外泌體在骨關(guān)節(jié)炎免疫調(diào)控中的作用研究進展

蔣環(huán)宇，周炎

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院骨科，湖北 武漢 430060)

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是現(xiàn)如今最常見的老年病、慢性病之一，65歲以上的人群OA總體患病率高達50%以上，且隨著人類預(yù)期壽命的增長，可以預(yù)見其患病率將呈現(xiàn)上升趨勢[1]。外泌體是一種活細胞內(nèi)具有分泌功能的囊性小泡，直徑為30～200 nm，能攜帶蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和遺傳物質(zhì)，在體內(nèi)進行生物信息傳輸，具備多種生物活性[2]。外泌體所建立的細胞間囊泡交流途徑在人類健康與疾病的許多方面都發(fā)揮了重要的作用[3]，涵蓋人體的生長發(fā)育[4]、免疫組化[5]、細胞穩(wěn)態(tài)[6]、癌癥[7]等方面。

由于OA發(fā)病率及致殘率高，對于人們運動功能和生活質(zhì)量的影響與日俱增，還會導(dǎo)致高額的醫(yī)療保健和社會成本，為個人與社會帶來沉重的經(jīng)濟負擔(dān)。隨著社會人口老齡化加重，可以預(yù)見該問題造成的嚴(yán)重影響。膝骨關(guān)節(jié)炎目前已經(jīng)成為我國50歲以上男性喪失勞動能力的第二大疾病[8]。外泌體作為近年來備受矚目的分子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)載體，其在病理生理調(diào)控方面發(fā)揮著重要作用，對于OA的治療有著不容小覷的價值[9]。本文將對外泌體在OA免疫調(diào)控過程中發(fā)揮作用的研究進展作一綜述。

1 外泌體的特性

由于來源細胞、環(huán)境、發(fā)育階段、表觀遺傳修飾和精細的生物發(fā)生機制等因素造成的差異，外泌體的分子組成各不相同，但其在許多特性上仍有相通之處。

1.1 外泌體的結(jié)構(gòu) 通常而言，外泌體是由包裹在外部的“殼”和內(nèi)部攜帶的“貨物”組成的。外泌體膜的表面有膽固醇、鞘磷脂和神經(jīng)酰胺等物質(zhì)構(gòu)成的涂層，該涂層有利于外泌體在細胞質(zhì)中的運輸。外泌體的“殼”呈現(xiàn)出脂筏的特征[10]。此外，外泌體表面還含有多種類型的蛋白標(biāo)記物，例如CD9、CD63、CD82、CD81、熱休克蛋白、主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)等[11]，其中TSG101蛋白還能與泛素化的貨物蛋白相結(jié)合，成為細胞對外泌體進行分選和檢測的標(biāo)志物之一。

在研究的早期階段，外泌體中的內(nèi)容物被認(rèn)為是無用的細胞代謝廢物，后來隨著分離提純技術(shù)的進步和研究的深入，人們逐漸意識到外泌體攜帶著豐富的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和遺傳物質(zhì)，包括信使RNA(messenger RNA，mRNA)、微小RNA(microRNA，miRNA)和較長的非編碼RNA，它們在細胞間通信和細胞免疫調(diào)控中扮演著非常重要的角色。

1.2 外泌體的生物發(fā)生和釋放 外泌體的生物發(fā)生和釋放是一個復(fù)雜的過程。外泌體主要來源于內(nèi)體，而內(nèi)體又源于細胞質(zhì)膜的內(nèi)吞作用，即先由細胞質(zhì)膜限制性向內(nèi)出芽構(gòu)成外泌體的雛形，隨后經(jīng)過一系列生物分子的加工才形成完整的外泌體。這些分子主要包括內(nèi)吞體分選轉(zhuǎn)運復(fù)合體(endosomal sorting complex required for transport，ESCRT)、Alix(也稱為重組人程序性細胞死亡6互作蛋白，programmed cell death 6-interacting protein，PDCD6IP)、磷脂酶、液泡分選蛋白4(vacuolar protein sorting 4，Vps4)、Rab GTPase激活蛋白(RabGTPase-activating proteins，RabGAPs)、鞘磷脂酶和神經(jīng)酰胺[12]。在大多數(shù)細胞中，ESCRT是外泌體生成和釋放的核心機制，若人為阻斷該復(fù)合體的組成，外泌體的生成及釋放便會受到影響。ESCRT由許多胞質(zhì)蛋白組成，這些蛋白被稱為ESCRT-0、ESCRT-Ⅰ、ESCRT-Ⅱ和ESCRT-Ⅲ，前三者負責(zé)識別內(nèi)體上泛素化的膜蛋白，ESCRT-Ⅲ則參與外泌體囊泡的萌發(fā)和分離。但在某些細胞中，外泌體的形成不需要借助該機制，而是依賴于鞘磷脂酶(一種產(chǎn)生神經(jīng)酰胺的酶)。

外泌體的釋放主要有三種方式(見圖1)[2，13]：(1)經(jīng)由囊泡萌發(fā)成的多囊體可含有許多外泌體，與細胞質(zhì)膜融合時將其釋放；(2)細胞質(zhì)膜可直接出芽立即釋放外泌體；(3)外泌體可儲存在細胞內(nèi)與細胞質(zhì)膜連接的區(qū)室中(intracellular plasma membrane-connected compartments，IPMCs)，通過解除IPMC的出口限制便能達到延遲釋放外泌體的效果。而一些在細胞和動物模型上進行的研究發(fā)現(xiàn)，外泌體的釋放可以經(jīng)持續(xù)激活雷帕霉素靶蛋白復(fù)合體1(mechanistic target of rapamycin complex 1，mTORC1)進行抑制，而與之相對地抑制mTORC1也會促進外泌體的釋放，這兩個過程都會伴隨細胞的自噬[14]。

圖1 外泌體釋放的三種方式

1.3 外泌體與免疫調(diào)控 在1996年免疫學(xué)家初次發(fā)現(xiàn)，經(jīng)EB病毒(epstein-barr virus，EBv)轉(zhuǎn)化的B淋巴細胞能夠通過多囊體與細胞質(zhì)膜融合的方式來釋放外泌體。在之后的研究里，許多免疫和非免疫細胞都被發(fā)現(xiàn)具有釋放外泌體的功能，包括T細胞、B細胞、樹突狀細胞(dendritic cell，DC)和巨噬細胞，這些細胞釋放的外泌體已被證明可以介導(dǎo)免疫刺激或免疫調(diào)控[15]。外泌體的免疫活性可影響先天免疫和獲得性免疫的許多環(huán)節(jié)，包括抗原提呈、T細胞激活、T細胞極化為調(diào)節(jié)性T細胞、免疫抑制和抗炎作用等。

經(jīng)由外泌體呈遞的抗原在刺激和增強免疫反應(yīng)方面起著重要作用。其中，專業(yè)抗原提呈細胞[(antigen presenting cell，APC)，包括單核-巨噬細胞、B淋巴細胞、DC]分泌的外泌體富含MHC-I、Ⅱ類復(fù)合物和共刺激分子，它們具有的抗原肽在免疫調(diào)控的過程中功不可沒[16]。

2 骨關(guān)節(jié)炎

OA是一種多因素引起的退行性骨關(guān)節(jié)疾病，OA的特征表現(xiàn)為進行性關(guān)節(jié)軟骨退變，伴發(fā)疼痛，最終導(dǎo)致患者關(guān)節(jié)功能受損[17]。傳統(tǒng)的觀點認(rèn)為，OA是由異常的關(guān)節(jié)負荷和力學(xué)作用共同導(dǎo)致的病理反應(yīng)，即一種“磨損”的生物力學(xué)過程。隨著研究的深入，越來越多的證據(jù)表明，輕度的滑膜炎癥反應(yīng)是OA發(fā)生及進展的重要促發(fā)因素。

正常關(guān)節(jié)滑膜分為兩層，為血管層(內(nèi)膜下層)和細胞層(內(nèi)腔層)，其功能是在關(guān)節(jié)內(nèi)產(chǎn)生滑液，減少關(guān)節(jié)軟骨的摩擦系數(shù)。通常內(nèi)膜下層較厚，是由致密的纖維組織、Ⅰ型膠原及脂肪組織組成，包含淋巴管、神經(jīng)纖維和微血管。而內(nèi)腔層較薄，包含有滑膜成纖維細胞、滑膜巨噬細胞。在OA發(fā)展的過程中，滑膜的主要病理改變有內(nèi)腔層增生、間質(zhì)纖維化和新生血管形成，并伴有巨噬細胞、T細胞、肥大細胞、B細胞、漿細胞及自然殺傷細胞(natural killer cell，NK)浸潤[18]。也有研究表明，在OA的早期階段，發(fā)現(xiàn)滑膜中巨噬細胞已經(jīng)大量浸潤[19]?？傊?，這些研究均提示OA發(fā)生及發(fā)展過程中存在許多免疫相關(guān)因素，包括關(guān)節(jié)軟骨的局部損傷，血管生成的增加，刺激巨噬細胞活化的損傷相關(guān)分子模式(damage associated molecular patterns，DAMPs)釋放，導(dǎo)致內(nèi)膜中巨噬細胞和淋巴細胞大量浸潤，增加了促炎細胞因子和趨化因子的釋放，以及軟骨細胞異常分泌金屬蛋白酶、促炎細胞因子和前列腺素，這些因素加劇了關(guān)節(jié)軟骨的破壞[20]。

3 外泌體在OA免疫調(diào)控中發(fā)揮的作用

無論是外泌體還是OA，都與人體的免疫調(diào)控關(guān)系密切，通過這條紐帶，外泌體的功能便可以加以利用，在OA治療過程中發(fā)揮作用。不同的外泌體被靶細胞攝入后，往往能發(fā)揮出不同的功能。外泌體既可以直接參與抗原的提呈從而與人體的免疫系統(tǒng)相互作用，又可以通過自身攜帶的miRNA引起細胞功能的變化，從而影響人體的免疫調(diào)控功能[21]。APC中的外泌體與OA的關(guān)系見圖2。除此之外，外泌體還能夠與攝入細胞的內(nèi)體相融合，從而自我降解或者重新被釋放到細胞外。

圖2 APC中的外泌體與OA關(guān)系圖

3.1 APC中的外泌體與OA

3.1.1 DC來源的外泌體與OA 針對外泌體免疫調(diào)控功能的研究，大部分都是從DC產(chǎn)生的外泌體開始的。時至今日，人們對于這種類型的外泌體已經(jīng)有了較為廣泛而深入的認(rèn)識。成熟DC來源外泌體攜帶有MHC-Ⅱ類分子和共刺激分子，如B7-2和細胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecular，ICAM-1)[16]，可以直接與T細胞相互作用，從而激活免疫系統(tǒng)。另一方面，未成熟DC來源外泌體不是通過直接激活T細胞，它們調(diào)節(jié)免疫功能的方式是通過將抗原分配給其他的APCs，來協(xié)助其進行抗原遞呈[22]，或者將MHC/抗原復(fù)合物遞呈給DC上的受體來間接誘導(dǎo)T細胞的激活，這種類型的外泌體也有助于Tc1 CD8+T細胞的極化。

與此同時，外泌體也和免疫抑制有關(guān)。未成熟DC分泌的外泌體相較于成熟DC，其表達的共刺激分子配體與黏附分子配體明顯減少，還會額外表達免疫抑制配體，如腫瘤轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor，TGF)-b、NKG2D(natural killer group 2D)和半乳糖凝集素9(Galectin-9)以及死亡配體，如CD95L(CD95 ligand)，可參與介導(dǎo)T細胞凋亡，降低T細胞免疫功能[23]，因此，未成熟DC來源的外泌體具有免疫抑制功能。在OA發(fā)生及發(fā)展的過程中，兩種DC的外泌體都可以誘導(dǎo)T細胞的激活，促進炎癥反應(yīng)，但未成熟DC細胞的外泌體在某種程度上還可以減輕軟骨關(guān)節(jié)炎癥細胞的浸潤，從而延緩軟骨退變[24]。

3.1.2 B淋巴細胞來源的外泌體與OA 相較于DC來源外泌體，學(xué)者對B淋巴細胞來源的外泌體研究尚不夠透徹。由外泌體介導(dǎo)的細胞間信號通訊，很多都發(fā)生在免疫調(diào)控系統(tǒng)中。其中，來源于B淋巴細胞的外泌體具有激活A(yù)PC的功能，這種影響在抗原注射后的早期便可以觀察到，這個時間點甚至早于DC來源的外泌體。B淋巴細胞是最早被發(fā)現(xiàn)能夠分泌囊泡的免疫細胞類型，這些囊泡攜帶有豐富的MHC-Ⅰ和Ⅱ類分子、B7-1(CD80)和B7-2(CD86)共刺激分子以及ICAM-1(CD54)黏附分子，因而可以參與抗原遞呈過程，激活CD4+T淋巴細胞[22]。B細胞來源的外泌體同樣能表達出MHC分子、共刺激分子和黏附分子，并能誘導(dǎo)抗原特異性MHC-Ⅱ類限制性T淋巴細胞反應(yīng)[25]。在OA發(fā)生的早期，滑膜炎癥反應(yīng)是由B淋巴細胞來源的外泌體誘導(dǎo)產(chǎn)生的[26-27]。

除此之外，通過檢測外泌體與細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)成分之間，以及與經(jīng)細胞因子處理后的成纖維細胞之間的黏附作用，來探究B細胞來源外泌體表達的整合素的功能。結(jié)果顯示，這類外泌體表達的整合素能夠介導(dǎo)ECM和細胞表面黏附分子的黏附作用，這可能是炎癥過程中機體遠距離傳輸黏附信號的一種新途徑。B淋巴細胞釋放的外泌體還可以使得C3片段沉積、T細胞反應(yīng)增強，這些作用都使得滑膜炎癥反應(yīng)加劇，成為OA病情進展的基礎(chǔ)[28]。

3.1.3 單核-巨噬細胞來源的外泌體與OA 針對細菌感染后巨噬細胞所分泌的外泌體的研究發(fā)現(xiàn)，這種外泌體通常對幼稚巨噬細胞具有促炎作用，還可誘導(dǎo)DC成熟，并激活CD4+和CD8+T細胞。此類外泌體可以呈遞細菌抗原，如糖肽脂(glycopeptidolipids，GPLs)和免疫原性蛋白，從而誘導(dǎo)DC成熟，刺激促炎細胞因子的分泌[22]。雖然來源于巨噬細胞的外泌體，主要作用于機體感染后的免疫系統(tǒng)，但這種抗原呈遞和免疫激活的過程，實際上是免疫細胞之間一種新的通訊方式。隨著關(guān)節(jié)軟骨的破壞，骨骼上會漸漸形成新的突起，稱為“骨贅”或“骨刺”，從而使局部處于一種長期慢性的炎癥狀態(tài)，經(jīng)由這種細胞通訊方式介導(dǎo)的免疫同樣會作用于此種炎癥狀態(tài)[29]。

另一項研究提取OA患者滑膜液中的外泌體，他們發(fā)現(xiàn)這些外泌體可以激活促炎性M1巨噬細胞，并使其分泌促炎細胞因子[例如白細胞介素(interleukin，IL)-1β和IL-16]、趨化因子[C-C趨化因子配體(C-C motif chemokine ligand，CCL)20、CCL15和C-X-C趨化因子配體(C-X-C motif chemokine ligand，CXCL1)]以及基質(zhì)金屬蛋白酶[(matrix metalloproteinases，MMP)12和MMP7)][30]，這些都是OA病理過程中促進炎癥和導(dǎo)致軟骨退變的關(guān)鍵分子。

3.1.4 T淋巴細胞來源的外泌體與OA Okoye等[31]的研究表明，在T細胞受體激活后，小鼠的CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞(T regulatory cells，Tregs)會釋放出外泌體。另一項研究表明，Tregs中含有miRNA的外泌體可以通過介導(dǎo)非自主基因沉默來抑制Th1細胞的反應(yīng)[32]。除了CD4+CD25+Foxp3+T細胞外，其他具有調(diào)節(jié)功能的小鼠T細胞被激活后也可以釋放外泌體。CD8+CD25+Foxp3+T細胞來源的外泌體具有抑制由DC誘導(dǎo)的CD8+CTL細胞活性的能力。這可能是免疫系統(tǒng)一種自我調(diào)節(jié)的表現(xiàn)，T細胞來源的外泌體被用于抑制其他T細胞的活性，來避免機體的過度炎癥反應(yīng)。該機制在OA中表現(xiàn)為滑膜炎的緩慢發(fā)展，即使受到APC來源外泌體的多重誘導(dǎo)激活，T細胞也不會因此過度反應(yīng)使得炎癥快速進展[33]。

3.2 外泌體中的“貨物”與OA 外泌體所攜帶的“貨物”與OA的免疫調(diào)控密切相關(guān)。在OA發(fā)生及發(fā)展的過程中，miRNA抑制、組蛋白修飾、DNA甲基化等表觀遺傳變化會影響到多個轉(zhuǎn)錄過程和用于調(diào)節(jié)合成-分解代謝平衡的蛋白酶因子的合成，如Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runt related transcription factor 2，RUNX2)、MMP-13以及血小板結(jié)合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶-5(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 5，ADAMTS-5)。其中以miRNAs對OA造成的影響備受關(guān)注[21]。

在關(guān)節(jié)中，miRNAs主要參與MMPs、ADAMTS、RUNX、Ⅱ型膠原等多種細胞因子的調(diào)節(jié)。目前研究表明，miR-140在OA和經(jīng)IL-1β刺激的軟骨細胞中表達降低，證實其對關(guān)節(jié)軟骨的保護作用[34]。miR-140缺乏的小鼠會出現(xiàn)蛋白聚糖的丟失和軟骨纖顫的癥狀，而miR-140高度表達的小鼠則對關(guān)節(jié)炎具有抵抗力[35]。在人體OA組織中，miR-140表達減少往往伴隨MMP-13和ADAMTS-5表達增加，進而促進OA疾病的進展。而其他類型的miRNA，如miR-139和miR-9，也會引發(fā)OA合成-分解代謝過程的失衡，從而導(dǎo)致軟骨ECM破裂，軟骨細胞受損[36]。

外泌體中miRNA的含量在OA患者及正常人中存在差異[37]。根據(jù)miRNA圖譜顯示，OA患者關(guān)節(jié)滑液提取的外泌體中miR-200-c含量相較于健康受試者增加了2.5倍，這種變化影響了ZEB1基因的表達，因而減少Ⅱ型膠原的形成[38]。IL-1β刺激正常關(guān)節(jié)滑膜的成纖維細胞，與未經(jīng)IL-1β處理的細胞相比，這些細胞里會有340個不同的miRNAs表達上調(diào)，24個不同的miRNAs表達下調(diào)。與正常軟骨細胞相比，OA軟骨細胞分泌的外泌體中有22個miRNAs表達上調(diào)，29個miRNAs表達下調(diào)[39]。這些研究證實，在OA患者中關(guān)節(jié)腔組織細胞分泌的外泌體所表達的miRNA無論是種類還是數(shù)量均發(fā)生了較大的變化。一方面是關(guān)節(jié)內(nèi)微環(huán)境發(fā)生了改變，另一方面也是機體對關(guān)節(jié)腔微環(huán)境免疫調(diào)控的結(jié)果。同時，這種變化會反作用于機體對OA的調(diào)控過程，如miR-140表達增加時，細胞釋放炎癥因子的減少會使得局部的免疫反應(yīng)有所緩解[40]，外泌體在OA免疫調(diào)控中發(fā)揮的作用由此可見一斑。

4 外泌體與OA的其他聯(lián)系

除了免疫調(diào)控之外，外泌體與許多OA發(fā)生及發(fā)展的其他因素有關(guān)，例如滑膜中新生血管的形成。有研究指出，滑膜成纖維細胞來源的外泌體會導(dǎo)致血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)分泌增加，刺激了血管的形成，從而促進OA的病理發(fā)展。若將人臍靜脈內(nèi)皮細胞在含該外泌體的培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)，其細胞遷移和通道建立的效率會顯著提高，血管生成活性也由此得到增強。另外，軟骨細胞來源的外泌體也與OA的骨贅形成有關(guān)[41]。研究人員發(fā)現(xiàn)，在軟骨和骨骼新生物之中存在著一種大小為20～200nm的球形小泡，這些小泡具有許多與外泌體相似的特征，其中含有骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)等介質(zhì)，這是新生物鈣化形成骨贅?biāo)仨毜奈镔|(zhì)。

此外，外泌體還可以對軟骨細胞的代謝產(chǎn)生影響。經(jīng)MitoTracker Green FM染色檢測發(fā)現(xiàn)，人OA軟骨細胞線粒體質(zhì)量明顯低于人正常軟骨細胞，線粒體SOX紅染色顯示細胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平升高，即OA軟骨細胞內(nèi)同時存在線粒體受損和ROS聚集[42]。而經(jīng)過外泌體治療后，OA軟骨細胞內(nèi)的線粒體可以恢復(fù)正常，表現(xiàn)為胞內(nèi)三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)濃度升高和MitoTracker Green FM染色增強，ROS水平也有相應(yīng)的下降。因此，通過關(guān)節(jié)內(nèi)給予外泌體治療，可以有效延緩OA的病情發(fā)展。

5 結(jié) 語

傳統(tǒng)的OA治療手段主要是通過非甾體類抗炎藥(non-steroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs)和止痛藥來緩解OA的癥狀[43]，同時鼓勵患者加強鍛煉，控制飲食和體重。這些方法對OA治療效果相對有限，藥物的副作用也使其難以長期有效地維持。而骨科中常用的關(guān)節(jié)置換術(shù)和截骨術(shù)也由于手術(shù)器具的不成熟和術(shù)后并發(fā)癥等多種因素，對OA的臨床療效難以取得令人滿意的結(jié)果[44]。為此尋找新的治療策略顯得很有必要。如今，針對外泌體的研究啟發(fā)了我們前進的方向。本文重點介紹外泌體在OA免疫調(diào)控作用的研究進展，可以更進一步地探索如何有效地利用外泌體進行抗炎，減少炎癥反應(yīng)對關(guān)節(jié)腔內(nèi)組織的損傷，減輕炎癥細胞的浸潤，無論是長期慢性的炎癥控制，還是在急性發(fā)作期的癥狀緩解，外泌體都能有所作為。此外，利用間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)來源的外泌體對受損的軟骨和骨骼進行修復(fù)已被證實[45-46]。但無論是哪種途徑，利用外泌體對OA進行治療的方法還不夠成熟，仍需要研究人員更加深入的探索，證明該方法的有效性和可行性。