200 g/L氯蟲苯甲酰胺懸浮劑對斑馬魚的急性毒性試驗

丁潔　劉建梅

摘要 氯蟲苯甲酰胺是全球銷售量最高的廣譜殺蟲劑，可與多種殺蟲劑進行復配。為研究200 g/L氯蟲苯甲酰胺懸浮劑對斑馬魚急性毒性而設計并開展此試驗。結(jié)果表明：建立的HPLC法適用于暴露水樣中氯蟲苯甲酰胺的定量分析，在有效的靜態(tài)試驗條件下，200 g/L氯蟲苯甲酰胺懸浮劑對斑馬魚的96 h-LC50：72.15 mg a.i. /L，95%置信限：64.61～ 80.55 mg a.i. /L（HPLC實測濃度）。200 g/L氯蟲苯甲酰胺懸浮劑對斑馬魚的毒性等級為“低毒”。

關(guān)鍵詞 氯蟲苯甲酰胺;斑馬魚急性毒性;高效液相色譜;分析

中圖分類號：X171.5 文獻標識碼：B 文章編號：2095–3305（2022）02–0043–03

1 試驗目的

氯蟲苯甲酰胺是由杜邦公司研發(fā)出的第一個具有新型鄰酰胺基苯甲酰胺類化學結(jié)構(gòu)的廣譜殺蟲劑，于2007年在菲律賓率先登記，商品名為“Prevathon”，用于防治甘藍、茄子和水稻咀嚼式口器害蟲。目前，氯蟲苯甲酰胺現(xiàn)已在世界上100多個國家銷售，幾乎覆蓋了所有主要市場，如美國、英國、加拿大、澳大利亞等。

2008年在中國登記，商品名為“康寬”，銷售額穩(wěn)居殺蟲劑前列。截至2020年10月26日，我國氯蟲苯甲酰胺農(nóng)藥的有效登記個數(shù)為34個，登記作物22種，原藥登記廠家4家，分別為：美國富美實公司的95.3%原藥、山東濰坊潤豐化工股份有限公司的98%原藥、連云港立本作物科技有限公司的95.3%原藥、上海杜邦農(nóng)化有限公司的95.3%原藥。氯蟲苯甲酰胺高效廣譜且低毒，其化合物專利大多已于2021年3月到期，相信在專利到期后，將會迎來一股登記熱潮。

作為農(nóng)藥登記的關(guān)鍵測試項目，按照GB/T 31270.12—2014《化學農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準則》第12部分：魚類急性毒性試驗的規(guī)定，對200 g/L氯蟲苯甲酰胺懸浮劑進行了斑馬魚急性毒性試驗。試驗選用斑馬魚（Danio rerio）作為供試生物，采用靜態(tài)法通過將供試物溶解在水中的方式對斑馬魚進行染毒。本試驗的目的是按照設定濃度，通過測定96 h的200 g/L氯蟲苯甲酰胺懸浮劑暴露對斑馬魚的急性毒性效應，計算200 g/L氯蟲苯甲酰胺懸浮劑對斑馬魚的LC50及95%置信限。

2 材料和方法

2.1 試驗用水

經(jīng)活性炭過濾和反滲系統(tǒng)純化后曝氣處理24 h以上的自來水。

2.2 儀器

相關(guān)儀器信息見表1。

2.3 測試物種

分類群：脊索動物門：輻鰭魚綱;種類：斑馬魚（Danio rerio）;生活期：成年;全長：1～2 cm。

2.4 測試條件

溫度：23.3 oC～ 23.8 oC（連續(xù)監(jiān)控結(jié)果）;

溶解氧：61.3%～104.5%;

pH值：7.37～8.20;

硬度：123 mg/L（以CaCO3計）;

光周期：光暗比為12 h/12 h，光照強度范圍594 ～ 863 lx;

承載量：0.1703 g魚/L;

喂食：試驗期間不喂食。

2.5 試驗步驟

2.5.1 試驗用魚的馴養(yǎng) 正式試驗前，試驗用斑馬魚（批號：FB-20210521-002-02），在試驗條件下馴養(yǎng)7 d，每天飼喂2次豐年蝦，試驗前24 h停止飼喂。馴養(yǎng)期間的死亡率為0%，符合試驗準則中死亡率<5%的要求。試驗前抽檢10條斑馬魚測量全長、體重，計算得出正式試驗時測試系統(tǒng)的承載量為0.170 3 g魚/L水，平均全長為1.674 cm，滿足承載量<1.0 g魚/L水，全長1～2 cm的要求。

2.5.2 試驗設計 基于預試驗結(jié)果，200 g/L氯蟲苯甲酰胺懸浮劑對斑馬魚96 h LC50在50.0～100 mg a.i./L。因此，本試驗進行正式試驗。正式試驗設置1個48.2 mg a.i./L、57.9 mg a.i./L、69.4 mg a.i./L、83.3 mg a.i./L和100 mg a.i./L 5個濃度組和1個空白對照組。濃度組和對照組均不設重復，每組7尾魚。濃度組和對照組的測試容器均為4 L玻璃魚缸，測試溶液為3 L。試驗周期為96 h。

2.5.3 供試物溶液的配制 分別量取1.25 mL和5.00 mL 200 g/L氯蟲苯甲酰胺懸浮劑用試驗用水溶解并分別定容至250 mL和1 000 mL，在室溫下（25℃）以500 r/min攪拌30 min，配制得到理論濃度為1 000 mg a. i. /L的貯備液。具體按表2方案進行配制。

2.5.4 暴露 以配制好的供試物試驗溶液為濃度組，以試驗用水為空白對照組，分別向每個濃度組和空白對照組隨機投放7尾魚，開始暴露。暴露之前測量濃度組和空白對照組溶液的溫度、pH值、溶解氧和光照強度。試驗周期為96 h。

2.6 觀察

暴露開始后3 h、6 h、24 h、48 h、72 h和96 h觀察魚的死亡情況。用玻璃棒輕觸魚尾部，沒有明顯的活動（如鰓動），尾鰭沒有反應則視為死亡。觀察和記錄后及時清理掉死魚。同時對一些異常行為做記錄。

試驗開始前及每24 h測定試驗溶液的溶解氧、pH值、溫度和光照強度等參數(shù)。此外，試驗過程中，隨機選擇一個試驗容器對水溫進行連續(xù)監(jiān)測。

2.7 濃度分析

在正式試驗開始時（0 h）、48 h與試驗結(jié)束時（96 h）由采集水樣50 mL前處理后進行上機測定供試物的實測濃度。采用HPLC法對試驗用水（經(jīng)活性炭過濾和反滲透系統(tǒng)純化后曝氣處理24 h以上的自來水作為試驗用水）中氯蟲苯甲酰胺的分析方法進行了驗證，并對水樣中氯蟲苯甲酰胺的濃度進行了分析。分析條件如下：

高效液相色譜儀：HPLC 1260（Agilent）;

色譜工作站：Open Lab CDS 2.3;

移液器：Thermo;

色譜柱：Agilent Infinity Lab Poro-shell 120 EC- C18，4.6 mm×150 mm×4.0 μm;

流動相：A相為超純水，C相為甲醇（表3）。

氯蟲苯甲酰胺在0.100～50.0 mg/L之間成線性關(guān)系，回歸方程為Y= 81.0549X – 10.1343（R2=0.99961）。

系統(tǒng)精密度（系統(tǒng)性能一致性）為分別對10.0 mg/L的氯蟲苯甲酰胺標準溶液連續(xù)測定6次的結(jié)果的相對標準偏差（RSD）。氯蟲苯甲酰胺的系統(tǒng)精密度為0.173%。

取試驗用水、標準物質(zhì)溶液、供試物溶液進行色譜分析。結(jié)果表明：在空白溶液中無主成分保留位置的色譜峰;在標準溶液和供試物溶液中的氯蟲苯甲酰胺主成分的色譜峰的保留時間分別是4.935 min和5.037 min，保留時間的絕對差值小于0.3 min。所以方法的特異性可以接受。

在試驗用水中的添加回收試驗，設置5.00 mg a.i./L和160 mg a.i./L兩個添加濃度，平均回收率分別為99.1%和101%，RSD分別為2.56%和1.13%;方法的精密度（重復性）為對5.00 mg a.i./L和160 mg a.i./L的添加回收溶液響應值的相對標準偏差，分別為2.61%和0.882%。

上述結(jié)果表明，氯蟲苯甲酰胺在試驗用水中的分析方法能滿足檢測要求，可用于測定試驗用水中氯蟲苯甲酰胺的濃度。

3 結(jié)果與結(jié)論

3.1 結(jié)果

3.1.1 理化性質(zhì) 試驗期間的光周期（光/暗）為12 h/12 h;在正式試驗開始時測得試驗用水的硬度為123 mg/L（以CaCO3計），在96 h暴露期間連續(xù)監(jiān)測試驗用水的溫度為23.3℃～23.8℃、pH值為7.37～8.20、溶解氧為空氣飽和值的61.3%～104.5%。

3.1.2 死亡率和異常行為 正式試驗期間，空白對照組死亡率為0%，且斑馬魚無任何異常行為。57.9 mg a.i./L及以上濃度組出現(xiàn)游動時側(cè)翻和正面或側(cè)面平躺的中毒癥狀（表4）。

3.1.3 濃度分析 根據(jù)實測濃度分析結(jié)果，理論濃度為48.2、57.9、69.4、83.3和100 mg a.i. /L 的濃度組在0 h的實測濃度為47.8、58.3、71.2、83.4和104 mg a.i. /L，為理論濃度的99.2%、101%、103%、100%和104%;48 h的實測濃度為47.5、56.3、70.1、81.9、103 mg a.i. /L，為理論濃度的98.5%、97.2%、101%、98.3%和103%;96 h的實測濃度為45.6、55.0、70.5、81.0 mg a.i. /L，為理論濃度的94.6%、95.0%、102%和97.2%，證實供試物濃度始終不低于理論濃度的80%，96 h實測濃度變化率小于20%（表5）。

3.1.4 試驗有效性 試驗結(jié)果符合所有的有效性準則：馴養(yǎng)期間斑馬魚的死亡率為0%，符合試驗準則中死亡率<5%的要求;試驗結(jié)束時，空白對照組魚的死亡數(shù)為0條，符合死亡數(shù)不能超過一條的要求;正式試驗期間，濃度組和空白對照組溶解氧為空氣飽和值的61.3%到104.5%，符合不得低于空氣飽和值的60%的要求;正式試驗時測試系統(tǒng)承載量為0.170 3 g魚/L水，滿足承載量<0.8 g魚/L水的要求。參比物質(zhì)重鉻酸鉀對斑馬魚24 h的LC50值為265.57 mg/L，在GB/T 31270.12—2014規(guī)定的有效準則范圍200～400 mg/L內(nèi)[4-5]。

3.2 結(jié)論

在有效的靜態(tài)試驗條件下，200 g/L氯蟲苯甲酰胺懸浮劑對斑馬魚的96 h-LC50：72.15 mg a.i. /L（實測濃度），95%置信限：64.61-80.55 mg a.i. /L（實測濃度）。

按照GB/T 31270.12—2014《化學農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準則》 第12部分：魚類急性毒性試驗，農(nóng)藥對魚類的毒性等級的劃分，在本實驗室條件下，200 g/L氯蟲苯甲酰胺懸浮劑對斑馬魚的毒性等級為“低毒”。

參考文獻

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[3] 宋玥頤.氯蟲苯甲酰胺和氟苯蟲酰胺在斑馬魚體內(nèi)的富集和毒性效應研究[D].揚州：揚州大學，2020.

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[5] OECD. Environmental Health and Safety Publications， Series on Testing and Assessment[C]//No. 23. Guidance document on aquatic toxicity testing of difficult substances and mixtures. Paris：

責任編輯：黃艷飛

Acute Toxicity Test of 200 g/L Chloride Worm Benzamide Suspension Agent Against Zebrafish

DING Jie et al（Jiangsu CICA KunTesting Technology Co.， Ltd.， Jiangsu， Nanjing 210000）

Abstract Chlorbenzoamide is the highest selling wide-spectrum insecticide worldwide and can be reissued with multiple pesticides.This test was designed and conducted for studying the acute toxicity of a 200 g/liter chloride worm benzamide suspension in zebrafish.The results show that the established HPLC method is suitable for the quantitative analysis of chlorozobenzamide in exposed water samples， with 96 h-LC50：72.15 mg a.i. / L in zebrafish at 200 g / liter： 64.61 to 80.55 m g a. i. / L （measured HPLC concentration）.The 200 g / liter benzoamide suspension had a "low toxic" toxicity grade to zebrafish.

Key words Chloride worm benzoamide; Zebrafish acute toxicity; HPLC; Analysis

作者簡介 丁潔（1989—），女，江蘇南京人，中級工程師，碩士，主要研究方向：化學品和農(nóng)藥的生態(tài)毒理學測試。

收稿日期 2021-12-20