基于藥效篩選與正交試驗(yàn)優(yōu)化花川保列顆粒 提取工藝研究

唐靖雯 潘梅 彭政忠 盧禮平 張麗艷

【摘 要】 目的：對(duì)花川保列顆粒提取工藝進(jìn)行篩選，確定最佳提取工藝。方法：在藥效實(shí)驗(yàn)的工藝初篩結(jié)果基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法，以制劑中槲皮素總量為考察指標(biāo)，考察提取溶劑濃度、溶劑用量、提取時(shí)間、提取次數(shù)4個(gè)因素，優(yōu)選花川保列顆粒的最佳提取工藝。結(jié)果：花川保列顆粒60%乙醇提取物的抗菌、抗炎活性優(yōu)于水提醇沉物;花川保列顆粒的最佳提取工藝為10倍量60%乙醇回流提取3次，每次1.5 h。結(jié)論：本研究建立的提取工藝簡(jiǎn)單、穩(wěn)定可行，對(duì)花川保列顆粒的工業(yè)化生產(chǎn)具有一定的參考價(jià)值。

【關(guān)鍵詞】 花川保列顆粒;藥效實(shí)驗(yàn);正交試驗(yàn);槲皮素;醇提工藝

【中圖分類號(hào)】R284.2?? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A??? 【文章編號(hào)】1007-8517（2022）06-0052-06

Optimization of Extraction Process of Huachuan Baolie Granules Based on ?Pharmacodynamic Screening and Orthogonal Experiment

TANG Jingwen1 PAN Mei1 PENG Zhengzhong1 LU Liping1 ZHANG Liyan2*

1.Guizhou Warmen Pharmaceutical Co.， Ltd.， Guiyang 550018， China;

2.School of Pharmacy，Guizhou University of Traditional Chinese Medicine， Guiyang 550025， China

Abstract：Objective The extraction technology of Huachuan Baolie granules was screened to determine the best extraction technology. Methods The total amount of quercetin in the preparation was taken as the comprehensive evaluation indexes， and to investigate the effects of four factors， such as solvent concentration， solvent dosage， extraction time and extraction times by orthogonal design based on the preliminary screening results of pharmacodynamic experiments. Results The antibacterial and anti-inflammatory activities of 60% ethanol extract of Huachuan Baolei granules were better than that of water-extracted alcohol extract. Conclusions The extraction technology established is simple， stable and feasible， which has certain reference value for the industrial production of Huachuan Baolie Granules.

Key words：Huachuan Baolie Granules; Pharmacodynamic Experiments; Orthogonal Test; Quercetin; Alcohol Extraction Technology

花川保列顆粒是由貴州威門藥業(yè)股份有限公司研發(fā)的一種治療慢性前列腺炎的純中藥復(fù)方制劑，屬于國(guó)家6類中藥新藥。本品利用苗藥“頭花蓼”的優(yōu)良抗菌抗炎活性特點(diǎn)，結(jié)合中醫(yī)藥理論及名老中醫(yī)多年的臨床治療經(jīng)驗(yàn)，以頭花蓼為君藥，配以川芎、粉萆薢、白芷、牛膝等4味藥材組方而成，具有清熱利濕、活血止痛的功效，用于濕熱下注、氣血瘀滯所致的淋癥。研究根據(jù)本品處方的功能主治，結(jié)合處方中藥物的理化性質(zhì)，考察水提醇沉物、醇提物的抗菌、抗炎作用優(yōu)勢(shì)，確定本品采用醇提制備工藝;并以頭花蓼中槲皮素總量為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)正交試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)選花川保列顆粒的最佳醇提工藝，為該制劑批量生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)，為臨床上治療慢性前列腺炎提供一種療效確切的新藥制劑奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent-1100型高效液相色譜儀（Agilent科技有限公司）;AG135型十萬(wàn)分之一電子天平（梅特勒托利多科技有限公司）;CH-250型超聲波清洗器（北京創(chuàng)新德超聲電子研究所）;101-5型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海路達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）;SENCOR系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申生科技有限公司）;予華牌循環(huán)水式真空泵（鞏義市英峪予華儀器廠）。

1.2 藥材 頭花蓼藥材采自貴州威門藥業(yè)股份有限公司GAP種植基地，川芎、粉萆薢、白芷、懷牛膝均購(gòu)于貴州省藥材公司，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)魏升華教授鑒定：頭花蓼為蓼科植物頭花蓼Polygonum capitatum Buch.-Ham.ex D.Don的干燥全草或地上部分;川芎為傘形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根莖的飲片;粉萆薢為薯蕷科植物粉背薯蕷Dioscorea hypoglauca Palibin的干燥根莖的飲片;白芷本品為傘形科植物白芷Angelica dahurica（Fisch. ex Hoffm.）Benth. et Hook.f.或杭白芷Angelica dahurica（Fisch. ex Hoffm.）Benth. et Hook. f. var. formosana （Boiss.） Shan et Yuan的干燥根的飲片;懷牛膝為莧科植物牛膝Achyranthes bidentata B1. 的干燥根的飲片。頭花蓼藥材符合地方標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，其他藥材符合中國(guó)藥典規(guī)定。86C2FDBD-112A-400C-9257-4AC0B06A0F5A

1.3 藥品與試劑 槲皮素對(duì)照品（批號(hào)：10081-9905，純度：96.5%，中國(guó)食品藥品檢定研究院）;致炎劑（巴豆油系棕色油狀液體，藥用級(jí)，批號(hào)：000309）;甲醇、乙腈為色譜純;水為娃哈哈純凈水;其余試劑均為分析純。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 CV級(jí)KM小鼠，雄性，體質(zhì)量35～40 g，由四川抗菌素工業(yè)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證：川實(shí)動(dòng)管質(zhì)第99-30號(hào)。

2 方法與結(jié)果

2.1 基于藥效實(shí)驗(yàn)的工藝初篩

2.1.1 實(shí)驗(yàn)藥物制備

2.1.1.1 水提醇沉物的制備 按處方比例稱取3日量的藥材，加10倍量水提取兩次，每次2 h，濾過(guò)，合并濾液，濾液濃縮至相對(duì)密度為1.1（60 ℃）的清膏，加入95%乙醇，使藥液含醇量達(dá)70%，靜置過(guò)夜，濾過(guò)，濾液回收乙醇，減壓干燥，得浸膏粉。

2.1.1.2 醇提物的制備 按處方比例稱取3日量的藥材，加10倍70%乙醇提取兩次，每次2 h，提取液回收乙醇，減壓干燥，得浸膏粉。

2.1.2 抗菌、抗炎作用的評(píng)價(jià)方法

2.1.2.1 抗菌作用 采用瓊脂二倍稀釋法測(cè)定花川保列顆粒浸膏粉對(duì)受試菌株的最低抑菌濃度（MIC）。按原生藥含量精密稱取花川保列顆粒水提醇沉物、醇提物，加至40 mL融化的瓊脂培養(yǎng)基（融化至50 ℃），混勻，從中吸出20 mL至滅菌平皿內(nèi)，余下的20 mL瓊脂中再添加入20 mL無(wú)藥瓊脂混勻，再?gòu)闹形?0 mL至下一個(gè)平皿內(nèi)，以此類推，制備含藥終濃度為1000，500，250，125……0.03 mg原生藥/mL的系列平皿，冷凝后再分別用多點(diǎn)接種儀（DenleyA400）于各平皿表面接種細(xì)菌，菌液終濃度為105 CFU/mL。置入37 ℃中培養(yǎng)18～24 h，觀察結(jié)果，以無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)平皿內(nèi)藥物的最低濃度為該菌的最低抑菌濃度（MIC）。鏈球菌及溶血性鏈球菌置于35 ℃培養(yǎng)20 h觀察結(jié)果，淋球菌置于5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)24～48 h觀察結(jié)果。

2.1.2.2 抗炎作用 ①劑量設(shè)計(jì)：根據(jù)花川保列顆粒水提醇沉物、醇提物原生藥含量初步擬定的人臨床劑量為1.125 g生藥/kg;此劑量按動(dòng)物間體表面積推算至小鼠劑量為：水提醇沉提取物為2.17 g/kg，醇提提取物為1.58 g/kg。以此劑量粗略設(shè)定為中劑量，故水提醇沉物高中低三劑量組分別為4.34、2.17、1.08 g/kg;醇提物高中低三劑量組分別為3.16、1.58、0.79 g/kg。兩種工藝提取物高中低三劑量所含生藥量對(duì)應(yīng)相等。氫化可的松劑量20 mg/kg。②樣品配置：稱取一定量樣品后，用0.5%CMC液研磨成混懸液（高劑量組），然后倍半稀釋至各劑量組所需濃度。③將90只小鼠隨機(jī)分9組，10只/組，將配制好的藥液按0.5 mL/20 g體重口服給藥，給藥后60 min，取1%巴豆油30 μL涂沫于小鼠右耳內(nèi)側(cè)，4 h后將小鼠處死，取二耳，用Φ8 mm打孔器沖下二耳片，精確稱重。左右二耳片重量之差為腫脹度（mg），再根據(jù)以下公式計(jì)算腫脹百分率（%）和腫脹抑制率（%）。

腫脹百分率（%）=腫脹度左耳耳片重量×100%

腫脹抑制率（%）=模型組平均腫脹度-用藥組平均腫脹度模型組平均腫脹度×100%

2.1.3 結(jié)果

2.1.3.1 對(duì)體外抗菌活性的影響 由表1所示，醇提、水提醇沉制備的花川保列顆粒均對(duì)臨床分離金葡菌、鏈球菌、溶血性鏈球菌、大腸埃希菌、陰溝桿菌、銅綠假單孢菌、變形桿菌、痢疾桿菌呈現(xiàn)有抗菌作用，其MIC范圍分別在62.5～500 mg原生藥/mL、62.5～500 mg原生藥/mL;醇提、水提醇沉制備的花川保列顆粒浸膏粉對(duì)白色念珠菌的抗菌活性佳，MIC值分別是0.25～125 mg原生藥/mL、15.6～1000 mg原生藥/mL;醇提、水提醇沉制備的花川保列顆粒浸膏粉對(duì)所試淋球菌呈現(xiàn)較強(qiáng)抗菌作用，MIC值分別為7.8～250 mg原生藥/mL、31.25～1000 mg原生藥/mL。研究表明，醇提工藝略優(yōu)于水提醇沉工藝。

2.1.3.2 對(duì)小鼠耳腫脹模型抗炎作用的影響 由表2所示，本次抗炎活性比較試驗(yàn)中，兩種工藝路線所得的花川保列顆粒浸膏粉均顯示一定的抗炎活性，醇提物抗炎活性的量效關(guān)系較水提醇沉物明顯，腫脹抑制率達(dá)到41.3%。

基于上述體外抗菌試驗(yàn)及小鼠耳腫脹模型抗炎作用結(jié)果，花川保列顆粒的醇提物體外抗菌作用及抗炎作用均優(yōu)于水提醇沉物，故本研究擬采用醇提工藝，以頭花蓼中槲皮素總量為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)一步通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)選花川保列顆粒的最佳醇提工藝。

2.2 槲皮素的含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent TC-C18（2）（250 mm×4.6 mm，5μm）;流動(dòng)相：甲醇-0.4%磷酸溶液（54∶[KG-*3/5]46，V/V）;流速：1 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)：370 nm;柱溫：25 ℃;進(jìn)樣量：10 μL;理論板數(shù)按槲皮素峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取經(jīng)五氧化二磷干燥過(guò)的槲皮素對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含25 μg的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取醇提浸膏粉約0.5 g，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇-50%鹽酸溶液（4∶[KG-*3/5]1）混合液25 mL，密塞，稱定重量，回流1 h，放冷，再稱定重量，用提取液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 陰性樣品的制備 精密稱取缺頭花蓼藥材的浸膏粉，按上述供試品溶液的制備方法制備，即得。

2.2.5 專屬性試驗(yàn) 分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液、缺頭花蓼的陰性樣品溶液各10 μL，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果如圖1所示。陰性樣品色譜圖中，在與槲皮素對(duì)照品相同保留時(shí)間處未見色譜峰，表明陰性無(wú)干擾，方法專屬性良好。86C2FDBD-112A-400C-9257-4AC0B06A0F5A

2.2.6 線性關(guān)系考察 按“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液的制備方法，加甲醇制成40.19 μg/mL的溶液，分別精密吸取2、4、6、8、10、12 μL注入高效液相色譜儀，以進(jìn)樣量（x，μg）為橫坐標(biāo)，以峰面積（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：y=4016.565x+0.43415，相關(guān)系數(shù)r=0.9998，槲皮素在0.0804～0.4823 μg范圍內(nèi)線性良好。

2.2.7 精密度試驗(yàn) 按“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液的制備方法，加甲醇制成0.2512 mg/mL溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)定其峰面積，結(jié)果RSD為1.44%，表明儀器精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“2.2.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，并按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別在0、1、3、6、9、12、18、24 h注入高效液相色譜儀，結(jié)果供試品溶液中槲皮素峰面積在24 h內(nèi)無(wú)明顯變化，RSD為1.61%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.2.3”項(xiàng)下制備供試品溶液5份，并按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定槲皮素含量，結(jié)果RSD為1.50%，表明方法重復(fù)性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的同一醇提浸膏粉（含量1.75 mg/g）約0.25 g，分別加入槲皮素對(duì)照品溶液（0.04235 mg/mL）10 mL，按上述“2.2.3”項(xiàng)下供試品溶液制備方法及“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果見表3。

2.3 醇提工藝評(píng)價(jià)指標(biāo) 按處方比例分別稱取各藥材適量，按對(duì)應(yīng)的工藝提取后，合并所有提取液，濃縮、干燥，得浸膏粉。以槲皮素總量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)醇提工藝進(jìn)行評(píng)分。

浸膏收率（%）=（干膏粉重/藥材總重量）×100%

槲皮素總量（mg）=藥材總量×浸膏收率×槲皮素含量

2.4 正交試驗(yàn)優(yōu)選提取工藝

2.4.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)藥效實(shí)驗(yàn)的工藝篩選，選擇以乙醇為溶劑進(jìn)行提取。以槲皮素總量為考察指標(biāo)，以乙醇濃度（A）、乙醇用量（B）、提取時(shí)間（C）、提取次數(shù)（D）為試驗(yàn)因素，每個(gè)因素3個(gè)水平，用正交表L9（34）進(jìn)行優(yōu)選，優(yōu)選醇提工藝條件。正交試驗(yàn)因素水平見表4。

2.4.2 正交試驗(yàn)及結(jié)果 根據(jù)“2.4.1”項(xiàng)下設(shè)計(jì)方案做正交試驗(yàn)，按表4的因素水平和表5試驗(yàn)條件分別經(jīng)回流提取、濾過(guò)、濃縮、干燥等步驟，每一試驗(yàn)重復(fù)3次，共得27份浸膏粉，按“2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定浸膏收率，按上述槲皮素含量測(cè)定方法測(cè)定槲皮素總量。正交試驗(yàn)結(jié)果見表5，方差分析見表6。

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，以槲皮素含量及浸膏收率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，A、B、C、D四因素均無(wú)顯著性影響，直觀分析以A1B3C3D3組合較好，結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)，擬選A1B3C2D3。通過(guò)對(duì)不同提取時(shí)間條件進(jìn)行了比較研究，結(jié)果表明，兩者提取物中槲皮素總量分別為：6.36 mg和7.06 mg，由此結(jié)果分析，采用A1B3C2D3工藝提取的浸膏槲皮素總量高于A1B3C3D3工藝提取的浸膏。因此，花川保列顆粒最佳提取工藝條件為A1B3C2D3，即加10倍量60%乙醇回流1.5 h，共提取3次。

2.4.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)花川保列顆粒處方比例稱取各味藥材共計(jì)3份，采用優(yōu)選的最佳提取工藝條件進(jìn)行提取、制備浸膏粉，按“2.3”項(xiàng)下測(cè)定浸膏收率;按“2.2.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，并按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定槲皮素含量，結(jié)果見表7。三批樣品所得浸膏收率、槲皮素總量RSD值較小，表明該提取工藝穩(wěn)定可行。

3 討論

處方中頭花蓼中主要含有蘆丁、槲皮素等黃酮類成分，溶于乙醇，具有明顯的抗菌、抗炎作用[1];粉萆薢主要成分為薯蕷皂苷，此類成分易溶于熱乙醇[2]，可抗腫瘤、抗炎止痛、降低血糖、抗骨質(zhì)疏松、抗肥胖，對(duì)心臟、肝臟、腎臟具有保護(hù)作用[3];牛膝主要含牛膝皂苷、促蛻皮甾酮、牛膝甾酮、齊墩果酸等[4]，齊墩果酸具有抑菌消炎，強(qiáng)心利尿，升高白細(xì)胞，增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能等方面的作用，以醇提為主[5]。通過(guò)文獻(xiàn)分析可知，以上藥材的主要藥效成分均能較好地溶于醇溶液，故考慮采用醇提工藝。川芎中有效成分主要為揮發(fā)油、阿魏酸、川芎嗪、大黃酚、川芎內(nèi)酯等，溶于乙醇[6]，川芎中川芎嗪、阿魏酸等成分長(zhǎng)時(shí)間煎煮被大量破壞，高沸點(diǎn)的藁本內(nèi)酯、金合歡醇等成分經(jīng)乙醇回流可保留在濃縮液中[7];白芷有效成分為白當(dāng)歸素、歐前胡素和異歐前胡素等[8]，其揮發(fā)油含量極低，且歐前胡素等香豆素類長(zhǎng)時(shí)間加熱易破壞[9]。本研究通過(guò)對(duì)3個(gè)不同藥店購(gòu)買的川芎、白芷進(jìn)行了揮發(fā)油提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：川芎藥材幾乎提取不出揮發(fā)油;白芷揮發(fā)油的收率僅為0.10%左右。因此，花川保列顆粒未進(jìn)行揮發(fā)油的提取。

本研究基于藥效學(xué)與正交試驗(yàn)相結(jié)合進(jìn)行的最佳工藝條件選擇，可避免僅以化學(xué)成分為評(píng)價(jià)指標(biāo)造成的工藝研究的片面性和局限性。本實(shí)驗(yàn)是在藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)確定的醇提工藝基礎(chǔ)上，進(jìn)一步以君藥頭花蓼中槲皮素總量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗(yàn)及方差分析，并結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際確定最佳醇提工藝條件為：10倍量60%乙醇，回流提取3次，每次1.5 h。

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（收稿日期：2021-07-21 編輯：陶希睿）86C2FDBD-112A-400C-9257-4AC0B06A0F5A