組蛋白去乙?；?、TGF-β1在狼瘡腎炎組織病理中的表達(dá)及其臨床意義

史添立 羅貞 焦石

系統(tǒng)性紅斑狼瘡是一種累及多系統(tǒng)的自身免疫病，狼瘡性腎炎（lupus nephritis，LN）是系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）主要致死原因［1］。腎間質(zhì)纖維化為后期慢性病理表現(xiàn)，組蛋白乙?；溉ヒ阴；钦{(diào)控基因表達(dá)的重要方式，參與各種生理病理過程［2］。HDAC3 作為組蛋白去乙?；福╤istonedeacetylase，HDAC）家族中一員，近來有研究表明HDAC 在參與腎臟病發(fā)生與發(fā)展并發(fā)揮重要作用［3］。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變（epithelial mesenchymal transition，EMT），調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)合成增加，是腎臟纖維化最關(guān)鍵作用因子［4］。本研究檢測(cè)HDAC3、TGF-β1 的表達(dá)及評(píng)估腎間質(zhì)纖維化的關(guān)系，探討HDAC3、TGF-β1與狼瘡腎間質(zhì)纖維化三者之間的關(guān)系。為下一步將組蛋白去乙?；敢种苿┳鰹槟I間質(zhì)纖維化的臨床治療潛在的實(shí)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2017年6月至2020年9月?？谑腥嗣襻t(yī)院收治的LN 患者53 例，其中男性患者11 例，女性42 例；平均年齡（34.12±12.04）歲。SLE 診斷符合2019年EULAR 的系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）分類標(biāo)準(zhǔn)［5］，LN 均經(jīng)腎臟病理檢查確診，腎臟病理分型是依據(jù)2003年國(guó)際腎臟病學(xué)會(huì)（ISN）/RPS 制定的分類標(biāo)準(zhǔn)確定［6］。同時(shí)選取相對(duì)應(yīng)時(shí)間內(nèi)收治的原發(fā)性腎病綜合征（nephrotic syndrome，NS）患者10 例作為對(duì)照組，其中男性6 例，女性4 例；平均年齡（35.10±4.36）歲。NS 的分類診斷標(biāo)依據(jù)為大量蛋白尿（尿蛋白定量24 h＞3.5 g）、低白蛋 白血癥（血清白蛋白≤30 g/L）［7］、高脂血癥、水腫，并除外其他繼發(fā)因素。所有患者均行腎臟組織活檢。所有患者及家屬均知情同意。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 研究方法

1.2.1 標(biāo)本處理

狼瘡性腎炎患者進(jìn)行腎臟病理檢查并進(jìn)行病理分型登記，腎組織常規(guī)進(jìn)行HE 染色、PAS 染色、PASM 染色、Masoon 三色染色及腎臟病理指數(shù)評(píng)分（包括活動(dòng)指數(shù)及慢性指數(shù)）［8］。計(jì)算腎間質(zhì)纖維組織相對(duì)面積（Masoon 染色法觀察腎間質(zhì)綠染區(qū)面積/視野總面積×100%）［9］。

1.2.2 免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)腎臟HDAC3 和TGF-β1 表達(dá)情況

①實(shí)驗(yàn)方法：取狼瘡患者腎臟病理組織切片烤干，試劑HDAC3 及TGF-β1 采用Abcam 廠家，二抗Leica novocastra NovoLink 聚合物檢測(cè)系統(tǒng)RE7280-K 檢測(cè)試劑盒l(wèi)ot：6078783。將已烤干的切片脫蠟；新鮮配制抗原修復(fù)液選用選自基因科技（上海有限公司）GT100411（50X 濃縮液）40 mL+2L 蒸餾水（抗原修復(fù)工作液pH9.0）高壓鍋內(nèi)混勻；將已沖洗干凈組織切片加熱煮沸后冷卻后將組織切片用流水沖洗干凈移至蒸餾水中浸泡2 min。3% H2O2中浸泡8 min，流水沖洗蒸餾水沖洗。取出切片，PBS 沖洗；甩去待測(cè)組織切片上多余的PBS 后滴加一抗抗體，陽(yáng)性、陰性對(duì)照片上也滴加同樣的抗體，對(duì)照片上滴加PBS 緩沖液。將切片放入孵育盒至冰箱中孵育18～24 小時(shí)后放置室溫30 min 恢復(fù)室溫；用PBS 洗3 次，滴加NovoLink 聚合物檢測(cè)系統(tǒng)RE7159 后放入37℃恒溫箱中孵育30 min。之后PBS 洗3 次，滴加NovoLink聚合物檢測(cè)系統(tǒng)RE7161 后孵育30 min。PBS 洗3次，將切片使用NovoLink 聚合物檢測(cè)系統(tǒng)試劑盒中的試劑RE7163 2 mL 和NovoLink 聚合物檢測(cè)系統(tǒng)試劑盒中的試劑RE7162 20 μL 混勻DAB 顯色液中顯色5 min，在顯微鏡下控制染色的強(qiáng)度；將切片置自來水中終止顯色，再用流水沖洗10 min；蘇木素染液復(fù)染1 min，0.5%鹽酸酒精分化3 秒鐘；流水沖洗10 min，返藍(lán)；脫水、透明、封片、鏡檢；②判讀方法［10］：在高倍鏡下觀察，分析每個(gè)視野中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的平均數(shù)作為該切片的陽(yáng)性細(xì)胞百分比進(jìn)行積分：0%～5%為0 分，6%～25%為1 分，25%～50%為2 分，51%～75%為3 分，＞75%為4 分；染色強(qiáng)度以多數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞呈現(xiàn)的染色特征為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)分：無染色為0 分，淡黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分。二者相加，0～1 分為陰性（-），2～3 分為弱陽(yáng)性（+），4～5 分為中等陽(yáng)性（++），6～7 分為強(qiáng)陽(yáng)性（+++），其中（-）和（+）記為低表達(dá)組，（++）和（+++）記為高表達(dá)組。染色強(qiáng)度：弱染色：在40X 物鏡視野才能看到細(xì)胞染色。強(qiáng)染色：在4X 或10X 物鏡視野能看到的細(xì)胞染色。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料用n表示，行χ2檢驗(yàn)。計(jì)量資料采用（±s）表示，兩組間比較用t檢驗(yàn)，多組間用F檢驗(yàn)。Pearson（正態(tài)分布）或Spearman（非正態(tài)分布）檢驗(yàn)進(jìn)行相關(guān)性分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者腎臟組織中HDAC3、TGF-β1 表達(dá)的比較

HDAC3 主要表達(dá)于腎臟腎小管上皮細(xì)胞中。SLE 組患者腎組織中HDAC3 的表達(dá)水平高于對(duì)照組［（6.32±2.31 vs 3.12±1.81）］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。伴有腎間質(zhì)纖維化的LN 患者HDAC3表達(dá)高于無纖維化患者［（6.78±2.19）vs（2.43±2.01）］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見圖1。

圖1 腎組織中HDAC3 和TGF-β1 表達(dá)（SP，×400）Figure 1 HDAC3 and TGF-β1 expression in kidney tissue（SP，×400）

2.2 SLE 患者臨床表現(xiàn)與腎臟組織HDAC3 和TGF-β1 表達(dá)的關(guān)系

腎臟組織HDAC3、TGF-β1 表達(dá)均與血肌酐、漿膜炎、口腔潰瘍、關(guān)節(jié)炎、間質(zhì)性肺炎、神經(jīng)系統(tǒng)損害、24 小時(shí)尿蛋白及血液系統(tǒng)損害有關(guān)（P＜0.05）。見表1。

表1 SLE 患者臨床表現(xiàn)與腎臟組織 HDAC3、TGF-β1 表達(dá)的關(guān)系（±s）Table 1 The relationship between clinical manifestations of SLE patients and the expression of HDAC3 and TGF-β1 in renal tissue（±s）

表1 SLE 患者臨床表現(xiàn)與腎臟組織 HDAC3、TGF-β1 表達(dá)的關(guān)系（±s）Table 1 The relationship between clinical manifestations of SLE patients and the expression of HDAC3 and TGF-β1 in renal tissue（±s）

臨床表現(xiàn)血肌酐升高n t 值6.677 P 值＜0.001 t 值5.964 P 值＜0.001漿膜炎4.715＜0.001 4.495＜0.001口腔潰瘍6.839＜0.001 6.100＜0.001關(guān)節(jié)炎12.441＜0.001 4.673＜0.001間質(zhì)性肺炎20.003＜0.001 4.002＜0.001神經(jīng)系統(tǒng)損害10.132＜0.001 3.786＜0.001 24 小時(shí)尿蛋白大于3.5g 11.234＜0.001 8.121＜0.001血液系統(tǒng)損害是否是否是否是否是否是否是否是否42 11 17 36 21 32 33 20 14 39 18 35 30 23 28 25 HDAC3 表達(dá)6.53±2.02 3.35±1.21 6.87±2.00 3.98±1.76 6.32±2.10 2.90±1.12 5.93±1.76 1.73±0.65 8.21±2.67 3.32±1.28 6.57±2.14 3.12±1.00 6.56±1.97 3.23±1.21 5.85±1.79 2.67±1.01 6.908＜0.001 TGF-β1 表達(dá)4.43±1.67 2.11±0.98 6.34±2.15 3.87±1.00 5.87±1.78 3.67±1.21 4.66±1.08 1.23±0.54 4.11±1.88 1.84±0.45 5.65±2.10 2.11±1.25 5.97±2.14 1.88±0.98 6.44±1.89 2.65±1.01 4.037＜0.001

2.3 腎組織中HDAC3 表達(dá)與TGF-β1 表達(dá)的關(guān)系

腎組織HDAC3 表達(dá)與TGF-β1 表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.745，P＜0.001）。

3 討論

LN 是SLE 的嚴(yán)重并發(fā)癥，其發(fā)病機(jī)制涉及自身抗體與自身抗原形成免疫復(fù)合物沉積、細(xì)胞浸潤(rùn)、足細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞損傷等［5-6］。越來越多研究顯示，表觀遺傳學(xué)變化在LN 發(fā)生發(fā)展中起到重要作用［7-8］。HDAC 是一組表觀遺傳修飾蛋白，通過催化組蛋白或非組蛋白賴氨酸殘基的去乙?；{(diào)節(jié)基因表達(dá)。HDAC 可以參與SLE 在內(nèi)的多種免疫疾病的發(fā)生發(fā)展［7］。HDAC3 是HDAC 家族重要成員之一，可以在細(xì)胞核和細(xì)胞漿中穿梭。HDAC3 在人體各個(gè)組織中均有表達(dá)，在細(xì)胞增殖、分化、細(xì)胞周期調(diào)控、免疫系統(tǒng)發(fā)育中發(fā)揮重要作用［8］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，HDAC3 與腎臟疾病的發(fā)生密切相關(guān)，例如腎癌、腎纖維化、慢性腎病、多囊腎、糖尿病腎病等［9］，在哺乳動(dòng)物中，組蛋白的乙?；艿浇M蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（histone acetyltransferases，HATs）和HDACs 的動(dòng)態(tài)調(diào)控。通常情況下，HDACs 通過去乙?；嚢彼釟埢突謴?fù)染色質(zhì)組蛋白的正電荷導(dǎo)致染色質(zhì)凝聚，阻礙轉(zhuǎn)錄因子的進(jìn)入，最終抑制相關(guān)基因表達(dá)。其機(jī)制可能與HDAC3 調(diào)控免疫炎癥、氧化應(yīng)激等有關(guān)［10］。腎間質(zhì)纖維化以腎成纖維細(xì)胞異常活化及增生為特點(diǎn)，特征性改變包括α-SMA 表達(dá)及細(xì)胞外基質(zhì)成分的增加。成纖維細(xì)胞的活化及增殖需要大量的生長(zhǎng)因子及細(xì)胞因子如TGF、血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、白介素6（IL-6）等的參與［11］。TGF-β1 是一種具有多種功能的蛋白多肽，其主要來源自淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、血小板和肝枯夫氏細(xì)胞等，與免疫炎癥損傷、組織纖維化密切相關(guān)［12］。既往研究已證實(shí)，TGF-β1 與LN的發(fā)生有關(guān)，并且參與纖維化的過程［13］。本研究結(jié)果進(jìn)一步說明HDAC3 與LN 腎組織纖維化有密切的關(guān)系，其可能機(jī)制為在腎臟纖維化形成過程中，HDACs 的上調(diào)了影響促纖維化生長(zhǎng)因子、細(xì)胞信號(hào)分子、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和腎臟抗纖維化蛋白的表達(dá)。例如，HDACs 抑制劑可明顯上調(diào)抗纖維化蛋白Klotho 及BMP-7 的水平，最終抑制腎臟纖維化的進(jìn)展［14］。也有研究表明，腎小管上皮細(xì)胞HDAC3 特異性敲除或使用HDAC3 特異性抑制劑RGFP966 均可減輕輸尿管結(jié)扎引起的腎臟纖維化，其機(jī)制可能與HDAC3 對(duì)抗纖維化蛋白Klotho的抑制有關(guān)［15-16］。另外也有研究發(fā)現(xiàn)，HDAC 依賴的Bmp7 轉(zhuǎn)錄調(diào)控，可以促進(jìn)TGF-β1 表達(dá)，進(jìn)而參與腎臟纖維化［17］。以上均為HDAC3 參與腎纖維化的可能機(jī)制，但仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。此外，本研究結(jié)果提示HDAC3 可能也參與在狼瘡病情活動(dòng)方面的機(jī)制，但需進(jìn)一步大樣本證實(shí)。本研究目前存在一定的局限性：①為單中心研究，樣本量較小；②未對(duì)患者進(jìn)行隨訪，不能明確HDAC3與TGF-β1 與SLE 患者預(yù)后的關(guān)系；③本研究?jī)H檢測(cè)了患者腎組織中HDAC3 與TGF-β1 的表達(dá)，未直接驗(yàn)證二者的相互調(diào)控關(guān)系及具體的機(jī)制；④未檢測(cè)HDAC3 相關(guān)組蛋白的表達(dá)水平及意義。

綜上，LN 患者的腎組織HDAC3 和TGF-β1 的表達(dá)水平明顯升高，另外HDAC3 和TGF-β1 與LN纖維化密切相關(guān)，伴有腎間質(zhì)纖維化LN 患者的HDAC3 和TGF-β1 表達(dá)水平高于無纖維化患者，未來需要進(jìn)一步開展細(xì)胞及動(dòng)物研究，明確HDAC3 與TGF-β1 的相互調(diào)控關(guān)系及其機(jī)制。