好。

2 結(jié)果

2.1 白芍活性化合物的篩選分析通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索到白芍有效成分85 個，以O(shè)B ≥30%和DL ≥0.18為條件進(jìn)一步篩選出13個有效成分，主要成分為芍藥苷、芍藥苷元酮、樺木酸、β-谷甾醇、谷甾醇、山柰酚、兒茶素、苯甲酰芍藥苷等，結(jié)果見表1。

表1 白芍主要活性成分及其口服生物利用度（OB）和藥物相似度（DL）值Table 1 Active components of Radix Paeoniae Alba and their OB and DL values

2.2 白芍成分治療POI的潛在作用靶點預(yù)測通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫預(yù)測白芍的主要活性成分作用靶標(biāo)，除重后共獲得62 個靶標(biāo)。Gene Cards 數(shù)據(jù)庫收集疾病靶標(biāo)2 718 個，OMIM 數(shù)據(jù)庫收集疾病靶標(biāo)166個，整合數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果并去除重復(fù)基因后共獲取POI 相關(guān)基因靶標(biāo)2 809 個。運行R 語言“VennDiagram”程序包將白芍有效成分相關(guān)的靶標(biāo)與POI相關(guān)靶標(biāo)取交集，獲得白芍活性成分治療POI的靶標(biāo)，并繪制韋恩（Venn）圖。結(jié)果顯示白芍對POI 可能起到作用的靶標(biāo)共35 個，表明白芍是通過多個靶點發(fā)揮治療POI作用的。

2. 3白芍-成分-靶標(biāo)-POI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建應(yīng)用Cytoscape 3.7.2 軟件構(gòu)建“藥物-有效成分-靶標(biāo)-疾病”相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖，見圖1。該網(wǎng)絡(luò)由44個節(jié)點組成，包括7 個成分節(jié)點、35 個靶標(biāo)基因節(jié)點、1 個藥物節(jié)點及1 個疾病節(jié)點。綠色代表疾病，紅色代表藥物，黃色節(jié)點代表白芍的主要有效成分，藍(lán)色節(jié)點代表作用靶標(biāo)。

圖1 白芍治療POI的藥物-成分-靶標(biāo)-疾病網(wǎng)絡(luò)Figure 1 Drug-component-target-disease network of Radix Paeoniae Alba for treatment of POI

網(wǎng)絡(luò)節(jié)點度值和接近中心度反映了網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點核心度的高低，度值越高，表明該節(jié)點越重要。將度值和中介中心度值按大小排序篩選核心成分和靶點，結(jié)果顯示，kaempferol（山柰酚）、beta-sitosterol（β-谷甾醇）、（+）-catechin（兒茶素）等白芍有效成分以及PGR（孕激素受體）、PTGS1（前列腺素G/H 合酶和環(huán)氧合酶）、NR3C2（鹽皮質(zhì)激素受體基因）等作用靶標(biāo)是網(wǎng)絡(luò)的核心節(jié)點，提示這些節(jié)點是白芍治療POI 的關(guān)鍵有效成分或靶標(biāo)。具體結(jié)果見表2。

表2 白芍-成分-靶標(biāo)-POI網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵節(jié)點Table 2 Key nodes in Radix Paeoniae Albacomponent-target-POI network

2. 4白芍治療POI的關(guān)鍵靶標(biāo)PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果進(jìn)入STRING數(shù)據(jù)庫，上傳白芍活性成分治療POI 的靶標(biāo)，將置信度評分設(shè)定為分值＞0.40，去除游離于網(wǎng)絡(luò)之外的蛋白，得到白芍活性成分對應(yīng)的靶標(biāo)PPI 網(wǎng)絡(luò)，見圖2。該網(wǎng)絡(luò)共包含節(jié)點35 個，邊153 條，平均度值為8.74。邊數(shù)越多表示該節(jié)點對應(yīng)的靶標(biāo)在網(wǎng)絡(luò)中的作用越重要。運用R 語言抽取網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶標(biāo)的信息條形圖，見圖3。IL-6（白細(xì)胞介素6）、CASP3（半胱氨酸蛋白酶3）、MAPK8（絲裂原激活蛋白激酶8）、RELA（核轉(zhuǎn)錄因子Rel A）、ESR1（雌激素受體1）是關(guān)聯(lián)度值最大的前5個節(jié)點，這5個節(jié)點可能是白芍治療POI 的重要靶標(biāo)。其中IL-6 關(guān)聯(lián)度最大，有研究表明，卵泡液內(nèi)有較高水平的IL-6，其與雌二醇（E2）產(chǎn)生及卵母細(xì)胞成熟度有一定關(guān)系[15]。

圖2 白芍治療早發(fā)性卵巢功能不全（POI）關(guān)鍵靶標(biāo)的PPI網(wǎng)絡(luò)Figure 2 PPI of core target genes of Radix Paeoniae Alba for treatment of POI

圖3 白芍治療早發(fā)性卵巢功能不全（POI）的PPI核心靶標(biāo)基因Figure 3 Core target genes in PPI of Radix Paeoniae Alba for treatment of POI

2.5 關(guān)鍵靶標(biāo)生物功能及通路分析將白芍可能對POI發(fā)揮作用的靶標(biāo)導(dǎo)入軟件R×64 3.6.2，進(jìn)行GO功能富集分析與KEGG通路富集分析。GO功能富集共獲得59 條目，根據(jù)P值大小進(jìn)行排序，選取前20 個條目展示，見圖4。結(jié)果顯示白芍治療POI 的關(guān)鍵靶標(biāo)主要富集在核受體活性（nuclear receptor activity）、轉(zhuǎn)錄因子活性（transcription factor activity），直接配體調(diào)控特異性DNA 結(jié)合（direct ligand regulated sequence-specific DNA binding），類固醇激素受體活性（steroid hormone receptor activity）等。

圖4 白芍治療早發(fā)性卵巢功能不全（POI）靶標(biāo)的GO功能富集Figure 4 GO enrichment in POI targets treated by Radix Paeoniae Alba

KEGG 通路富集結(jié)果共得到85 條通路，24 條信號通路，主要包含免疫炎癥相關(guān)通路、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、代謝相關(guān)通路、癌癥相關(guān)通路、細(xì)胞發(fā)展過程相關(guān)通路、傳染病相關(guān)通路等，見圖5。KEGG 通路富集分析結(jié)果顯示，晚期糖基化終末產(chǎn)物-糖基化終末產(chǎn)物受體信號通路（AGERAGE signaling pathway in diabetic complications）、TNF 信號通路（TNF signaling pathway）是最為顯著的信號通路，可能是白芍治療POI 重要的信號通路。其他起作用的信號通路還包括IL-17信號通路（IL-17 signaling pathway）等。表明白芍的有效成分是通過調(diào)控多種生物學(xué)途徑發(fā)揮治療POI作用的。

圖5 白芍治療POI關(guān)鍵靶標(biāo)KEGG通路富集分析Figure 5 KEGG pathway Enrichment analysis of key targets in POI treated by Radix Paeoniae Alba

2.6 分子對接選擇網(wǎng)絡(luò)核心成分山柰酚與PGR進(jìn)行分子對接。通過Pymol 軟件進(jìn)行可視化，從圖6-A1～A2可以清楚地看出，山柰酚與PGR 不會形成氫鍵。山柰酚與PGR 的結(jié)合能為-6.41。在圖6-B1～B2中，山柰酚與PTGS1 的分子對接結(jié)果表明，山柰酚與ATP 競爭PTGS1 的結(jié)合位點，并通過與相應(yīng)骨架的氨基和羰基形成氫鍵而緊密結(jié)合殘基（Asn-382，His-388，Ala-199）。山柰酚與PTGS1 的結(jié)合能為-7.64。在圖6-C1～C2中，山柰酚與NR3C2 的分子對接結(jié)果表明，兩者通過與相應(yīng)殘基的主鏈氨基和羰基形成氫鍵而與NR3C2 緊密 結(jié) 合（Leu-938，Ser-810， ARG-817，Asn-770）。山柰酚與NR3C2 的結(jié)合能為-7.46。這些結(jié)果證明，山柰酚和PTGS1、NR3C2對接結(jié)果良好。

圖6 山柰酚與PGR、PTGS1、NR3C2的分子對接結(jié)果Figure 6 Molecular docking results of kaempferol and PGR，PTGS1 and NR3C2

3 討論

中醫(yī)古代文獻(xiàn)中沒有早發(fā)性卵巢功能不全（POI）的病名，根據(jù)其主要臨床癥狀，可歸屬于“血枯”“經(jīng)閉”“月經(jīng)過少”“經(jīng)水早斷”等范疇。POI患者多為先天不足，加之后天失養(yǎng)，久病損耗或金刃損傷等引起精血耗竭，沖任虧損，機體常年處于“陰血不足”的狀態(tài)，故肝體失養(yǎng)而疏泄失常，肝氣郁結(jié)。然而“女子以血為用”，陰陽失衡，氣血不調(diào)，往往最先出現(xiàn)卵巢功能減退。白芍具有養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、斂陰柔肝的功效。既往藥理研究顯示，白芍具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、鎮(zhèn)靜、抗抑郁、抗驚厥、解熱、解痙、護肝、擴張血管、耐缺氧等作用[16-17]。有研究報道，白芍及其配伍能調(diào)整血清雌二醇（E2）、孕酮（P）、催乳素（PRL）、促卵泡生成激素（FSH）的紊亂[18]，以白芍為君藥的養(yǎng)陰舒肝顆?？梢跃徑饽Ｐ托∈蟮母斡魻顟B(tài)[19]，可以改善卵巢的功能[20]。

本研究運用TCMSP 數(shù)據(jù)庫篩選出13 個白芍潛在有效成分，根據(jù)拓?fù)涑龅年P(guān)鍵節(jié)點，山柰酚、β-谷甾醇及兒茶素是白芍作用于POI的主要3個成分。其中：β-谷甾醇為萜類，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等作用[21]；山柰酚為黃酮類，具有抗炎、抗氧化、護肝等作用[22]；兒茶素為酚類，具有抗炎、抗癌等作用[23]。高靜[24]發(fā)現(xiàn)POI 患者外周血輔助性T1 細(xì)胞比例明顯增加，宗國霞等[25]也發(fā)現(xiàn)POI患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群CD3+顯著升高；而慕靜靜等[26]研究發(fā)現(xiàn)，山柰酚能顯著抑制小鼠T淋巴細(xì)胞體外活化和增殖。曾莉萍等[27]發(fā)現(xiàn)，β-谷甾醇能明顯促進(jìn)卵巢顆粒細(xì)胞分泌E2，而POI患者臨床表現(xiàn)為雌激素水平波動性下降。研究發(fā)現(xiàn)，卵母細(xì)胞減少或成熟障礙會降低卵巢的儲備功能，加快卵巢早衰的發(fā)展[28]，而表兒茶素是兒茶素的一種，可提高小鼠卵母細(xì)胞的數(shù)量及其發(fā)育潛能[29]。故本研究預(yù)測白芍通過山柰酚、β-谷甾醇、兒茶素等有效成分改善POI。

從拓?fù)涑龅年P(guān)鍵節(jié)點來看，PGR、PTGS1、NR3C2 等既是POI 靶標(biāo)又是白芍活性成分預(yù)測靶標(biāo)。PGR 屬于甾體激素核受體家族，可結(jié)合孕激素發(fā)揮生理功能，在動物的發(fā)育、生殖中起著十分重要的作用[30]；且有研究表明PGR 調(diào)節(jié)因子在卵巢組織內(nèi)相互協(xié)調(diào)作用以指導(dǎo)排卵[31]。PTGS1編碼的蛋白是前列腺素H2轉(zhuǎn)化為前列腺素D2的關(guān)鍵酶[32]，這種酶廣泛分布于子宮、卵巢、輸卵管等部位，參與生殖系統(tǒng)的調(diào)控[33]。NR3C2產(chǎn)物鹽皮質(zhì)激素受體主要參與緊張焦慮情緒調(diào)控，最新研究提示鹽皮質(zhì)激素可能在牛卵巢中發(fā)揮內(nèi)分泌、旁分泌、自分泌的作用[34]。

KEGG 通路富集分析結(jié)果表明，AGE-RAGE信號通路、TNF 信號通路、IL-17信號通路等是白芍治療POI 的重要信號通路。梁嘉麗[35]研究發(fā)現(xiàn)，顆粒細(xì)胞自噬參與了POI的發(fā)病過程。包繼明[36]發(fā)現(xiàn)，AGE-RAGE 可以激活磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）通路，而PI3K/Akt 信號通路是參與顆粒細(xì)胞自噬的信號通路[37]。李寧[38]研究白藜蘆醇對POI大鼠的治療效果也發(fā)現(xiàn)，通過激活PI3K/Akt/mTOR信號通路可以抑制顆粒細(xì)胞凋亡來達(dá)到治療POI的目的。TNF信號通路是炎性反應(yīng)的重要通路，TNF-α 是重要的炎性因子，能誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞的浸潤，引起炎癥反應(yīng)。近年來的研究表明，炎癥性衰老在POI的發(fā)病機理中起著重要作用[39]。俞曉敏等[40]研究發(fā)現(xiàn)，羅格列酮可減輕腹腔注射脂多糖誘導(dǎo)大鼠慢性低度炎癥反應(yīng)以改善卵巢功能。此外，TNF-α 蛋白表達(dá)增加能明顯促進(jìn)卵巢生殖干細(xì)胞的增殖[41]，而卵巢干細(xì)胞巢的衰老和退化被認(rèn)為是導(dǎo)致卵巢生殖功能衰退的主要因素[42-43]。IL-17F 是IL-17 家族的一種原型細(xì)胞因子，它可以誘導(dǎo)不同的組織和細(xì)胞產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子、趨化因子和金屬蛋白酶。研究表明，IL-17F 參與潰瘍性結(jié)腸炎的免疫調(diào)節(jié)[44]，IL-17在固有免疫水平和適應(yīng)性免疫水平均具有重要的抗感染作用[45]。

綜上所述，白芍可能通過有效成分山柰酚、β-谷甾醇、兒茶素介導(dǎo)AGE-RAGE 信號通路、TNF 信號通路、IL-17 信號通路等發(fā)揮抗炎性反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫、增加卵母細(xì)胞數(shù)量及抑制顆粒細(xì)胞凋亡等藥理作用來治療POI。本研究針對白芍單味中藥僅展開預(yù)測研究存在一定局限性，后續(xù)將進(jìn)一步體內(nèi)體外驗證白芍治療POI多成分、多靶點的機制特點。