miR-1247-3p激活TGF-β1信號介導肝星狀細胞與肝纖維化的關系*

李長安, 王園園, 杜敬佩, 孫愛平

1新鄉(xiāng)醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院感染科(河南新鄉(xiāng) 453000); 2新鄉(xiāng)醫(yī)學院免疫學教研室(河南新鄉(xiāng) 453000)

肝纖維化是由各種致病因子作用導致的肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生改變，若未及時治療可導致肝細胞損害，最終導致肝硬化[1]。目前國內(nèi)外肝纖維化治療現(xiàn)狀尚不理想，臨床實踐發(fā)現(xiàn)，盡管去除病因，肝纖維化進程仍可繼續(xù)，甚至發(fā)展為肝硬化和肝癌[2]。miRNA是一類長度約22 nt的非編碼單鏈RNA分子，可在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控多種基因表達。近年研究表明，miRNA可通過調(diào)節(jié)肝星狀細胞增殖、活化、遷移和凋亡，參與肝纖維化過程，且不同miRNA在肝纖維化過程中發(fā)揮著不同的促或抗纖維化作用[3]。miR-1247-3p和miR-1247-5p具有同源性。有報道顯示，miR-1247-5p在人肝細胞癌中發(fā)揮抑癌作用[4]，而miR-1247-3p與肝癌的關系鮮有報道。轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β 1，TGF-β1)為miRNA調(diào)控肝纖維化發(fā)生發(fā)展多個環(huán)節(jié)靶基因的重要通路之一[5]?；诖?，本研究于2020年6—12月期間利用四氯化碳(CCl4)誘導大鼠肝纖維化，測定肝組織miR-1247-3p和TGF-β1的表達，并分離大鼠原代肝星狀細胞，觀察miR-1247-3p對肝星狀細胞細胞增殖和活化的影響，以及miR-1247-3p與TGF-β1的靶向關系，旨在分子水平上為肝纖維化治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 Wistar大鼠：30只，雄性，8周齡，體重180～220 g，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，動物生產(chǎn)許可證號SCXK(魯)20190003；飼養(yǎng)于標準環(huán)境，溫度20～24℃，相對濕度50%～60%，光照周期12 h/12 h，自由飲食和飲水。本研究符合醫(yī)院有關動物倫理相關規(guī)定(2013[639])。

1.1.2 主要試劑與儀器 CCl4：美國RD公司。D-Hank′s液(貨號JK-CS1166)：上海晶抗生物工程有限公司。RNA提取試劑盒(貨號SY3882)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號YT9036)：北京伊塔生物科技有限公司。qRT-PCR試劑盒(貨號F-430)：北京美科美生物技術(shù)開發(fā)有限公司。組織/細胞裂解液(貨號FK-MB534J)、BCA法蛋白定量試劑盒(貨號FK-all2016)：上海延慕實業(yè)有限公司。鼠抗人TGF-β1單克隆抗體(貨號ab190503)：美國Abcam公司。鼠抗人α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)單克隆抗體(貨號SM0610)：廣州深達生物制品技術(shù)有限公司。CCK-8試劑盒(貨號C0037)：上海碧云天生物技術(shù)有限公司。Dual Luciferase試劑盒(貨號YIJI20144.2)：上海一基實業(yè)有限公司。凝膠成像系統(tǒng)(型號iBright)、酶標儀(型號Scientific MK3)：美國賽默飛世爾公司。

1.2 方法

1.2.1 動物模型構(gòu)建[6]適應性飼養(yǎng)1周后，將大鼠隨機分為對照組和模型組，每組15只；模型組大鼠皮下注射50% CCl4，1.0 mL/kg，2次/周，連續(xù)12周；對照組大鼠皮下注射等體積無菌油劑，分別于處理后第6周和第12周取肝臟組織，觀察病理變化。

1.2.2 原代肝星狀細胞分離與培養(yǎng)[7]大鼠禁食12 h，8‰戊巴比妥鈉腹腔注射，1 mL/kg；麻醉后，剃毛并消毒胸腹部，暴露腹腔，將其胃腸移至腹部左側(cè)；暴露門靜脈和下腔靜脈；自門靜脈遠端穿刺，連接注射器預注射2 mL D-Hank′s液；確認插入成功后，剪開下腔靜脈，灌注D-Hank′s液30 mL，速率為7～10 mL/min；待肝臟變黃白、流出D-Hank′s液,無肉眼可見血液時，更換灌注液為含Ⅳ型膠原蛋白酶HBSS液10 min，速率為3～5 mL/min；待肝臟變軟、脆，表面呈裂隙狀，壓之凹陷不易恢復時，停止灌注；取肝臟置于無菌皿，生理鹽水沖洗，剔除血管等組織；剪碎并振蕩消化，濾網(wǎng)過濾，2 000 r/min離心7 min，棄上清；不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基重懸細胞，1 000 r/min離心5 min，取上清；1 500 r/min離心上清液7 min，取沉淀；加入18% Nycodenz，混勻后加入預冷不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基；2 600 r/min離心20 min，吸取分層處乳白色細胞，DMEM培養(yǎng)基洗滌2次；1 200 r/min離心5 min，臺酚藍染色觀察原代肝星狀細胞活性并計數(shù)；以1×106個細胞接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h，每3 d更換1次培養(yǎng)液。

1.2.3 蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin，HE) 分別于0、6、12周取大鼠肝臟組織，4%多聚甲醛固定24 h，制備石蠟切片；取切片，二甲苯脫蠟，乙醇梯度脫水；自來水沖洗后，蘇木精染色10 min，1%鹽酸乙醇沖洗；伊紅染色3 min，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，顯微鏡下隨機選取5個視野，計算肝纖維化面積，0分為無纖維化，1分為纖維化面積<25%，2分為25%～49%，3分為50%～75%，4分為>75%。

1.2.4 實時熒光定量酶鏈式反應(quantitative real-time fluorescence quantitative enzyme chain reaction，qRT-PCR) 提取組織或細胞總RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA，取出cDNA加入180 μL的ddH2O，-20℃保存待用；取2.5 μL的cDNA，分別加入5 μL的SYBER Green、1.5 μL的DEPC水、0.5 μL上游引物和0.5 μL下游引物，構(gòu)成10 μL的反應體系進行PCR擴增，每個樣重復3次；以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算miR-1247-3p和TGF-β1 mRNA表達量。

1.2.5 蛋白免疫印跡法 提取組織或細胞蛋白，BCA法定量；制備分離膠和積層膠，取蛋白樣品進行電泳；電泳結(jié)束后將蛋白凝膠濕法轉(zhuǎn)至PVDF膜上，冰上反應1 h；TBST溶液沖洗，5%脫脂牛奶封閉1 h；TBST溶液沖洗，滴加一抗(1∶1 000)，以β-actin為內(nèi)參，4℃過夜孵育；TBST溶液沖洗3次，滴加二抗(1∶2 000)，室溫孵育2 h；TBST溶液沖洗，凝膠成像系統(tǒng)觀察蛋白條帶，Image J軟件定量分析。

1.2.6 細胞轉(zhuǎn)染 細胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基內(nèi)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；貼壁后以0.25%胰酶消化，細胞融合度達80%時，加入DMEM培養(yǎng)基終止反應；隨機分為空白對照組、miR-1247-3p mimic組和miR-1247-3p inhibitor組，使用Lipo3000轉(zhuǎn)染劑分別轉(zhuǎn)染miR-1247-3p 無意義對照序列、miR-1247-3p mimic和miR-1247-3p inhibitor，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h。

1.2.7 CCK-8細胞增殖實驗 取轉(zhuǎn)染48 h后的細胞，以5×103個/孔接種于96孔板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h；棄舊培養(yǎng)基，PBS溶液沖洗，每孔加入100 μL無血清DMEM培養(yǎng)基和10 μL的CCK-8試劑；分別于24、48、72 h利用酶標儀測定波長450 nm處吸光度(optical density，OD)值；以細胞數(shù)量為橫坐標，OD值為縱坐標繪制標準曲線，OD值越大提示細胞增殖能力越強。

1.2.8 熒光素酶報告實驗驗證靶基因 miRDB和microT-CD數(shù)據(jù)庫中查找miR-1247-3p靶基因，分析交集；Targetscan軟件對交集基因進行置信水平分析，將置信區(qū)間最大的基因作為miR-1247-3p靶基因；設計pGL3質(zhì)粒，分別將空白pGL3質(zhì)粒、含靶基因pGL3質(zhì)粒(pGL3-TGF-β1 WT)、陰性對照pGL3質(zhì)粒(pGL3-TGF-β1 MUT)轉(zhuǎn)染至細胞，并將miR-1247-3p NC、mimic和inhibitor轉(zhuǎn)染至細胞，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h；按照Dual Luciferase試劑盒說明書操作，單管熒光測定儀檢測熒光強度，熒光強度越低提示miR-1247-3p 可與TGF-β1結(jié)合，從而抑制下游熒光素酶表達。

2 結(jié)果

2.1 模型組和對照組大鼠肝組織病理變化 與對照組比較，CCl4腹腔注射后大鼠肝組織出現(xiàn)纖維化增生，結(jié)構(gòu)破壞，炎癥細胞浸潤，且隨時間延長肝纖維化程度加重，見圖1。對照組、模型組第6周和模型組第12周肝組織纖維化評分分別為(0.12±0.08)分、(1.54±0.12)分、(2.39±0.15)分，兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

注：A：對照組；B：模型組第6周；C模型組第12周

2.2 模型組和對照組大鼠肝組織miR-1247-3p和TGF-β1表達水平 與對照組比較，模型組大鼠肝組織miR-1247-3p和TGF-β1表達水平均顯著增加(P<0.05)，見表1、圖2。

圖2 模型組和對照組大鼠肝組織TGF-β1蛋白表達

表1 模型組和對照組大鼠肝組織miR-1247-3p和TGF-β1表達水平

2.3 miR-1247-3p對肝星狀細胞增殖的影響 與空白對照組比較，miR-1247-3p mimic組肝星狀細胞增殖能力顯著增加，miR-1247-3p inhibitor組顯著降低(P<0.05)，見圖3。

圖3 miR-1肝星狀細胞247-3p對肝星狀細胞增殖的影響

2.4 miR-1247-3p對肝星狀細胞活化的影響 與空白對照組比較，miR-1247-3p mimic組肝星狀細胞α-SMA 蛋白表達水平顯著升高，miR-1247-3p inhibitor組顯著降低(P<0.05)，見表2、圖4。

表2 大鼠肝星狀細胞α-SMA蛋白表達水平

圖4 大鼠肝星狀細胞α-SMA蛋白表達

2.5 miR-1247-3p對肝星狀細胞TGF-β1表達的影響 雙熒光素酶報告實驗結(jié)果顯示，與WT組比較，miR-1247-3p mimic可顯著抑制肝星狀細胞內(nèi)熒光素酶活性(P<0.05)；與miR-1247-3p-NC組比較，miR-1247-3p mimic組熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)，而miR-1247-3p inhibitor組無顯著變化(P>0.05)；與MUT組比較，miR-1247-3p mimic對肝星狀細胞內(nèi)熒光素酶活性無顯著變化；miR-1247-3p-NC組和miR-1247-3p mimic組熒光素酶活性比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖5。與空白對照組比較，miR-1247-3p mimic組肝星狀細胞TGF-β1表達水平顯著升高，miR-1247-3p inhibitor組顯著降低(P<0.05)，見表3、圖6。

表3 大鼠肝星狀細胞TGF-β1表達水平

圖6 大鼠肝星狀細胞TGF-β1表達

3 討論

肝纖維化是肝臟慢性損傷引起的肝內(nèi)結(jié)締組織的異常增生，導致肝細胞功能障礙[8]。若未經(jīng)有效治療，可進一步發(fā)展為肝硬化甚至是肝癌，嚴重影響患者生活質(zhì)量。故早期診斷和治療對肝纖維化轉(zhuǎn)歸尤為重要。然而，目前臨床采用的診斷和治療有一定局限性。隨著表觀遺傳學研究深入發(fā)現(xiàn)，肝纖維化過程中存在miRNA譜異常，其可通過調(diào)控靶基因表達參與肝纖維化發(fā)生發(fā)展[9]。近年有研究證實，miR-1247-3p在肝癌組織中差異表達[10]，即相較于健康人群，肝細胞癌患者血清和組織中miR-1247-3p水平均顯著升高。本研究亦得出類似結(jié)果，表明miR-1247-3p在肝纖維化過程中起著重要調(diào)控作用。

肌成纖維細胞是慢性肝損傷過程中產(chǎn)生細胞外基質(zhì)的主要細胞，其中肝星狀細胞為各種臨床和實驗性肝纖維化模型中肌成纖維細胞的主要來源[11]。研究發(fā)現(xiàn)，肝纖維化小鼠纖維化肝臟中幾乎所有的肝星狀細胞均被激活[12]，表明肝星狀細胞激活在肝纖維化過程中發(fā)揮重要作用，提示通過抑制其增殖和活化有可能減少甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化過程[13]。為進一步分析miR-1247-3p在肝纖維化中的作用和調(diào)控機制，本研究以CCl4構(gòu)建肝纖維化大鼠模型，并分離原代肝星狀細胞，分別在動物和細胞水平進行探討。取肝組織進行HE染色發(fā)現(xiàn)，CCl4腹腔注射后大鼠肝組織出現(xiàn)纖維化增生，結(jié)構(gòu)破壞，炎癥細胞浸潤，且隨時間延長肝纖維化程度加重，提示肝纖維化大鼠模型構(gòu)建成功[14]。TGF-β1是能使正常成纖維細胞表型發(fā)生轉(zhuǎn)化的細胞因子。多項研究表明，TGF-β1在肝星狀細胞活化以及細胞外基質(zhì)分泌與沉積中發(fā)揮重要作用[15-16]。本研究分別采用qRT-PCR和蛋白免疫印跡法測定大鼠肝臟組織TGF-β1表達發(fā)現(xiàn)，無論在轉(zhuǎn)錄水平還是在翻譯水平上，肝纖維化大鼠肝組織TGF-β1表達均顯著上調(diào)，符合以往研究結(jié)果。利用慢病毒感染構(gòu)建miR-1247-3p過表達和抑制的細胞模型發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-1247-3p可顯著增加肝星狀細胞增殖能力，下調(diào)則得到相反作用。α-SMA是肝星狀細胞活化重要標志分子[17]。本研究結(jié)果顯示，上調(diào)miR-1247-3p可顯著增加肝星狀細胞α-SMA表達，下調(diào)則可降低其表達。以上結(jié)果提示miR-1247-3p可通過促進肝星狀細胞增殖和活化，參與肝纖維化進程。本研究進一步通過雙熒光素酶報告實驗驗證miR-1247-3p與TGF-β1的靶向關系發(fā)現(xiàn)，TGF-β1為miR-1247-3p的靶基因，miR-1247-3p可能通過羥基化TGF-β1轉(zhuǎn)錄活性區(qū)域，抑制其下游因子表達，從而促進肝星狀細胞增殖和活化，參與肝纖維化進展。

綜上所述，miR-1247-3p可通過靶向上調(diào)TGF-β1表達，促進肝星狀細胞增殖和活化，從而參與肝纖維化進展。本研究尚存在不足之處為未對下游分子機制進一步探討，擬在今后研究中分析。

利益相關聲明：本文所有作者不存在利益沖突。

作者貢獻說明：李長安負責論文選題、研究設計、實驗開展、論文撰寫。王園園負責查閱文獻、采集數(shù)據(jù)。杜敬佩負責整理數(shù)據(jù)、統(tǒng)計分析。孫愛平負責統(tǒng)計指導、終審及修改論文。