羊奶粉對小鼠免疫調(diào)節(jié)功能作用的研究

石韶琦，逄金柱，賴必輝

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)營養(yǎng)與健康系，北京 100191；2.內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團(tuán)）股份有限公司，呼和浩特 011500）

機(jī)體免疫力指機(jī)體抵抗外來侵襲、維護(hù)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性的能力，是機(jī)體識別和排除“異己”的生理反應(yīng)[1]。環(huán)境影響和營養(yǎng)不良導(dǎo)致免疫穩(wěn)態(tài)喪失，過去通過服用營養(yǎng)藥物重建免疫平衡，如今，營養(yǎng)食品代表了一種保護(hù)、平衡或增強(qiáng)哺乳動物免疫系統(tǒng)的創(chuàng)新方法[2]，各種乳制品成為深入研究的對象[3]。

羊奶營養(yǎng)豐富[4]，具有提高消化率、促進(jìn)生長發(fā)育、低致敏[5]、抗炎[6]、易消化吸收[7]、增強(qiáng)免疫力[8]等功能。研究表明，在HIV陽性患者攝入羊奶3個月后，CD4+細(xì)胞數(shù)量增加，免疫系統(tǒng)得到加強(qiáng)[9]。Jirillo等發(fā)現(xiàn)羊奶能夠通過單核細(xì)胞和PMN釋放NO激活先天免疫，并通過誘發(fā)IL-10、TNF-α等細(xì)胞因子的產(chǎn)生激活先天免疫和適應(yīng)性免疫[10]。然而，羊奶粉等乳制品是否仍具有調(diào)節(jié)免疫功能尚缺乏充足的證據(jù)。

本研究利用健康小鼠模型，通過研究羊奶粉對小鼠細(xì)胞免疫、體液免疫和NK細(xì)胞活性等方面的影響，評價羊奶粉的免疫調(diào)節(jié)功能，為羊奶粉的開發(fā)與應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品

羊奶粉，由內(nèi)蒙古歐世蒙牛乳制品有限責(zé)任公司提供，主要成分為全脂羊奶粉、脫鹽乳清粉、濃縮乳清蛋白粉等。

1.1.2 試驗(yàn)動物

Balb/C小鼠，雄性，體重18～22g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。飼養(yǎng)條件為12h光照交替，潔凈度SPF級，濕度維持在45%～50%，溫度保持在20±2℃。小鼠可自主攝食及飲水，活動自由。

1.2 試驗(yàn)設(shè)備

酶標(biāo)儀（Biotek, ELX808）；超凈工作臺（新加坡ESCO公司）；CP21GⅡ高速冷凍離心機(jī)（日立公司）；恒溫培養(yǎng)箱（37℃、43℃）；G560E漩渦混合器（美國SCIENTIFIC Instruments公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 試驗(yàn)動物分組及處理

將48只Balb/C健康小鼠隨機(jī)分成空白對照組、低劑量組和高劑量組，每組各16只?？瞻讓φ战M灌胃生理鹽水，低劑量組和高劑量組分別按每千克體重6.25g、12.5g的劑量灌胃羊奶粉，每日灌胃0.2mL，連續(xù)45d。

1.3.2 血清樣本制備

摘取小鼠眼球采血，室溫下靜置2h，于4℃條件下1 000r/min離心10min，收集血清，-20℃保存。

1.3.3 脾淋巴細(xì)胞懸液制備

小鼠處死后在無菌條件下取脾臟，置于盛有Hank's液的平皿中，輕輕磨碎脾臟，制成單個細(xì)胞懸液。經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾，于1 000r/min條件下離心10min，用Hank's液洗2遍，最后將細(xì)胞懸浮在5mL RPMI-1640培養(yǎng)液中。

1.3.4 補(bǔ)體制備

采集豚鼠血，混合5只不同豚鼠血清，將1mL壓積綿羊紅細(xì)胞（SRBC）加入到5mL豚鼠血清中，4℃放置30min，振蕩，離心取上清，分裝，-70℃保存，用時以SA緩沖液1:8倍稀釋。

1.4 測定指標(biāo)

1.4.1 體重及臟器/體重比

動物按照分組灌胃給予生理鹽水和低、高劑量羊奶粉，所有組連續(xù)灌胃45d。實(shí)驗(yàn)第0天第一次灌胃前稱量小鼠初始體重并記錄，實(shí)驗(yàn)第45天稱量小鼠最終體重后，摘取胸腺和脾臟稱重并記錄，計(jì)算胸腺/體重比值和脾臟/體重比值。

1.4.2 脾淋巴細(xì)胞增殖能力檢測

刀豆蛋白A（concanavalin A，ConA）誘導(dǎo)動物脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，利用MTT試劑盒對淋巴細(xì)胞懸液進(jìn)行測定，在490nm波長下檢測吸光值（OD值）。通過式（1）表示淋巴細(xì)胞的增殖能力。若受試樣品吸光值差值顯著高于對照組(P＜0.05)，判定為陽性。

1.4.3 遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（DTH）

腹腔注射0.2mL 2%（v/v）SRBC懸液，免疫4d后，測量左后足跖部厚度，然后在測量部位皮下注射20μL 20%（v/v）SRBC，注射后于24h測量左后足跖部厚度，同一部位測量三次，取平均值，以此來表示DTH程度。

1.4.4 抗體生成細(xì)胞測定

腹腔注射0.2mL 2%（v/v）SRBC懸液，免疫4d后，解剖小鼠獲得脾細(xì)胞懸液，并將其與瓊脂糖培養(yǎng)基、10% SRBC（v/v）混合傾倒在玻片上，加入稀釋后的補(bǔ)體溫育1h，計(jì)數(shù)溶血的空斑數(shù)。

1.4.5 血清溶血素（HC50）測定

腹腔注射0.2mL 2%（v/v）SRBC懸液，免疫4d后，解剖小鼠收集血清，SA緩沖液稀釋200倍，取稀釋后的血清50μL加入反應(yīng)板再加入25μL SRBC懸液、50μL補(bǔ)體混勻。37℃恒溫培養(yǎng)箱中保溫30min，冰浴終止反應(yīng)，1 500r/min條件下離心10min。樣品孔和空白對照孔各取上清液50μL加入96孔培養(yǎng)板內(nèi)，加都氏試劑150μL。半數(shù)溶血孔加入12.5μL 10%（v/v）SRBC，再加都氏試劑至200μL。震蕩器充分混勻，放置10min，于540nm處用全自動酶標(biāo)儀測定各孔光密度值。小鼠血清溶血素由式（2）表示。

1.4.6 自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）活性測定

將脾臟分離出的NK細(xì)胞與YAC-1淋巴瘤細(xì)胞各100μL共同培養(yǎng)，采用WST-8試劑盒法檢測NK細(xì)胞活力。若受試樣品的NK細(xì)胞活力顯著高于對照（P＜0.05），判定為陽性。

1.5 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊奶粉對小鼠體重及臟器/體重比的影響

羊奶粉對小鼠體重影響如圖1A所示，灌胃45d后，各組小鼠體重隨著灌胃時間延長而增加，低劑量組和高劑量組與空白對照組相比，無顯著差異（P＞0.05）。羊奶粉對胸腺/體重比值的影響如圖1B所示，灌胃45d后，低劑量組和高劑量組與空白對照組相比無顯著差異（P＞0.05）。對脾臟/體重比值的影響如圖1C所示，低劑量組和高劑量組與空白對照組相比無顯著差異（P＞0.05）。由此表明，羊奶粉對小鼠體重及臟器/體重比無顯著影響。

圖1 羊奶粉對小鼠體重、臟器的影響

2.2 羊奶粉對小鼠細(xì)胞免疫功能的影響

細(xì)胞免疫涉及T淋巴細(xì)胞及其產(chǎn)物（淋巴因子），ConA誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化和DTH反應(yīng)需要激活的T淋巴細(xì)胞對給定抗原的特異性識別，從而增殖和釋放細(xì)胞因子，淋巴細(xì)胞增殖能力和DTH反應(yīng)體現(xiàn)了細(xì)胞因子誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞募集和激活的能力[11]。

T細(xì)胞是獲得性免疫中細(xì)胞免疫的重要效應(yīng)細(xì)胞，在自身免疫、腫瘤免疫、移植物排斥反應(yīng)等方面起著重要作用[12]，脾淋巴細(xì)胞中的T細(xì)胞在ConA的刺激下增殖，增殖程度反映T細(xì)胞的活性[13]。羊奶粉對小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力的影響如圖2所示，灌胃45d后，與空白對照組相比，羊奶粉低劑量組脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力未顯著增加（P＞0.05），高劑量組淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力顯著增加（P＜0.05）。由此表明，羊奶粉可促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力。

圖2 羊奶粉對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力的影響

DTH是由特異性致敏T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)[14]，是一種以單核細(xì)胞浸潤及細(xì)胞變性壞死為主要特征的炎癥反應(yīng)，該反應(yīng)可作為判定機(jī)體細(xì)胞免疫功能的指標(biāo)[15]。羊奶粉對小鼠DTH的影響如圖3所示，與空白對照組相比，羊奶粉低劑量組和高劑量組DTH水平顯著提高（P＜0.05），表明羊奶粉可以增強(qiáng)細(xì)胞免疫反應(yīng)。

圖3 羊奶粉對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的影響

2.3 羊奶粉對小鼠體液免疫功能的影響

抗體生成細(xì)胞被認(rèn)為是體液免疫反應(yīng)的重要組成，其產(chǎn)生大量抗體，在宿主防御炎癥和維持體內(nèi)平衡方面實(shí)現(xiàn)一系列功能[16]。羊奶粉對小鼠抗體生成細(xì)胞的影響如圖4所示，與空白對照組相比，羊奶粉低劑量組和高劑量組顯著增加（P＜0.05），表明羊奶粉可增強(qiáng)小鼠體液免疫反應(yīng)。

圖4 羊奶粉對小鼠抗體生成細(xì)胞的影響

溶血素是一種能特異性結(jié)合紅細(xì)胞的抗原型靈敏的互補(bǔ)固定抗體，該抗體可導(dǎo)致紅細(xì)胞溶解釋放出血紅蛋白，血清中溶血素水平越高表明機(jī)體體液免疫水平越高，其可用來評價機(jī)體體液免疫狀態(tài)[17]。羊奶粉對小鼠血清溶血素的影響如圖5所示，羊奶粉低劑量組和高劑量組血清溶血素水平均高于空白對照組，但均無顯著差異（P＞0.05）。

圖5 羊奶粉對小鼠血清溶血素的影響

2.4 自然殺傷細(xì)胞（natural killer cells，NK細(xì)胞）活性測定

NK細(xì)胞是關(guān)鍵的先天免疫細(xì)胞，可以被激活以介導(dǎo)細(xì)胞毒性活性，并產(chǎn)生高水平的細(xì)胞因子和趨化因子，參與非特異性抗病毒防御機(jī)制[18]，其在增強(qiáng)先天免疫反應(yīng)和激活適應(yīng)性免疫系統(tǒng)方面發(fā)揮重要作用[19]。羊奶粉對小鼠NK細(xì)胞活性的影響如圖6所示，低劑量組和高劑量組NK細(xì)胞活性均呈上升趨勢，但與空白對照組相比，兩試驗(yàn)組NK細(xì)胞活性未顯著增加（P＞0.05）。

圖6 羊奶粉對小鼠NK 細(xì)胞的影響

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以Balb/C小鼠為動物模型，對羊奶粉對動物體的細(xì)胞免疫、體液免疫、NK細(xì)胞活性等調(diào)節(jié)作用進(jìn)行了評價。結(jié)果顯示，羊奶粉可增強(qiáng)小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力、遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)程度等細(xì)胞免疫功能和抗體生成細(xì)胞等體液免疫功能。綜上所述，羊奶粉具有增強(qiáng)小鼠免疫力的作用。