非洲豬瘟的診斷和防治

張濤　王祎汀

摘? 要：非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是一種病毒性、出血性疾病，對(duì)家豬和歐亞野豬的致死率極高。本文介紹了非洲豬瘟診斷的現(xiàn)有技術(shù)和障礙，并就防控策略進(jìn)行了論述，最后介紹了非洲豬瘟疫苗研究存在的難點(diǎn)以及就進(jìn)一步研究的方向。

關(guān)鍵詞：非洲豬瘟;診斷;防治;疫苗

中圖分類(lèi)號(hào)：S852.65+ S851.33 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B 文章編號(hào)：1001-0769（2022）04-0013-09

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是一種病毒性、出血性疾病，對(duì)家豬和歐亞野豬具有極高的致死率。盡管引發(fā)該病的病毒——非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）的宿主范圍有限，也不可能會(huì)引發(fā)人畜共患病，但其對(duì)社會(huì)、經(jīng)濟(jì)的影響非常大，許多利益相關(guān)者都被牽涉其中。出于這個(gè)原因，一旦豬群暴發(fā)該病，發(fā)病地的相關(guān)行業(yè)管理部門(mén)應(yīng)向世界動(dòng)物衛(wèi)生組織通報(bào)。目前，對(duì)非洲豬瘟的控制仍依賴(lài)于嚴(yán)格的衛(wèi)生措施，因?yàn)楝F(xiàn)今既沒(méi)有獲得許可的疫苗，也沒(méi)有任何有效的治療方法。

1? 非洲豬瘟的診斷

1.1 目前的技術(shù)水平和障礙

在實(shí)際生產(chǎn)中，當(dāng)對(duì)ASF執(zhí)行早期預(yù)警、及時(shí)干預(yù)和監(jiān)測(cè)時(shí)，采用快速和可靠的診斷方法極為重要。好的檢測(cè)方法應(yīng)能夠檢測(cè)ASFV的所有基因型和突變體，具有高靈敏度和特異性，應(yīng)根據(jù)世界動(dòng)物衛(wèi)生組織的指南驗(yàn)證，且易于操作，能夠快速解釋檢測(cè)結(jié)果。另外，應(yīng)始終以合理的價(jià)格提供，能適應(yīng)于高通量的應(yīng)用。這種檢測(cè)需要伴隨潛在的能夠區(qū)分野毒株感染動(dòng)物和疫苗接種動(dòng)物（differentiating infected from vaccinated animal，DIVA）。顯然，并非所有的特性都能同時(shí)滿(mǎn)足，為此，應(yīng)建立診斷工作流程，考慮所用檢測(cè)方法的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。這可能包括使用欄邊檢測(cè)法（pen-side approaches），也包括替代性或非侵入性的采樣策略。后者對(duì)診斷野豬群是否感染ASF具有特殊意義。最近研究人員探討了通過(guò)豬的唾液、拭子樣本或誘餌來(lái)檢測(cè)病原體，并證明這些方法可用于豬瘟的檢測(cè)。

由于需要向世界動(dòng)物衛(wèi)生組織通報(bào)，相關(guān)建議和法律都對(duì)實(shí)驗(yàn)室診斷進(jìn)行了規(guī)定。診斷方法和準(zhǔn)則可在《世界動(dòng)物衛(wèi)生組織陸生動(dòng)物診斷試驗(yàn)和疫苗手冊(cè)》（OIE，2019），或歐盟ASF參考實(shí)驗(yàn)室官網(wǎng)（https：//asf-referencelab.info/asf/en/procedures-diagnosis/sops）上找到。鑒于ASF在一些歐盟成員國(guó)，特別是在西班牙和葡萄牙的歷史意義，針對(duì)非洲豬瘟的診斷指南和法律條文已經(jīng)相當(dāng)成熟，歐洲以外的國(guó)家可以直接借鑒這些指南和法律條文。

總的來(lái)說(shuō)，現(xiàn)有針對(duì)ASF的可靠的直接和間接診斷方法對(duì)家豬和野豬的特定樣本都能發(fā)揮作用。當(dāng)檢測(cè)來(lái)自家豬或野豬的高質(zhì)量樣本時(shí)，檢測(cè)的準(zhǔn)確性沒(méi)有差別（它們實(shí)際上是同一物種）。這些檢測(cè)方法包括從豬巨噬細(xì)胞分離病毒、（實(shí)時(shí)）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assays，ELISA）、免疫印跡和間接免疫染色標(biāo)記技術(shù)。然而，直到最近，這些測(cè)試方法中的大部分都是建立在“內(nèi)部”準(zhǔn)則基礎(chǔ)上的，只有通過(guò)使用實(shí)驗(yàn)室間的對(duì)比測(cè)試才能保證檢測(cè)結(jié)果的可比性。對(duì)于資源有限的國(guó)家而言，經(jīng)過(guò)充分驗(yàn)證和易于使用的測(cè)試系統(tǒng)才有利于推廣使用。在這里，定價(jià)合理且不需要額外耗材的商用試劑盒是關(guān)鍵。

目前的情況和以方法論為導(dǎo)向的研究項(xiàng)目已經(jīng)促使這種情況有所改善，一些ELISA、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）以及側(cè)流檢測(cè)（lateral flow assay，LFA）試劑盒已經(jīng)進(jìn)入市場(chǎng)。事實(shí)上，用于診斷ASF的商用PCR方法和ELISA方法的種類(lèi)越來(lái)越多，制造商分布在全球各地。雖然大多數(shù)檢測(cè)都能正常工作，但并不總是存在可比較的數(shù)據(jù)。由于德國(guó)對(duì)該國(guó)用于法定動(dòng)物傳染病和須報(bào)告動(dòng)物傳染病的任何檢測(cè)試劑盒都有官方許可程序，因此此類(lèi)試劑盒有基本的數(shù)據(jù)，并且可以在德國(guó)官方收集的法定動(dòng)物傳染病的檢測(cè)方法（https：//www.fli.de/en/publications/amtliche-methodensammlung/）中總是可以找到最新的清單。到目前為止，德國(guó)已經(jīng)批準(zhǔn)了8種商用實(shí)時(shí)PCR方法，并在地區(qū)實(shí)驗(yàn)室中用于排除性診斷和監(jiān)測(cè)。所有這些檢測(cè)方法都已在德國(guó)國(guó)家參考實(shí)驗(yàn)室（national reference laboratory，NRL）用一組確定的實(shí)驗(yàn)樣本進(jìn)行了測(cè)試，這些樣本代表ASFV的不同基因型（主要是ASFV基因Ⅰ型和Ⅱ型）、宿主物種、基質(zhì)和感染狀態(tài)。Schlottau已經(jīng)在德國(guó)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室對(duì)其中一些商用PCR方法和三種日常使用的自動(dòng)提取方法進(jìn)行了更詳細(xì)的比較。根據(jù)制造商提供的使用說(shuō)明書(shū)，在KingFisher提取平臺(tái)（Thermo Fisher Scientific）上使用NucleoMag? VET（Macherey-Nagel）、MagAttract Virus M48（Qiagen）和MagMAXTM CORE（Thermo Fisher Scientific，workflow C）試劑盒提取核酸?？偟膩?lái)說(shuō)，所有的試劑盒都是合適的，在下游應(yīng)用中可以給出可靠的結(jié)果。在PCR試劑盒方面，King等對(duì)virotype ASFV PCR試劑盒、INgene q PPA試劑盒、RealPCR ASFV DNA和ID GeneTM非洲豬瘟Duplex進(jìn)行了相互之間的比較同時(shí)與世界動(dòng)物衛(wèi)生組織推薦的檢測(cè)法進(jìn)行比較。所有的試劑盒都能給出可靠的結(jié)果，但在使用不能令人信服的樣本時(shí)有略微的差異。最近，Schoder等發(fā)表了用7種市售PCR試劑盒和3種PCR組合試劑盒檢測(cè)樣本中ASFV的比較數(shù)據(jù)，這些試劑盒分別為：virotype ASFV 2.0 PCR試劑盒，Adiavet ASFV Fast Time，Bio-T kit ASFV，VetMax ASFV 檢測(cè)試劑盒，RT-PCR ASFV DNA Test，VetAlert ASF PCR檢測(cè)試劑盒，以及ID Gene^TMASF Duplex。簡(jiǎn)而言之，研究人員在2018—2019年ASF疫情暴發(fā)期間，對(duì)比利時(shí)收集的300份特征明顯的野豬樣本進(jìn)行了敏感性和特異性測(cè)試。這項(xiàng)研究證實(shí)，所有商用試劑盒和三分之二的Taq聚合酶適用于診斷實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行ASFV檢測(cè)。這與上述經(jīng)驗(yàn)相符，并證實(shí)了商用試劑盒適用于快速和用戶(hù)友好型診斷。

對(duì)于抗體檢測(cè)，德國(guó)目前有三種商用ELISA方法被批準(zhǔn)用于ASF的血清學(xué)診斷。這些檢測(cè)方法使用不同的抗原，因此可以并行使用。除了基于p72蛋白的阻斷ELISA，還有一個(gè)間接檢測(cè)方法，使用p72蛋白、p62蛋白和p32蛋白的抗原混合物（ID Screen? ASF間接ELISA）。此外，一種基于p32蛋白的競(jìng)爭(zhēng)性ELISA最近已被批準(zhǔn)。至于國(guó)際上的許多檢測(cè)方法，它們的性能不容易評(píng)估。

差距和進(jìn)一步研究的方向：

必須改進(jìn)病毒分離技術(shù)，并進(jìn)一步優(yōu)化細(xì)胞系，以便能夠檢測(cè)和充分復(fù)制田間毒株。

應(yīng)對(duì)ASFV幸存者以及持續(xù)感染的家豬和野豬的抗體和病毒生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)進(jìn)行更詳細(xì)的調(diào)查研究。

應(yīng)進(jìn)一步分析ASFV在環(huán)境中的存活時(shí)間。

需要統(tǒng)一ASFV的遺傳標(biāo)記，并進(jìn)一步協(xié)商用于協(xié)調(diào)分析的基因組區(qū)域。

為優(yōu)化疾病控制，應(yīng)改進(jìn)無(wú)創(chuàng)（non-invasive）采樣技術(shù)和即時(shí)/現(xiàn)場(chǎng)診斷法。

一般來(lái)說(shuō)，應(yīng)對(duì)診斷方法、流程和技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步的協(xié)調(diào)、標(biāo)準(zhǔn)化和普及。ASFV診斷的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（standard operating procedures，SOP）應(yīng)作為全球標(biāo)準(zhǔn)來(lái)提供。

在過(guò)去幾年診斷檢測(cè)方法已經(jīng)得到了很大程度的改進(jìn)，但仍然需要進(jìn)行協(xié)調(diào)，制定適應(yīng)新形勢(shì)的診斷工作流程以及疾病生物學(xué)常識(shí)，以助于人們進(jìn)一步校準(zhǔn)檢測(cè)方法（另見(jiàn)GARA差距分析報(bào)告，https：//www.ars.usda.gov/GARA/）。

2? 非洲豬瘟的防控

2.1 控制策略

大多數(shù)生豬產(chǎn)量巨大的國(guó)家都會(huì)對(duì)重大豬病的監(jiān)測(cè)和控制制定一個(gè)具有約束力的法律概要?？刂拼胧┲胁豢苫蛉钡牟糠质羌皶r(shí)且可靠的診斷，撲殺感染豬群，劃出限制區(qū)，限制豬群的流動(dòng)，追蹤可能的接觸者。目前尚無(wú)可用的預(yù)防性疫苗和其他有效的治療方法，但歐盟和其他國(guó)家將會(huì)嚴(yán)格禁止使用。法律概要的一個(gè)例子是歐盟層面的立法，它是基于20世紀(jì)60年代到90年代ASF暴發(fā)期間積累的經(jīng)驗(yàn)，雖然該法律可能不適用于資源有限的國(guó)家，但其基本原則可以在全球范圍內(nèi)應(yīng)用。因此，本文概述了一些總體要點(diǎn)。目前，歐盟理事會(huì)第2002/60/EC指令規(guī)定了控制ASF的最低共同體措施。有些章節(jié)專(zhuān)門(mén)介紹了在疫情可疑情況下、疫情確診情況下、疫情曾暴發(fā)過(guò)情況下的措施，接觸豬群和流行病學(xué)調(diào)查中的措施，保護(hù)區(qū)和監(jiān)測(cè)區(qū)的建立，清潔和消毒，解除限制和重新組群所采取的措施，并詳細(xì)說(shuō)明了特殊情況，如對(duì)屠宰場(chǎng)的懷疑。歐盟委員會(huì)第2003/422/EC號(hào)指令詳細(xì)說(shuō)明了控制措施，并就診斷程序、采樣方法、檢測(cè)結(jié)果的評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)、生物安全要求以及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的原則和應(yīng)用提供了指南和最低要求。歐盟層面的法律框架經(jīng)修改，在2021年被新的動(dòng)物衛(wèi)生法取代?；驹瓌t保持不變。

控制措施的實(shí)施取決于獸醫(yī)服務(wù)部門(mén)的資源和對(duì)這些措施的遵守情況。遵守措施的一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)是及時(shí)和適當(dāng)?shù)难a(bǔ)償方案。正如在非洲和亞洲所看到的情況那樣，由于缺乏補(bǔ)償，病豬會(huì)出售給屠宰場(chǎng)和市場(chǎng)，從而造成ASF大規(guī)模地暴發(fā)。

對(duì)于野豬的傳染周期，在制定控制措施時(shí)必須考慮當(dāng)?shù)氐那闆r。目前，人們經(jīng)常使用捷克共和國(guó)控制ASF的案例，因?yàn)檫@是（到目前為止）唯一一個(gè)將ASF完全從野豬種群中凈化的國(guó)家。根據(jù)這些成功的案例，控制策略可以包括以下內(nèi)容：分區(qū)確定感染區(qū)、周?chē)彌_區(qū)和控制區(qū)。這些區(qū)域應(yīng)盡快建立，并應(yīng)足夠大。應(yīng)搜索病死豬的尸體，并進(jìn)行無(wú)害化處理。獎(jiǎng)勵(lì)發(fā)現(xiàn)病死豬尸體的人可以提高控制措施的遵守率和成功率。在感染區(qū)，應(yīng)嚴(yán)格執(zhí)行禁獵期（strict hunting rest）。如果已經(jīng)確定并且合適，可以允許誘捕。設(shè)置隔離柵欄已被證明能夠有效控制ASFV的傳播，可以根據(jù)當(dāng)?shù)氐那闆r加以應(yīng)用。柵欄不能防豬，但可以將病毒傳播速度降到最低。在可能的情況下，可以實(shí)施禁止進(jìn)入的措施。該措施可以用來(lái)減少周?chē)貐^(qū)的野豬，但必須針對(duì)每個(gè)案例單獨(dú)做出決定。

一旦ASF進(jìn)入了比較流行的階段，應(yīng)調(diào)整劃分的區(qū)域，如果可行的話，可以討論撲殺剩余的野豬。但該策略必須考慮適用的動(dòng)物福利和風(fēng)險(xiǎn)因素。應(yīng)減少疫區(qū)外的野豬數(shù)量。比利時(shí)當(dāng)局采取了極為類(lèi)似的措施，取得了明顯的效果（https：//www.wallonie.be/fr/peste-porcine-africaine）。

2.2 差距和進(jìn)一步研究的方向

事實(shí)證明，控制農(nóng)村和庭院式飼養(yǎng)環(huán)境中豬的ASF是非常困難的，應(yīng)制定和應(yīng)用適應(yīng)性強(qiáng)——即在各地區(qū)有較高接受度——的策略。

對(duì)感染野豬群的控制措施需要進(jìn)一步優(yōu)化，必須考慮不同區(qū)域的條件。

應(yīng)分析從捷克共和國(guó)和比利時(shí)等國(guó)家對(duì)ASF的成功根除和控制計(jì)劃中學(xué)到的經(jīng)驗(yàn)，并將其用于今后控制ASF疫情暴發(fā)的方案。

3? 免疫預(yù)防

3.1 非洲豬瘟疫苗

到目前為止，仍然缺乏安全有效的抗ASF疫苗，同時(shí)缺乏對(duì)ASFV足夠敏感且不會(huì)在ASFV基因組內(nèi)進(jìn)一步進(jìn)行遺傳適應(yīng)的永久性細(xì)胞系，這嚴(yán)重阻礙了大多數(shù)候選疫苗的生產(chǎn)。疫苗的開(kāi)發(fā)似乎仍然是可行的，因?yàn)楸┌l(fā)急性ASF后康復(fù)的豬對(duì)密切相關(guān)的ASFV毒株的挑戰(zhàn)性感染具有免疫力。影響疫苗開(kāi)發(fā)的原因部分是由于感染豬產(chǎn)生的抗體不能真正使病毒失去活力（未能完全中和）。此外，許多對(duì)建立良好免疫應(yīng)答很重要的成分在定位和功能上尚未完全被確定，因此，根據(jù)個(gè)別成分或通過(guò)載體表達(dá)的抗原生產(chǎn)疫苗具有挑戰(zhàn)性。滅活的病毒制劑沒(méi)有產(chǎn)生實(shí)質(zhì)性的保護(hù)作用，不過(guò)接種的豬產(chǎn)生了針對(duì)ASFV的抗體。最后，還應(yīng)指出的是，ASFV能夠建立復(fù)雜的免疫調(diào)節(jié)和有效的免疫逃避機(jī)制，也就是說(shuō)，它會(huì)產(chǎn)生許多能夠影響宿主免疫系統(tǒng)的物質(zhì)，從而使病毒有效地復(fù)制。

隨著ASFV大范圍傳播，相關(guān)研究機(jī)構(gòu)加強(qiáng)了疫苗的研究與開(kāi)發(fā)，并取得了一些非常有希望的結(jié)果。ASFV疫苗可能比其表面上的研究進(jìn)展更接近成品。

鑒于最近幾篇綜述總結(jié)了設(shè)計(jì)安全高效的ASF疫苗的方法，以下將重點(diǎn)介紹ASF疫苗開(kāi)發(fā)的總體情況、最近發(fā)表的論文和進(jìn)展，以及一些被忽視的問(wèn)題。

3.2 減毒活疫苗

減毒活疫苗可以以毒力自然減弱的ASFV毒株或通過(guò)敲除毒力因子導(dǎo)致毒力削弱的毒株為疫苗株。有些疫苗制作工藝是對(duì)自然產(chǎn)生的毒株進(jìn)行合理的改進(jìn)。

第一批疫苗生產(chǎn)工藝在20世紀(jì)60年代就已獲得了許可。這些早期活疫苗是基于減毒的ASFV毒株，并于20世紀(jì)60年代在葡萄牙和西班牙的野外條件下使用了數(shù)千次。不幸的是，許多免疫豬在接種疫苗幾個(gè)月后出現(xiàn)了機(jī)體功能衰弱和慢性病變，并導(dǎo)致兩個(gè)國(guó)家的發(fā)病豬增加。最后，疫苗回收，停止了現(xiàn)場(chǎng)使用。這一經(jīng)驗(yàn)解釋了為什么今天需要對(duì)ASFV疫苗候選株的安全性進(jìn)行非常仔細(xì)的檢查。ASFV疫苗設(shè)計(jì)不應(yīng)倉(cāng)促解決。

從20世紀(jì)70年代到90年代，俄羅斯進(jìn)行了通過(guò)合理選擇減毒株開(kāi)發(fā)緊急疫苗（接種屠宰場(chǎng)和安全處理廠的待宰豬）的研究。根據(jù)紅細(xì)胞吸附抑制（haemadsorption inhibition）和免疫生物學(xué)試驗(yàn)確定的特性和血清免疫類(lèi)型，對(duì)ASFV的幾種毒株進(jìn)行了測(cè)試和分類(lèi)?？傊?，大多數(shù)候選毒株仍會(huì)誘發(fā)接種豬出現(xiàn)相當(dāng)長(zhǎng)的病毒血癥和輕微的發(fā)熱反應(yīng)。即使在較長(zhǎng)的時(shí)間之后，疫苗也會(huì)產(chǎn)生較高的保護(hù)作用，但免疫作用并不完全，特別是當(dāng)接種豬的免疫力較低時(shí)。

另外，ASFV自然發(fā)生的減毒毒株的變異株也被作為候選疫苗株進(jìn)行了測(cè)試。最近，Zani和Gallardo等在波羅的海分離到了這種毒株。在Gallardo等報(bào)告初步試驗(yàn)結(jié)果后，Barasona等測(cè)試了野豬口服接種ASFV Lv17/WB/Rie1株（在西班牙獲得專(zhuān)利，專(zhuān)利號(hào)為PCT/2018/000069）后的安全性和免疫效果。該毒株為截短的CD2v蛋白（EP402R基因），不具有紅細(xì)胞吸附（non-haemadsorbing）性。在對(duì)野豬進(jìn)行免疫-攻毒試驗(yàn)的測(cè)試環(huán)境中，可以觀察到，大多數(shù)接種疫苗的野豬和一頭早期感染ASFV疫苗株的對(duì)照組野豬的體溫略有升高，這是唯一觀察到的臨床癥狀。用qPCR方法檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)部分野豬體內(nèi)含的ASFV載量很低。在疫苗接種期，大多數(shù)接種疫苗的野豬和所有早期接觸的對(duì)照組野豬都產(chǎn)生了抗ASFV的抗體，證明ASFV疫苗株具有免疫原性和傳播性。用野毒株攻毒后，在12頭接種疫苗的野豬中，11頭豬對(duì)致命的攻毒產(chǎn)生了免疫保護(hù)（92%），發(fā)生急性ASF的野豬是免疫后沒(méi)有產(chǎn)生抗體或接種疫苗后體溫升高的豬?？傊摻Y(jié)果令人感到前景光明，但仍然缺乏關(guān)于疫苗的保護(hù)作用、安全性和無(wú)害性的更精確數(shù)據(jù)。Gallardo等在早期對(duì)同一毒株進(jìn)行的研究中發(fā)現(xiàn)，至少有一頭豬發(fā)生了關(guān)節(jié)腫脹和病變，這表明可能發(fā)生了慢性病。此外，疫苗毒株的傳播可能會(huì)對(duì)受影響地區(qū)的人群和所在國(guó)家產(chǎn)生有利或不利的影響。這種毒株的優(yōu)勢(shì)在于它的非轉(zhuǎn)基因特性。

最有希望成為ASFV疫苗株的候選者是通過(guò)同源重組產(chǎn)生的基因缺失突變體。Bosch-Camós等利用這種方法，已經(jīng)對(duì)ASFV的幾種毒株合理地敲除了毒力基因和干擾素抑制因子（interferon inhibitors）。敲除的毒力相關(guān)基因包括9GL（B119L）、UK（DP96R）、CD2v（EP402R）、DP148R，以及多基因家族（multigene families，MGF）的不同成員。沿著這些思路，敲除不同的I型干擾素抑制因子會(huì)產(chǎn)生毒力減弱的ASFV毒株，且對(duì)攻毒產(chǎn)生保護(hù)作用。從ASFV BA71毒株（基因I型）中敲除CD2v基因的情況也是如此。然而，在ASFV基因Ⅷ型毒株上，同樣的敲除并沒(méi)有產(chǎn)生同等程度的毒力減弱。另一個(gè)常見(jiàn)的靶基因是B119L（9GL）。幾種主要的毒株顯示出毒力衰減和保護(hù)作用，但ASFV基因Ⅱ型格魯吉亞（Georgia）分離株存在問(wèn)題。對(duì)于ASFV格魯吉亞分離株，通過(guò)額外敲除DP96R（UK）基因 實(shí)現(xiàn)了毒力完全減毒。然而，一個(gè)重要的教訓(xùn)是，ASFV的遺傳背景會(huì)影響基因缺失突變體的表型。

Reis等再次證明，合理的基因缺失并不總會(huì)產(chǎn)生想要的效果。為了提高ASFV OURT88/3株的安全性，相關(guān)研究人員敲除了I329L基因——一個(gè)以前被證明可以抑制宿主先天性免疫反應(yīng)的基因，并在體外對(duì)ASFV OURT88/3ΔI329L株進(jìn)行了測(cè)試，以評(píng)估I型干擾素（interferon，IFN）的復(fù)制和表達(dá)情況，同時(shí)還進(jìn)行了豬體內(nèi)免疫和攻毒試驗(yàn)。雖然ASFV OURT88/3ΔI329L株保持著原有的復(fù)制特性，但I(xiàn)FN-β和IFN-α的表達(dá)量增加。出乎意料的是，對(duì)用ASFV強(qiáng)毒株URT88/1株攻毒后產(chǎn)生的保護(hù)作用急劇下降。有趣的是，僅僅敲除I329L基因無(wú)法減弱ASFV格魯吉亞/2007株的毒力。

最近，Chen等提出了一種缺失7個(gè)基因的ASFV減毒活疫苗候選株。該候選株被命名為ASFV HLJ/18-7GD株，基于中國(guó)ASFV強(qiáng)毒株HLJ/18株，敲除了編碼MGF505-1R蛋白、MGF505-2R蛋白、MGF505-3R蛋白、MGF360-12L蛋白、MGF360-13L蛋白、MGF360-14L蛋白和CD2v（EP402R）蛋白的基因。據(jù)報(bào)道，這種疫苗候選株的毒力在豬體內(nèi)完全減弱，并能對(duì)毒力強(qiáng)的ASFV HLJ/18株的攻毒（肌內(nèi)注射和口服）提供劑量依賴(lài)性免疫保護(hù)作用。更詳細(xì)地說(shuō)，所有用低劑量（103 TCID50） ASFV HLJ/18-7GD株免疫的豬（n=4），在攻毒后出現(xiàn)3～9 d的發(fā)熱癥狀;而高劑量（n=4，105 TCID50）組只有1頭豬發(fā)燒1 d，所有豬均在21 d的觀察期中存活下來(lái)。給6頭豬肌內(nèi)注射107 TCID50，連續(xù)傳代后，沒(méi)有產(chǎn)生陽(yáng)性樣本，盲傳代也沒(méi)有出現(xiàn)傳播。接種107.7 TCID50，并依次撲殺后，僅在一些豬的淋巴結(jié)中檢測(cè)到ASFV的DNA。此外，候選疫苗株對(duì)妊娠母豬安全。免疫力的持續(xù)時(shí)間呈高度劑量依賴(lài)性。雖然高劑量能夠提供長(zhǎng)期的保護(hù)，但在最后一次接種80 d后，中等劑量的雙倍疫苗接種已經(jīng)不能提供完全的保護(hù)。缺乏長(zhǎng)期保護(hù)的觀察結(jié)果與Sánchez-Cordón等獲得的研究結(jié)果相一致。在后一項(xiàng)研究中，Sánchez-Cordón等用ASFV OURT88/3株或BeninΔMFG株給豬進(jìn)行單次肌內(nèi)注射免疫后，沒(méi)有觀察到長(zhǎng)期保護(hù)作用。免疫接種后130 d進(jìn)行攻毒，所有豬發(fā)生急性ASF。免疫保護(hù)的持續(xù)時(shí)間仍然是ASF疫苗的一個(gè)弱點(diǎn)。因此，這方面需要開(kāi)展深入研究和闡明。

最近，Borca等推出了另一株候選疫苗株，即ASFV-G-ΔI177 L株。這個(gè)基于ASFV格魯吉亞株的候選疫苗株只有I177 L基因通過(guò)同源重組技術(shù)被敲除。在培養(yǎng)中，該ASFV變異株表現(xiàn)出生長(zhǎng)速度放慢（動(dòng)力學(xué)和產(chǎn)量）。ORF I177L編碼一個(gè)由177個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)的功能未知。用純化的該基因缺失突變體以102～106 TCID50劑量免疫一次豬，達(dá)50%血紅素吸附量（haemadsorbing doses 50%，HAD50），在28 d的觀察期里，接種豬臨床健康，雖然在整個(gè)觀察期檢測(cè)到了低至中等水平的病毒DNA載量，但沒(méi)有向哨兵豬排毒，并且在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)檢測(cè)到高水平的抗體。在免疫后28 d的肌內(nèi)注射攻毒中，所有接種豬在臨床上都保持健康。用定制的PCR方法檢測(cè)到了疫苗株，但未檢測(cè)到攻毒的毒株。只有低劑量組的一頭豬被檢測(cè)到低水平的攻毒毒株。正如Carlson等所述，通過(guò)間接全病毒ELISA方法檢測(cè)到的ASFV抗體水平與上述保護(hù)作用相關(guān)。

3.3 載體疫苗、DNA疫苗和亞單位疫苗

與減毒活疫苗相比，載體疫苗和亞單位疫苗具有更高的安全性，并可以區(qū)分野毒感染動(dòng)物和疫苗接種動(dòng)物。此外，疫苗生產(chǎn)通常不會(huì)依賴(lài)原代細(xì)胞。然而，由于缺乏有關(guān)保護(hù)性抗原及其潛在相互作用的知識(shí)，疫苗株的開(kāi)發(fā)受到了嚴(yán)重的影響。此外，亞單位疫苗不能用于野豬的口服接種（這需要采用活疫苗的方法）。

根據(jù)康復(fù)豬的血清學(xué)反應(yīng)，結(jié)構(gòu)蛋白p30（由CP204L基因編碼）、p54（E183L基因）、p72（B646L基因）、pp62（CP530R基因）和CD2v（EP402R基因）已成為合理設(shè)計(jì)疫苗株的主要靶蛋白，并在攻毒研究中對(duì)蛋白質(zhì)、DNA和病毒載體的ASFV疫苗株進(jìn)行了測(cè)試。此外，不同的疫苗設(shè)計(jì)也使用了生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的抗原。不幸的是，使用類(lèi)似抗原的結(jié)果并不總是結(jié)論性的。這種不一致性可歸因于多種因素，包括疫苗的類(lèi)型、接種策略、抗原和誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)，以及攻毒模型，包括動(dòng)物遺傳學(xué)、病毒毒株、疫苗接種和野毒攻毒的劑量等因素。大多數(shù)方法都沒(méi)有產(chǎn)生保護(hù)作用或部分保護(hù)作用。

例如，桿狀病毒表達(dá)p30蛋白、p54蛋白、p72蛋白和p22蛋白誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生具有中和能力的抗體，但對(duì)6頭免疫豬在第4次加強(qiáng)接種后用ASFV Pretoriuskop/96/4株（ASFV Pr4株）（攻毒劑量為10⁴TCID₅₀，肌內(nèi)注射）進(jìn)行同源攻毒后并沒(méi)有起到有效的預(yù)防作用。攻毒豬發(fā)病和出現(xiàn)病毒血癥的時(shí)間稍稍延后。相比之下，重組桿狀病毒在昆蟲(chóng)的體細(xì)胞和粉紋夜蛾（Trichoplusia ni）幼蟲(chóng)中表達(dá)的p30蛋白和p54蛋白形成的融合蛋白確實(shí)誘發(fā)了部分保護(hù)作用，并減弱了2頭豬的病毒血癥的嚴(yán)重程度，這2頭豬接種了5次疫苗，肌內(nèi)注射了500 TCID₅₀的ASFV E75株。豬接種重組的CD2v蛋白后出現(xiàn)了抗體反應(yīng)，并產(chǎn)生了劑量依賴(lài)性保護(hù)作用，在用400 TCID₅₀的ASFV E75株攻毒后，3頭豬產(chǎn)生了保護(hù)作用。高免疫劑量可以防止豬出現(xiàn)嚴(yán)重的臨床癥狀和可檢測(cè)水平的病毒血癥。

用p54蛋白、p30蛋白和CD2v蛋白胞外結(jié)構(gòu)域融合的DNA疫苗不會(huì)產(chǎn)生保護(hù)作用，除非與泛素融合。這種構(gòu)建體可保護(hù)一部分免疫過(guò)3次的豬（12頭豬中有3頭）免受ASFV E75（10⁴ HAU₅₀）株的致命攻擊。沿著這些思路，對(duì)表達(dá)文庫(kù)（expression library）采取了類(lèi)似的方法，60%的豬（n=5）2次免疫接種后在受到10⁴HAU₅₀ASFV E75株的攻擊時(shí)得到了部分或幾乎完全的保護(hù)。盡管有上述結(jié)果，但在使用CD2v蛋白、p30蛋白和p54蛋白進(jìn)行蛋白融合的DNA-初免（DNA-prime）時(shí)并沒(méi)有產(chǎn)生保護(hù)作用。在此項(xiàng)研究中，用包括ASFV質(zhì)粒DNA（CD2v、p72、p32、±p17）和重組蛋白（p15、p35、p54、±p17）的混合物對(duì)豬（n=5）進(jìn)行了3次免疫接種。接種疫苗的豬仍然感染ASFV Arm07株或發(fā)病。與未接種疫苗的對(duì)照組豬相比，接種疫苗的豬在受到ASFV強(qiáng)毒株的攻擊后，出現(xiàn)臨床癥狀、病毒血癥和死亡的時(shí)間更早。ASFV引發(fā)的病理變化在接種疫苗的豬上也更重。

使用γ干擾素酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)（enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT）對(duì)被ASFV免疫豬淋巴細(xì)胞識(shí)別的病毒蛋白進(jìn)行合理篩選，得到了由ASFV基因A151R、B646L（p72）、C129R、CP204L（p30）、CP530R（pp62）、E146L、I73R、I125L、L8L、M448R、MGF110-4L和MGF110-5L組成的基因庫(kù)。這些抗原在復(fù)制缺陷型人5型腺病毒（replication-deficient human adenovirus，rAd5）初始免疫和改良的痘苗病毒安卡拉株（modified vaccinia Ankara，MVA）增強(qiáng)免疫的引導(dǎo)下，在挑戰(zhàn)ASFV強(qiáng)毒株OUR T88/1分離株后，導(dǎo)致一部分豬的臨床癥狀減輕，病毒血癥嚴(yán)重程度下降。

例如，含有基因B646L（p72）、CP204L（p30）、CP530R（pp62）、E183L（p54）與成熟的p37產(chǎn)物和pp220多聚蛋白的兩段成熟p150蛋白（CP2475L基因）相組合的腺病毒載體疫苗，被證明可以誘導(dǎo)豬產(chǎn)生抗體和T細(xì)胞反應(yīng)，包括細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞。然而，攻毒感染顯示，相對(duì)于對(duì)照組，一些疫苗（使用9種抗原混合物的佐劑疫苗）有更嚴(yán)重的反應(yīng)，并且沒(méi)有產(chǎn)生明顯的保護(hù)作用。

最近，對(duì)35種合理設(shè)計(jì)的腺病毒載體介導(dǎo)的ASFV抗原在野豬體內(nèi)的免疫原性和有效性進(jìn)行了評(píng)估（n=9，按不同的時(shí)間表處理）。該混合物包含表達(dá)上述抗原的腺病毒和其他? ? ? 抗原，如EP153R、p10、p15、CP80R、I329L、H108R、K196R、CP312R、F334L、NP419L、NP868R、B66L、H339R和R298L，早先的研究證明這些抗原在家豬體內(nèi)具有免疫原性。其余的抗原（K145R、B385R、F165R、F778R、S273R、MGF100-1 L、A224L、MGF505-6R和B175L）是根據(jù)假定的T細(xì)胞表位選擇的。挑戰(zhàn)是按照“排毒者-豬攻毒-暴露感染”模型進(jìn)行的，在兩個(gè)排毒者中肌內(nèi)接種進(jìn)行10 HAU50。綜上所述，在用ASFV Arm07攻毒時(shí)沒(méi)有觀察到保護(hù)作用。所有的免疫豬都出現(xiàn)了ASF的臨床癥狀和病理變化。

Goatley等最近證明，當(dāng)由復(fù)制缺陷型人5型腺病毒（初次免疫）和改良的痘苗病毒安卡拉株（加強(qiáng)免疫）引導(dǎo)時(shí)，由8種ASFV抗原組成的抗原庫(kù)可以在ASFV基因I型分離株攻毒后保護(hù)豬免受致命疾病的影響。該實(shí)驗(yàn)是早先研究的后續(xù)研究，該研究證明不同的抗原具有免疫原性，但在采用DNA疫苗初次免疫（DNA prime）/牛痘疫苗加強(qiáng)免疫（vaccinia boost）的免疫策略——“prime-boost”免疫方案——時(shí)沒(méi)有保護(hù)作用。保護(hù)性抗原混合物含有B602L基因、B646L（p72）基因、CP204L（p30）基因、E183L（p54）基因、E199L（富半胱氨酸蛋白）基因、EP153R（凝集素樣蛋白）基因、F317L基因和MGF505-5R基因的產(chǎn)物。該制劑根本不是有效的疫苗，因?yàn)樗薪臃N豬在臨床上都出現(xiàn)了癥狀，并顯示出相當(dāng)嚴(yán)重的病毒血癥，但這種方法在抗原選擇和證明DIVA兼容的亞單位疫苗可提供保護(hù)方面具有應(yīng)用前景。遺憾的是，以上研究同樣不能推斷出保護(hù)作用的明確相關(guān)因素。

綜上所述，針對(duì)ASF的病毒載體疫苗是一種可行的方法，然而，抗原的選擇是成功的關(guān)鍵，目前仍缺少有說(shuō)服力的候選疫苗株。

3.4 疫苗的商業(yè)化及其實(shí)施

目前，頭條新聞和推特相繼報(bào)道了潛在的疫苗候選株，它們都是作為成功的案例被推出的，并暗示疫苗在短期內(nèi)是有效的。然而，由于缺乏有效數(shù)據(jù)，存在安全性問(wèn)題，以及消費(fèi)者擔(dān)憂(yōu)，并非所有（或者說(shuō)，幾乎沒(méi)有）候選疫苗都適合作為一種高度有效的短期工具來(lái)控制法定動(dòng)物傳染病，而且對(duì)于迄今為止提出的所有改良的候選疫苗株，由于缺乏能夠確保病毒在標(biāo)準(zhǔn)化條件下復(fù)制和生產(chǎn)的永久性細(xì)胞系，疫苗的生產(chǎn)將受到嚴(yán)重影響。所有報(bào)道的新的和有希望的候選疫苗株都依賴(lài)于原代細(xì)胞進(jìn)行生產(chǎn)，這導(dǎo)致疫苗的生產(chǎn)既不安全也不 可行。

此外，野豬需要一種基于誘餌的活疫苗。如果這種疫苗株用于野外接種，則需要大量安全性方面的數(shù)據(jù)。目前為止這方面的研究非常罕見(jiàn)。

預(yù)防ASF的疫苗一旦獲得成功開(kāi)發(fā)，它們也只能是控制ASF的一個(gè)工具。免疫接種需被納入ASF控制和預(yù)防策略中。在不太理想的條件下，利用疫苗根除疾病的效果很有限，一個(gè)例子是經(jīng)典豬瘟：雖然豬接種豬瘟兔化弱毒活疫苗后能夠產(chǎn)生很高的抗體水平，且非常安全，該疫苗可能是預(yù)防動(dòng)物疾病的最佳疫苗之一，但迄今為止，亞洲一些國(guó)家仍然無(wú)法根除豬瘟。疫苗不能代替生物安全、行為改變、良好的管理、診斷方法和有針對(duì)性的撲殺措施。

3.5 差距和進(jìn)一步研究的方向

需要進(jìn)行ASFV病毒學(xué)和功能基因組學(xué)研究，用重要的額外數(shù)據(jù)集（如蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能）來(lái)支撐疫苗的研究開(kāi)發(fā)。

需要采用統(tǒng)一的攻毒模型，以利用免疫或攻毒試驗(yàn)比較候選疫苗株。

必須制定與實(shí)驗(yàn)性減毒活疫苗有關(guān)的安全特征和最低標(biāo)準(zhǔn)，并在這方面達(dá)成共識(shí)。可能需要一個(gè)藥典章節(jié)。

應(yīng)為疫苗生產(chǎn)開(kāi)發(fā)能使ASFV生長(zhǎng)或促進(jìn)ASFV生長(zhǎng)但不會(huì)導(dǎo)致其基因發(fā)生重大改變的基因。

基因缺失的ASFV變異株是主要的疫苗候選株，應(yīng)進(jìn)行更深入的研究和開(kāi)發(fā)。

4? 展望

未來(lái)，非洲豬瘟的防控必須更加注重傳統(tǒng)的控制措施，如早期檢測(cè)、嚴(yán)格的衛(wèi)生和生物安全措施、撲殺感染豬群、補(bǔ)償損失、暫停措施、流行病學(xué)追蹤和野豬控制計(jì)劃。這是特別必要的，因?yàn)槎唐趦?nèi)可能無(wú)法開(kāi)發(fā)出一種可大量生產(chǎn)并可用于野生動(dòng)物群的合適、安全且有效的疫苗。因此，未來(lái)的研究應(yīng)該集中在填補(bǔ)本綜述所列出的空白上。

原題名：African swine fever – A review of current knowledge（英文）

原作者：Sandra Blome、Kati Franzke和Martin Beer