X連鎖慢性肉芽腫病臨床特征與基因診斷

郭明發(fā) 賈靜 王亞峰 朱瑩瑩 史利歡 劉俊閃 劉煒★

慢性肉芽腫?。╟hronic granulomatous disease，CGD）是一種以皮膚，肺及淋巴結(jié)廣泛肉芽腫性損害為特點(diǎn)的遺傳性粒細(xì)胞殺菌功能缺陷的原發(fā)性吞噬細(xì)胞免疫缺陷病，屬于單基因遺傳病，多為性連隱性遺傳。由于患者體內(nèi)吞噬細(xì)胞編碼還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶復(fù)合物的相關(guān)基因缺陷，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)障礙，不能有效的產(chǎn)生超氧陰離子（O2-）及其代謝物來(lái)殺死過(guò)氧化物酶陽(yáng)性細(xì)菌和真菌［1］。X 連鎖慢性肉芽腫?。╔-linked chronic granulomatous disease，X-CGD）多以男性發(fā)病，女性為基因攜帶為特點(diǎn)，發(fā)病多在2 歲以?xún)?nèi)，少數(shù)可晚至10 歲以后。多數(shù)X-CGD 是由于患者CYBB基因編碼區(qū)和剪接區(qū)突變引起，而非由基因調(diào)控區(qū)發(fā)生缺失引起，大多數(shù)突變影響mRNA 和（或）蛋白的穩(wěn)定性，造成反復(fù)且嚴(yán)重感染，以及過(guò)度炎癥反應(yīng)的影響［2］。該病臨床癥狀呈現(xiàn)多樣性，容易忽視，導(dǎo)致臨床延期診斷。故本文通過(guò)總結(jié)分析診治的X-CGD 患者的臨床特點(diǎn)，以及相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢查，對(duì)該病進(jìn)行總結(jié)，旨在幫助臨床醫(yī)生診斷及對(duì)患者家庭進(jìn)行遺傳咨詢(xún)、產(chǎn)前診斷提供幫助。

1 研究對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象

分析2015年10月至2019年5月間鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院確診的11 例X-CGD 患者，均為男孩，均來(lái)自河南省內(nèi)不同地區(qū)。臨床資料，見(jiàn)表1。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有經(jīng)臨床確診的X-CGD 患者，排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他類(lèi)型的免疫缺陷病者，以及家系成員不愿意參加本研究者。本研究獲得所有患者監(jiān)護(hù)人知情同意，研究經(jīng)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

表1 11 例X-CGD 患者的臨床資料Table 1 Clinical data of 11 X-CGD patients

1.2 方法

1.2.1 病史采集及實(shí)驗(yàn)室檢查

收集11 例患者發(fā)病時(shí)的一般臨床資料、臨床癥狀及家族史情況、實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢查及病原學(xué)檢查等。

1.2.2 中粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)試驗(yàn)

取患者、家系成員及健康對(duì)照者新鮮靜脈EDTA 抗凝血1 mL，2 h 內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。處理步驟如下：①取兩支流式反應(yīng)管，各加入50 μL 全血，其中對(duì)照管加入50 μL 磷酸鹽緩沖液（PBS），刺激管加50 μL 佛波酯（Sigma，10 μg/mL）工作液，混勻，37℃，孵育15 min；②每支反應(yīng)管中分別加入25 μL 二氫羅丹明-123（Dihydrorhodamine-123，DHR-123）（Sigma，30 μg/mL）工作液，混勻，37℃避光孵育5 min；③每支反應(yīng)管加入1 mL 溶血素（BD FACS Lysing Solution），室溫避光10 min；④400 g，離心5 min，棄上清，PBS 洗滌2 次，離心棄上清，加200 μL PBS 上機(jī)檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)采用FACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀（BD 公司，美國(guó)），以對(duì)照管調(diào)節(jié)儀器電壓，設(shè)置陰性區(qū)間，采用BD Diva軟件分析刺激管檢測(cè)發(fā)出陽(yáng)性信號(hào)的細(xì)胞比例，報(bào)告中性粒細(xì)胞活化率即陽(yáng)性信號(hào)的粒細(xì)胞占全部粒細(xì)胞的比例。

1.2.3 基因測(cè)序

對(duì)所有患者及其家系成員進(jìn)行基因診斷，采集靜脈EDTA-K2抗凝血2 mL，送至北京邁基諾醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所進(jìn)行Sanger 測(cè)序。

2 結(jié)果

2.1 中性粒細(xì)胞活化率分析

11 例患者及家系成員均行中粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)試驗(yàn)檢查，其中所有患者中性粒細(xì)胞活化率均＜10%；其中6 例患者母親呈攜帶者雙峰表型（例1、3、4、5、9、10），3 例患者姐姐也呈現(xiàn)攜帶者表型（例3、9、10），而患者父親中性粒細(xì)胞活化率呈現(xiàn)正常陽(yáng)性信號(hào)。見(jiàn)表2、圖1。

表2 11 例X-CGD 患者級(jí)家系成員的中粒細(xì)胞活化率及基因突變Table 2 Neutrophil activation rate and gene mutations of 11 X-CGD patient-level family members

圖1 例10 X-CGD 患者及家系成員中性粒細(xì)胞活化率分析Figure 1 Analysis of neutrophil activation rate of 10 X-CGD patients and family members

2.3 基因測(cè)序結(jié)果

經(jīng)Sanger 測(cè)序分析，所有患者均顯示為CYBB基因突變，其中自發(fā)突變5 例（例2、6、7、8、11），母系來(lái)源突變6 例（例1、3、4、5、9、10），典型基因分析來(lái)自10 號(hào)病例，患者呈現(xiàn)CYBB基因半合子變異、患兒父親無(wú)變異、患兒母親及姐姐呈現(xiàn)雜合變異。見(jiàn)表2、圖2。

圖2 例10 X-CGD 患者及家系成員基因診斷分析Figure 2 Genetic diagnosis analysis of 10 X-CGD patients and family members

2.4 家系分析

X-CGD 患者為先癥者，其CYBB基因突變來(lái)自母親，由母親X 染色體遺傳，其中女兒為攜帶者，男性多發(fā)病，典型家系分析來(lái)自10 號(hào)病例。見(jiàn)圖3。

圖3 例10 X-CGD 患者遺傳家系分析Figure 3 Analysis of the genetic family of 10 X-CGD patients

2.5 隨訪結(jié)果

本研究中11 例患者中，1 例患者以“潰瘍性結(jié)腸炎”反復(fù)多次就診多家醫(yī)院，出生9 天即起病，1 歲9月在本院第二次入院通過(guò)中性粒細(xì)胞活化率篩查為疑似病例，經(jīng)基因診斷確診。3 例患者死亡，其中2 例在他院經(jīng)歷較長(zhǎng)時(shí)間抗感染治療，入院明確診斷時(shí)已進(jìn)入感染終末期階段。8 例存活患者中，其中2 例經(jīng)造血干細(xì)胞移植治療后檢測(cè)中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)功能正常，中性粒細(xì)胞活化率＞90%；其余6 例經(jīng)控制感染后暫時(shí)存活。

3 討論

慢性肉芽腫是一種少見(jiàn)的遺傳性疾病，可分為X-CGD 和常染色體隱性遺傳CGD。其發(fā)病率約為1/20 萬(wàn)人，歐美國(guó)家報(bào)道發(fā)病率大約1/25 萬(wàn)～1/20 萬(wàn)［3］，目前我國(guó)尚無(wú)確切的發(fā)病率數(shù)據(jù)報(bào)道。由于患者體內(nèi)NADPH 氧化酶復(fù)合物的某些成分缺失或減少，不能有效地產(chǎn)生具有殺菌活性的超氧陰離子及其代謝產(chǎn)物，從而吞噬細(xì)胞無(wú)法產(chǎn)生“呼吸爆發(fā)”，導(dǎo)致機(jī)體對(duì)多種病原體感染無(wú)法清除，造成過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性細(xì)菌，侵襲性真菌，結(jié)核分枝桿菌等感染［4-6］。CGD 患者常以肺部感染為主要表現(xiàn)，包括肺炎與肺膿腫，其他癥狀包括淋巴結(jié)炎、皮膚和胃腸道感染［7-8］。本組中10 例（90.9%）患者以肺炎為主要病因入院，且以新生兒期起病為主，年齡低于國(guó)內(nèi)已有報(bào)道［9］，且患者從發(fā)病到診斷時(shí)間明顯縮短，可能與該疾病的快速篩查意識(shí)提高有關(guān)系。

NADPH 氧化酶復(fù)合物是由5 個(gè)吞噬氧化酶phox 亞基組成的多組分酶［10］，5 個(gè)吞噬氧化酶亞基gp91、p22、p47、p67 和p40 的編碼基因分別CYBB、CYBA、NCF1、NCF2、NCF4。其中CYBB基因缺陷常引起引起X-CGD，表現(xiàn)為男性患病，女性攜帶。CYBB基因突變?cè)跉W洲和美國(guó)報(bào)道比例分別為67%、70%［5］，國(guó)內(nèi)上海和重慶報(bào)道比例為89.1%、83.3%［2，6］。

CGD 實(shí)驗(yàn)室傳統(tǒng)診斷依賴(lài)硝基四唑氮藍(lán)（Nitro blue tetrazolium chloride，NBT）還原實(shí)驗(yàn)，存在操作復(fù)雜、繁瑣且結(jié)果不客觀等缺點(diǎn)［10］，20世紀(jì)90年代后期，DHR-123 經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)活性氧開(kāi)始應(yīng)用于臨床。無(wú)熒光染料DHR-123，進(jìn)入中性粒細(xì)胞后，可被中粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)過(guò)程產(chǎn)生的活性氧（Reactive oxygen species，ROS）氧化為熒光物質(zhì)DHR-123，發(fā)出熒光，被流式細(xì)胞儀捕獲，可直接反映中性粒細(xì)胞的活化能力［11］。健康人群中性粒細(xì)胞活化在檢測(cè)圖上呈現(xiàn)顯著的陽(yáng)性位移群，而X-CGD 患者幾乎沒(méi)有移位；且X-CGD攜帶者中粒細(xì)胞存在兩個(gè)不同群體即部分正常位移，部分沒(méi)有位移，呈現(xiàn)雙峰表型［12］。本研究中11例X-CGD 患者中粒細(xì)胞活化率均＜10%，且檢測(cè)圖上幾乎無(wú)位移。研究顯示X-CGD 攜帶者中粒細(xì)胞活化率范圍在20%～80%，極少情況下只有10%中粒細(xì)胞活化率也具有正常的宿主防御能力［13］。本研究的家系成員中粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)試驗(yàn)顯示：6 例患者母親中粒細(xì)胞活化率在14.2%～59.6%之間；3 例患者同胞姐姐中粒細(xì)胞活化率38.6%～63.1%之間，患者父親均呈現(xiàn)典型的陽(yáng)性位移群。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)中性粒細(xì)胞活化率，有助于快速篩查X-CGD 患者，但其明確診斷仍需要基因診斷。

綜上所述，X-CGD 臨床起病早，反復(fù)重癥感染常見(jiàn)，由于臨床病例少見(jiàn)，易被忽視。隨著流式細(xì)胞儀在基層醫(yī)院的普及，采用流式細(xì)胞術(shù)-DHR 檢測(cè)能簡(jiǎn)單快捷檢測(cè)中性粒細(xì)胞活化率，對(duì)于低年齡起病的過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性菌感染、真菌感染、卡介苗接種異常等疑似CGD 患者，建議開(kāi)展檢測(cè)中粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)實(shí)驗(yàn)。目前遺傳性疾病，尤其是單基因遺傳病的臨床確診需要采用基因診斷，主要技術(shù)有基于PCR 擴(kuò)增技術(shù)和基因測(cè)序技術(shù)等［14-15］，明確單基因遺傳病的臨床診斷需對(duì)患者及其家系成員進(jìn)行基因分析，明確其遺傳方式，同時(shí)對(duì)家系中基因攜帶者進(jìn)行必要的遺傳咨詢(xún)和產(chǎn)前診斷，對(duì)避免基因缺陷兒的出生，提供優(yōu)生優(yōu)育的指導(dǎo)策略。