痛舒膠囊臨床最大耐受劑量實(shí)驗(yàn)中4種成分藥物濃度測(cè)定方法建立

趙高瓊 劉紅斌 崔佳麗 梅晶 周藝佳 王京昆

【摘 要】 目的：建立痛舒膠囊中指標(biāo)性成分梔子苷、人參皂苷Rg1、三七皂苷R1、人參皂苷Rb1在人血漿中的LC-MS/MS濃度檢測(cè)方法，并對(duì)該方法進(jìn)行驗(yàn)證，以經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的方法，對(duì)來(lái)自痛舒膠囊臨床MTD（最大耐受量）實(shí)驗(yàn)的血漿樣本進(jìn)行藥物濃度檢測(cè)，獲得志愿者口服給予痛舒膠囊后體內(nèi)的藥物濃度水平。方法：色譜柱：Waters SunFire C18（4.6mm×150mm，5μm）;流動(dòng)相：A 為0.01%甲酸水，B 為甲醇;梯度洗脫：0～1min，90% A;1～8min，90%～10% A;8～10min，10% A;10～10.5min，10%～90% A;10.5～15min，90% A。流速：1mL/min。柱溫：20℃;進(jìn)樣量：10μL。離子源：ESI 源，正離子模式，MRM 掃描。結(jié)果：梔子苷、人參皂苷Rg1、三七皂苷R1、人參皂苷Rb1及內(nèi)標(biāo)鹽酸普萘洛爾提取離子色譜圖與血漿中內(nèi)源性雜質(zhì)互不干擾。以鹽酸普萘洛爾為內(nèi)標(biāo)，梔子苷、人參皂苷Rg1、三七皂苷R1、人參皂苷Rb1的檢測(cè)范圍分別為252～8100ng/mL、26.8～858ng/mL、32.8～1050ng/mL、11.2～361ng/mL。各成分日內(nèi)精密度與日間精密度RSD≤15%，準(zhǔn)確度分別在85%～115%之間，提取回收率在61.05%～96.54%之間?；|(zhì)對(duì)4個(gè)成分各濃度間的影響基本一致。結(jié)論：該方法快速、靈敏、重復(fù)性好，可用于痛舒膠囊中4 種有效成分在人體內(nèi)的MTD試驗(yàn)樣本藥物濃度檢測(cè)。

【關(guān)鍵詞】 痛舒膠囊;梔子苷;人參皂苷Rg1;三七皂苷R1;人參皂苷Rb1

【中圖分類號(hào)】R284.1 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2022）13-0021-05

The Method of Determination of the concentration of 4 ingredients in the clinical MTD experiment of Tongshu capsule

ZHAO Gaoqiong1，2 LIU Hongbin1，2 CUI Jiali1，2 MEI Jing1，2 ZHOU Yijia1，2 WANG Jingkun1，2*

1.Yunnan Institute of Materia Medica，Kunming 650111，China;2.Yunnan Province Company Key Laboratory for TCM and Ethnic Drug of New Drug Creation，Kunming 650111，China

Abstract：

Objective To establish a method that detect the concentration of major components：geniposide， ginsenoside Rg1， notoginsenoside R1 and ginsenoside Rb1 of Tongshu capsule in human plasma utilizing LC-MS/MS， then validate this methodology. With proven methods， detecting drug concentration in plasma samples form volunteers that experienced clinical MTD（Maximum Tolerance Dose） experiment， Tongshu capsule dosed orally.Methods The chromatographic column： Waters Sun Fire C18（4.6mm×150mm， 5μm）. Mobile phase： A is 0.01% formic water， B is methanol. Gradient elution： 0-1min， 90%A; 8-10min，10% A;10-10.5min， 10%-90% A; 10.5-15min， 90% A. Flow rate：1mL·min-1.Column temperature： 20℃. Injection volume： 10μL. Ion source： ESI， positive ion mode， MRM scan.Results The ion chromatograms of geniposide， ginsenoside Rg1， notoginsenoside R1， ginsenoside Rb1 and internal standard of Propranolol hydrochloride were not interfered with the endogenous impurities in the plasma. The detection ranges of Geniposide， ginsenoside Rg1， notoginsenoside R1 and ginsenoside Rb1 were 252-8100ng/mL， 26.8-858ng/mL， 32.8-1050ng/mL and 11.2-361ng/mL. Respectively， The inday precision and day precision RSD of each component was ≤15%， the accuracy ranged from 85% to 115%， and the extraction recovery ranged from 61.05% to 96.54%. The effects of substrate on the concentrations of the four components were basically consistent.Conclusion This method is rapid， sensitive and reproducible， and can be used to detect the concentration of 4 active ingredients in tongshu capsule in human MTD test samples.

Key words：Tongshu Capsule; Gardenin; Ginsenoside Rg1; Notoginsenoside R1; Ginsenoside Rb1

痛舒膠囊是根據(jù)云南彝族經(jīng)驗(yàn)方開(kāi)發(fā)的民族藥，其主要由七葉蓮、三七、梔子、燈盞細(xì)辛、玉葡萄根、珠子參等八味中藥組方而成，具有活血化瘀，舒筋活絡(luò)，化痞散結(jié)，消腫止痛的功效。臨床常用于治療關(guān)節(jié)炎[1] 、肩周炎[2]、頸源性頭痛[3-4]、乳腺增生[5]等。由于制劑中三七具有活血作用，且在制劑中占比最大，含量最高，故選擇三七中的三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1為指標(biāo)性成分，同時(shí)再選擇具有消腫作用的梔子中的特征性成分梔子苷為指標(biāo)性成分，建立這4種成分在人體內(nèi)藥物濃度測(cè)定方法，開(kāi)展痛舒膠囊在人體內(nèi)的特征性多指標(biāo)成分體內(nèi)藥代研究。

1 儀器與材料

1.1 儀器 美國(guó)Agilent-ABI三重四級(jí)桿液質(zhì)聯(lián)用儀（安捷倫公司）、Allegra 64R高速冷凍臺(tái)式離心機(jī)（Beckman公司）、SK8200LHC超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）、XW-80渦旋混合器（上海精科實(shí)業(yè)有限公司）、MD200氮?dú)獯祾邇x（杭州奧盛儀器有限公司）、DV215CD電子天平（OHAUS）。96孔板固相萃取裝置、96孔固相萃取板（Oasis HLB μElution Plate 30μm）均購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)waters公司。

1.2 材料 對(duì)照品梔子苷（簡(jiǎn)稱Gen，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110749-201316）、人參皂苷Rg1（簡(jiǎn)稱Rg1，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110703-201529）、三七皂苷R1（簡(jiǎn)稱R1，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110745-201318）、人參皂苷Rb1（簡(jiǎn)稱Rb1，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110704-201424）均購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所。鹽酸普萘洛爾（簡(jiǎn)稱Pro，Sigma公司，美國(guó)，批號(hào)：BCBJ2807V）。甲醇（Merck公司，美國(guó)，色譜純）、甲酸（上海阿拉丁生化科技有限公司，色譜純）。水為超純水（Millipore純水，超純水系統(tǒng)制備）。

1.3 藥品 痛舒膠囊（規(guī)格為0.3g/粒，批號(hào)：SMA1501，云南白藥集團(tuán)股份有限公司）。

2 方法

2.1 對(duì)照品溶液及內(nèi)標(biāo)溶液配制

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照品溶液的配制 精密稱取Gen、Rg1、R1、Rb1對(duì)照品，配制成濃度分別為0.243、0.231、0.253、0.260mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照品儲(chǔ)備液，2～8℃保存，備用。取Gen、Rg1、R1、Rb1標(biāo)準(zhǔn)曲線用對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，配制得到濃度分別為81.0、8.57、10.5、3.60μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液，并用甲醇逐級(jí)稀釋（每級(jí)稀釋倍數(shù)為2倍，共稀釋5次）得到6級(jí)不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液。

2.1.2 質(zhì)控對(duì)照品溶液的配制 精密稱取Gen、Rg1、R1、Rb1對(duì)照品，配制成濃度分別為0.217、0.194、0.207、0.205mg/mL的質(zhì)控用對(duì)照品儲(chǔ)備液，2～8℃保存，備用。取Gen、Rg1、R1、Rb1質(zhì)控用對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，配制得到濃度分別為72.3、7.20、8.40、2.85μg/mL的高濃度混合質(zhì)控工作液，并用甲醇逐級(jí)稀釋得到濃度分別為18.1、1.80、2.10、0.712μg/mL的中濃度混合質(zhì)控工作液及濃度分別為4.52、0.450、0.525、0.178μg/mL的低濃度混合質(zhì)控工作液。

2.1.3 內(nèi)標(biāo)溶液的配制 精密稱取Pro對(duì)照品6.59mg，置于適量容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，得到濃度0.659mg/mL的內(nèi)標(biāo)對(duì)照品儲(chǔ)備液，2～8℃保存，備用。取適量Pro內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，加入適量甲醇，稀釋得到濃度為110ng/mL的內(nèi)標(biāo)工作液。

2.2 血漿樣品處理方法 固相萃取板分別以300μL甲醇、300μL超純水活化，備用。取不同濃度的混合對(duì)照品溶液及內(nèi)標(biāo)工作液各10μL于離心管中，氮?dú)獯蹈?。加?00μL空白人血漿，渦旋混勻，加入100μL 20%的甲酸，漩渦混勻2min后轉(zhuǎn)移至固相萃取板中，分別以200μL超純水淋洗，200μL甲醇洗脫，甲醇洗脫液10μL進(jìn)樣。

2.3 LC-MS/MS檢測(cè)方法

2.3.1 液相色譜條件 Waters SunFire C18色譜柱（5μm，150mm×4.6mm）;流動(dòng)相：0.01%甲酸水A-甲醇B，梯度洗脫，0～1min，90% A;1～8min，90%～10% A;8～10min，10% A;10～10.5min，10%～90% A;10.5～15min，90% A，流速：1mL/min。柱溫：20℃;進(jìn)樣量：10μL。

2.3.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子化（ESI），正離子模式。多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）定量：Gen，[M+Na]+，m/z：411.10/217.00;Rg1，[M+Na]+，m/z：823.40/203.20;R1，[M+Na]+，m/z：955.60/775.50;Rb1，[M+Na]+，m/z：1131.50 /365.10;Pro，[M+H]+，m/z：260.20/183.10。質(zhì)譜參數(shù)CUR：20.00;IS：5500.00;TEM：500.0℃;GS1：50.00;GS2：50.00;CAD：Mediμm;Interface Heater（ihe）：on。

3 結(jié)果

3.1 專屬性 按照“2.2”項(xiàng)下方法處理，分別得到空白離子色譜圖、含標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)的離子色譜圖及未知濃度血漿樣品離子色譜圖。結(jié)果表明，Gen、Rg1、R1、Rb1及Pro提取離子色譜圖與血漿中內(nèi)源性雜質(zhì)互不干擾。結(jié)果如圖1所示。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量范圍 按照“2.2”項(xiàng)下方法處理，得到不同濃度系列的進(jìn)樣溶液，測(cè)定得到待測(cè)成分與內(nèi)標(biāo)的峰面積。以各待測(cè)成分的濃度為橫坐標(biāo)，待測(cè)成分與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，所有待測(cè)成分的線性關(guān)系良好（r>0.95），定量范圍較寬，定量限低，所有定量下限均滿足S/N≥10。其中，Gen、Rg1、R1、Rb1 3個(gè)批次所測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)（r）平均值分別為為0.9954、0.9978、0.9965、0.9928，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.12%、0.05%、0.48%、0.48%;斜率的平均值分別為4.40×10-2、5.72×10-3、2.06×10-3、13.1×10-3，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為17.38%、12.77%、14.43%、4.64%;標(biāo)準(zhǔn)曲線上各點(diǎn)的準(zhǔn)確度均符合要求;線性范圍分別為252～8100ng/mL、26.8～857ng/mL、32.8～1050ng/mL、11.2 ～360ng/mL。

3.3 殘留率 按照“2.2”項(xiàng)下方法處理，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線最高濃度點(diǎn)的進(jìn)樣溶液及空白血漿溶液，平行處理6份，按“最高濃度點(diǎn)樣品-空白血漿樣品”次序交叉測(cè)定所有制備的樣品，各空白血漿中待測(cè)成分Gen、Rg1、R1、Rb1及內(nèi)標(biāo)Pro的峰面積與定量下限樣品測(cè)定峰面積的比值，其中待測(cè)成分殘留率均小于20%，內(nèi)標(biāo)殘留率小于5%，滿足試驗(yàn)要求。

3.4 精密度、準(zhǔn)確度 取定量下限、低、中、高4個(gè)濃度的的加標(biāo)血漿，按照“2.2”項(xiàng)下方法分別處理得到4個(gè)濃度的進(jìn)樣溶液，每個(gè)濃度處理3批次，每批次每個(gè)濃度平行處理6份，計(jì)算日內(nèi)精密度、日間精密度及準(zhǔn)確度。結(jié)果表明，痛舒膠囊中4種入血成分的日內(nèi)精密度、日間精密度RSD≤15%，定量下限準(zhǔn)確度均在80%～120%之間，質(zhì)控樣品準(zhǔn)確度均在85%～115%之間，符合試驗(yàn)要求。見(jiàn)表1。

3.5 回收率 按照“2.2”項(xiàng)下方法平行處理6份低、中、高3個(gè)濃度的加標(biāo)血漿，得提取后的進(jìn)樣溶液。再取相同濃度的混標(biāo)溶液，平行6份，得未提取的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)樣溶液。分別測(cè)定12個(gè)進(jìn)樣溶液。計(jì)算提取后進(jìn)樣溶液與未提取進(jìn)樣溶液測(cè)定濃度的比值，得到提取回收率。結(jié)果痛舒膠囊中4個(gè)入血成分Gen、Rg1、R1、Rb1不同濃度間的平均回收率分別為91.65%、64.39%、84.72%、86.11%，回收率在61.05%～96.54%之間，各入血成分各濃度間回收率RSD均≤15%，符合試驗(yàn)要求。

3.6 基質(zhì)效應(yīng) 按照“2.2”項(xiàng)下方法，平行6個(gè)不同個(gè)體的人空白血漿，每個(gè)個(gè)體平行處理3份，得到18份空白基質(zhì)樣品。離心管中分別加入低、中、高濃度混合標(biāo)準(zhǔn)溶液及內(nèi)標(biāo)溶液，氮?dú)獯蹈?，加入空白基質(zhì)復(fù)溶，得到含基質(zhì)的進(jìn)樣溶液，每個(gè)濃度平行處理6份。再取相同濃度的混標(biāo)溶液，平行6份，得不含基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)樣溶液。計(jì)算歸一化基質(zhì)效應(yīng)因子。結(jié)果顯示人血漿對(duì)Gen、Rg1、R1、Rb1各濃度間的基質(zhì)影響均較小，且影響程度均基本一致，基質(zhì)效應(yīng)RSD均≤15%，滿足試驗(yàn)要求。

3.7 血漿樣品及進(jìn)樣溶液穩(wěn)定性 按照“2.2”項(xiàng)下方法，處理低、高兩個(gè)濃度的質(zhì)控樣品，每個(gè)濃度平行6份，室溫放置5d后進(jìn)樣。制備低、高兩個(gè)濃度的加標(biāo)血漿樣品，分別于室溫放置6h、-80℃放置164d、-80℃放置164d且反復(fù)凍融3次后按照“2.3”項(xiàng)下方法處理進(jìn)樣，每個(gè)濃度平行6份。結(jié)果表明含藥血漿可在室溫穩(wěn)定放置6h、-80℃放置164d、可反復(fù)凍融3次，進(jìn)樣溶液可室溫穩(wěn)定放置5d，穩(wěn)定性考察條件滿足試驗(yàn)需求。見(jiàn)表3。

綜上，本試驗(yàn)條件下，所建立的HPLC-MS/MS法能用于對(duì)來(lái)自于臨床MTD的所有人血漿樣本中梔子苷、人參皂苷Rg1、三七皂苷R1、人參皂苷Rb1的檢測(cè)，該方法靈敏度高、重現(xiàn)性好、穩(wěn)定性高。

4 討論

由于人血漿中基質(zhì)比較復(fù)雜，基質(zhì)可隨目標(biāo)成分共提出或共流出，對(duì)前期摸索階段建立的分析方法造成干擾，基質(zhì)效應(yīng)對(duì)不同濃度間目標(biāo)成分影響差異較大。為排除基質(zhì)對(duì)分析檢測(cè)的影響，首先優(yōu)化含藥血漿樣品處理方法。通過(guò)對(duì)不同提取方法的考察后篩選出對(duì)不同濃度間目標(biāo)成分影響較小的固相萃取法為樣品前處理方法。然后又對(duì)固相萃取法洗脫溶劑、溶劑洗脫比例、溶劑洗脫體積等因素進(jìn)行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有基質(zhì)能隨洗脫溶劑甲醇共流出，無(wú)法通過(guò)樣品前處理方法完全排除基質(zhì)對(duì)分析檢測(cè)的干擾。因此，為徹底排除基質(zhì)對(duì)分析檢測(cè)的影響，本實(shí)驗(yàn)同步優(yōu)化分析檢測(cè)方法，選擇柱長(zhǎng)為150mm的色譜柱對(duì)隨目標(biāo)成分共流出的基質(zhì)進(jìn)行分離，通過(guò)調(diào)整流動(dòng)相比例、流動(dòng)相梯度、流動(dòng)相種類等方式實(shí)現(xiàn)對(duì)基質(zhì)的分離，從而保證基質(zhì)效應(yīng)對(duì)樣品分析檢測(cè)影響的一致性。

在試驗(yàn)過(guò)程中，血漿樣品及進(jìn)樣溶液穩(wěn)定性僅對(duì)低濃度及高濃度質(zhì)控進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證濃度能覆蓋痛舒膠囊臨床MTD血漿樣本中的濃度。根據(jù)樣品存放條件及時(shí)間，設(shè)置血漿樣品長(zhǎng)期穩(wěn)定性考察，考察周期為164d，考察周期可覆蓋血漿樣品的存放周期。

本次實(shí)驗(yàn)所選擇的檢測(cè)目標(biāo)物，均為原型化合物，由于中藥復(fù)方的復(fù)雜性，這一階段并未對(duì)其可能的代謝產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，這些化合物有可能在進(jìn)入人體后發(fā)生代謝轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致原型化合物難以被跟蹤到[6-8]，后續(xù)試驗(yàn)將提高儀器靈敏度，或?qū)υ突衔锛按x產(chǎn)物進(jìn)行研究分析，以揭示痛舒膠囊的體內(nèi)吸收過(guò)程。

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（收稿日期：2011-11-08 編輯：陶希睿）