鹽度對魚鳥河上覆水細菌群落結(jié)構(gòu)的影響

王文靜，盛彥清 (中國科學院煙臺海岸帶研究所，山東 煙臺 264003)

海岸帶水體在維持近海資源與環(huán)境的可持續(xù)發(fā)展過程中具有重要作用。受氣候變化和人類活動的雙重脅迫，海岸帶水環(huán)境面臨巨大挑戰(zhàn)。入海河流由于海水侵蝕等原因，鹽度從內(nèi)陸到河口呈逐漸升高趨勢，鹽度梯度變化導致濱海河流生態(tài)系統(tǒng)的特殊性。但隨著沿海地區(qū)人口增長和經(jīng)濟快速發(fā)展，導致大量污染物排入水體，影響河流水質(zhì)和生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性。富含高營養(yǎng)鹽的水體在河口地區(qū)匯入近海，增加了海洋水體富營養(yǎng)化的風險[1]。

海岸帶河口地區(qū)生活著大量可耐受一定鹽度的細菌，在近海水體的生物地球化學循環(huán)過程中具有重要作用。依據(jù)細菌對鹽度耐受范圍不同可分為嗜鹽型和耐鹽型。嗜鹽型在近于飽和的NaCl溶液和相同鹽度環(huán)境中生長繁殖[2]，嗜鹽菌包括Halobacterium、Halococcus和Extothiorhodospimhalophila等菌群；耐鹽菌能夠在有鹽和無鹽環(huán)境中生長繁殖，耐受的鹽度最高達到20‰[3]，常見細菌如短桿菌(Brevibacterium)、假單胞菌(Pseudomonas)、芽孢桿菌(Bacillus)、CandidatusNitrotoga、Porticoccus、Roseimaritim、Haliea、Marivita和Algoriphagus等可耐受不同程度的鹽度[3-4]。

細菌是水體生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，具有體積小、種類多、分布廣和代謝能力強的特點，其快速生長繁殖的特性，導致隨環(huán)境條件改變其群落結(jié)構(gòu)迅速發(fā)生變化。諸多研究發(fā)現(xiàn)水體細菌的生長速率主要由生態(tài)系統(tǒng)的營養(yǎng)水平?jīng)Q定，但鹽度同樣是影響微生物種群組成的重要環(huán)境因子[5-6]。由于水體細菌生活空間不同，常被區(qū)分為浮游細菌和附生細菌。浮游細菌是水體營浮游生活的原核生物類群，是表征生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性的重要指標[7]。附生細菌是生活在水體顆粒物、各種基質(zhì)及藻類表面的原核生物類群，可直接反映水體顆粒物和基質(zhì)變化[8]。了解入海河流浮游細菌和附生細菌群落組成，對探明海岸帶濱海河道生態(tài)過程具有重要意義。

魚鳥河是黃海位于山東省煙臺市牟平區(qū)的入海河道，魚鳥河下游河段人類活動頻繁，導致夏季水溫較高時，水體富營養(yǎng)化及藻華現(xiàn)象時有發(fā)生。該文以鹽度梯度為采樣點選擇依據(jù)，分析魚鳥河藻華暴發(fā)時下游河段上覆水浮游細菌和附生細菌群落結(jié)構(gòu)。另外，以原位采樣點鹽度作為可控變量，研究鹽度對魚鳥河上覆水細菌群落結(jié)構(gòu)的影響，以闡明鹽度對細菌群落結(jié)構(gòu)和功能的影響。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域及采樣點

原位采樣點選取山東省煙臺市牟平區(qū)的入海河道魚鳥河。2019年6月，S0采樣點暴發(fā)藻華(圖1)。在藻華暴發(fā)位點及下游河段分別設置S0、S1、S2和S3采樣點，采樣河段區(qū)域水深為10～20 cm。每個點取3個樣品作為重復。S0樣品在光學顯微鏡下經(jīng)過形態(tài)學鑒定，其中，微囊藻屬相對豐度約在90%以上，S0樣品ρ(葉綠素)為2.14 mg·L-1。

1.2 水質(zhì)理化指標

在采樣現(xiàn)場，采用水質(zhì)檢測儀測定水體鹽度。采用水楊酸分光光度法測定水體氨氮指標，采用紫外分光光度計法測定硝態(tài)氮，采用磷鉬藍-抗壞血酸分光光度法測定正磷酸鹽，采用連續(xù)流動分析儀測定其他指標。

圖1 采樣位點

1.3 浮游細菌和附生細菌群落

1.3.1樣品的收集

采用小型水質(zhì)采樣器，取河道0～10 cm表層水樣，每個點采集3個樣品作為重復。根據(jù)文獻[10]報道，利用濾膜1(孔徑為5.0 μm, 直徑為47 mm，TMTP04700，Millipore，MA，USA)及抽濾泵過濾500 mL水樣，獲得濾液1和濾膜1，濾液1含浮游細菌，濾膜1含附生細菌。由于濾膜1含有較多碎樹葉等雜質(zhì)，為提高細菌DNA 提取效率，用無菌水對濾膜1進行重懸，150 W超聲振蕩，間隔1 min超聲10 s后上下顛倒混勻，實驗過程持續(xù)10 min，水溶液重懸后用于過濾濾膜2(孔徑為0.22 μm，HVLP04700，Millipore，MA，USA)，收集濾膜2，該操作重復3遍，濾膜2保存于-80 ℃條件下，用于提取附生細菌DNA。用濾液1過濾濾膜3(孔徑為0.22 μm，HVLP04700，Millipore，MA，USA)，獲得濾膜3。提取浮游細菌DNA前，所有濾膜均保存于-80 ℃條件下。

1.3.2DNA的提取和細菌群落結(jié)構(gòu)分析

利用無菌剪刀和鑷子等在無菌管內(nèi)剪碎濾膜，按照DNA提取試劑盒(QIAamp DNA Mini Kit，QIAGEN，Germany)說明書要求，分別提取濾膜2和濾膜3的細菌基因組DNA。以提取的DNA作為模板，選取16S rRNA基因V4-V5區(qū)的通用引物515F(5′-GTGNCAGCMGCCGCGGTA-3′)和926R(5′-CCGYCAATTYMTTTRAGTTT-3′)為擴增目標DNA片段。20 μL PCR擴增體系反應條件：95 ℃條件下預變性3 min，95 ℃條件下變性30 s，55 ℃條件下退火30 s，72 ℃條件下延伸45 s，共27個循環(huán)，72 ℃條件下延伸10 min。將得到的PCR產(chǎn)物，經(jīng)質(zhì)量分數(shù)w=2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠回收，用Tris-HCl洗脫后收集DNA純化產(chǎn)物，利用北京諾禾致源科技股份有限公司測序平臺進行高通量測序。將原始測序數(shù)據(jù)上傳至 NCBI數(shù)據(jù)庫(SRR14297333-SRR14297322)。

1.4 不同鹽度條件下細菌群落分析

為驗證環(huán)境因子鹽度對細菌群落結(jié)構(gòu)的影響，模擬原位采樣點相同的鹽度梯度，分析鹽度對同一原位水樣菌群的影響。用0.22 μm孔徑濾膜(HVLP04700，Millipore，MA，USA)過濾多份500 mL S0水樣，4 ℃條件下保存濾膜備用。利用海鹽(Sigma-Aldrich，USA)調(diào)整培養(yǎng)基鹽度，配制500 mL不同鹽度無菌培養(yǎng)基。設置2.5‰(處理組Sal.2.5，對應S0位點)、5‰(處理組Sal.5，對應S1位點)、12‰(處理組Sal.12，對應S2位點)和20‰(處理組Sal. 20，對應S3位點)4個鹽度處理組。將過濾后收集的S0水樣的濾膜放入各處理組，每個處理組3個重復。所有處理組放入25 ℃恒溫光照箱中進行培養(yǎng)，光照強度為2 000 lx，光周期為12 h∶12 h，培養(yǎng)48 h，將培養(yǎng)液過濾至新濾膜(孔徑為0.22 μm，HVLP04700，Millipore，MA，USA)，收集細菌[7-8]。濾膜在-80 ℃條件下保存用于提取DNA，濾膜細菌提取測定等方法同1.2節(jié)。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

對Illumina NovaSeq 測序的原始數(shù)據(jù)(raw tags)進行拼接和質(zhì)控，得到clean tags，再進行嵌合體過濾，得到用于后續(xù)分析的有效數(shù)據(jù)(clean data)。為研究各樣本物種組成，對所有樣品的有效數(shù)據(jù)，以97%的一致性進行OTUs(operational taxonomic units)聚類，然后對OTUs 序列進行物種注釋，得到對應物種信息和基于物種豐度的分布情況。利用Uparse軟件對樣品有效序列進行OTUs聚類，采用Mothur方法與Silva 軟件的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫進行物種注釋，利用Qiimer 1.9.1軟件對不同樣本采用97%一致性閾值進行Alpha多樣性指數(shù)分析(如Shannon、Chao1和Goods coverage)進行統(tǒng)計。分析原位浮游細菌(BA)、原位附生細菌(AB)和模擬實驗所獲得菌群的種間差異，利用R軟件對細菌群落結(jié)構(gòu)(屬水平)進行主成分分析(principal component analysis，PCA)。采用SPSS 16.0(Statistical Product and Service Solutions)軟件對環(huán)境因子與細菌Alpha多樣性指數(shù)之間進行相關性分析。采用Origin 9.1軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。

2 結(jié)果與分析

2.1 原位水體理化性質(zhì)

河段水體理化指標見表1。S0、S1、S2和S3這4個位點鹽度從S0至入?？赟3逐漸升高，分別為2.5‰、5.1‰、12.3‰和20.9‰。流速均值為1.48 m·s-1。硝態(tài)氮濃度從S0至S3逐漸升高，氨氮濃度從S0至S3逐漸降低。總氮濃度從S0至S3隨著鹽度的增加而升高，可能是因為S1與S2之間存在工廠、居民區(qū)等人類活動，導致S2位點總氮濃度升高。S0位點總磷濃度最高，S2位點最低。正磷酸鹽濃度在入?？谖恢弥饾u升高，可能是由于S1至S2之間工廠、居民區(qū)等區(qū)域排放正磷酸鹽所致。與之前研究相比，魚鳥河下游河段氨氮、總氮、總磷濃度高于王祺斌等[9]研究中2018年全河段均值。

表1 不同位點河段表層水的理化性質(zhì)

2.2 河道浮游細菌的群落結(jié)構(gòu)

采用高通量測序技術分析河道浮游細菌群落結(jié)構(gòu)(表2)。測序結(jié)果共獲得369 604條原始序列，S0位點最多，S2位點最少。獲得355 356條有效序列，S0位點最多，S2位點最少。覆蓋度以S0位點為最高，S3位點最低。物種數(shù)量均值為1 221種，S2位點最高，S1位點最低。Chao1多樣性指數(shù)表明，S3位點物種豐富度最高，S1位點最低。Shannon指數(shù)表明S3位點物種多樣性最高，S2位點最低。不同鹽度位點河道浮游細菌物種豐富度和多樣性差別較大，隨著鹽度增加，細菌群落豐富度升高；細菌群落多樣性由S1至S2隨著鹽度增加而降低，由S2至S3隨鹽度增加而升高。

河道水體浮游細菌群落結(jié)構(gòu)見圖2。

表2 細菌群落的測序條帶及Alpha多樣性指數(shù)

覆蓋度指估測序深度是否足夠；物種數(shù)量指群落中豐度大于0的物種數(shù)之和，只有物種種類信息，沒有豐度信息；數(shù)值范圍一般從幾百至幾千不等；對4個樣本在97%一致性閾值下Alpha多樣性指數(shù)進行統(tǒng)計均一化時選取的數(shù)據(jù)量為80 842；Chao1指數(shù)為對稀有物種很敏感的度量物種豐富度的指標；Shannon指數(shù)為衡量種群多樣性的指數(shù)。

圖2 河道水體浮游細菌群落結(jié)構(gòu)

浮游細菌隸屬10個門，包括變形菌門(Proteobacteria)、藍藻門(Cyanobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、浮霉菌門(Planctomycetes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、綠彎菌門(Chloroflexi)、Hydrogenedentes、放線菌門(Actinobacteria)、軟壁菌門(Tenericutes)和酸桿菌門(Acidobacteria)(圖2)。所有樣品中變形菌門相對豐度最高，隨鹽度增加而升高，S0位點最低，S3位點最高。藍藻門次之，藍藻門相對豐度隨鹽度升高而降低，S0位點較高。由于S0位點是以微囊藻為優(yōu)勢藻的藻華，導致藍藻門相對豐度在S0位點較高，隨鹽度升高，藍藻門相對豐度降低。S1位點擬桿菌門相對豐度低于S0，自S1至S3相對豐度增加。張磊[10]研究發(fā)現(xiàn)變形菌門和擬桿菌門對鹽度具有較高耐受性，導致變形菌門和擬桿菌門相對豐度在S3位點升高。S1位點浮霉菌門相對豐度低于S0位點，S2位點最高，S3位點最低。S1位點疣微菌門相對豐度低于S0位點，自S1至S3升高。綠彎菌門與疣微菌門相對豐度變化相似，綠彎菌門與疣微菌門細菌具有較高耐鹽性。

在屬分類水平上，優(yōu)勢菌隸屬于微囊藻屬(Microcystis)、亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)、CandidatusNitrotoga、Porticoccus、Roseimaritima、Haliea、Marivita、Algoriphagus、Methyloversatilis和生絲單胞菌屬(Hyphomonas)(圖2)。微囊藻屬相對豐度以S1位點為最高，與顯微鏡下觀察到的S1位點微囊藻為優(yōu)勢藻的結(jié)果一致。部分具有氨氧化功能的亞硝化單胞菌作為耐鹽菌，可耐受高鹽環(huán)境[11]。具有較高相對豐度的CandidatusNitrotoga是一類可耐受最高32‰鹽度的嗜鹽氮氧化菌[12]。海岸帶地區(qū)常見菌Roseimaritima相對豐度與鹽度變化一致，在鹽度較高的環(huán)境下，相對豐度較高。參與異養(yǎng)硝化的Marivita[13]和硝酸鹽還原菌Algoriphagus[14]相對豐度具有相似變化趨勢，S3位點相對豐度最高，S1位點最低。結(jié)果表明，參與氮循環(huán)的氨氧化菌和氮氧化菌等相對豐度較高，活躍的細菌代謝過程可能會導致入海河流到入?？诘陌钡獫舛认陆担鯌B(tài)氮濃度上升。

2.3 河道附生細菌的群落多樣性

附生細菌群落測序條帶及Alpha多樣性指數(shù)見表2。所有樣品共得到 113 970條原始序列，S2位點(30 329條)最高，S3位點(26 158條)最低。所有樣品共得到108 023條有效序列，S0位點(29 133條)最多，S3位點(25 491條)最少。覆蓋度以S0位點為最高，S3位點最低。物種數(shù)量均值為360種。Chao 1指數(shù)值顯示S1位點細菌豐富度最高，S3位點最低；Shannon指數(shù)值表明S1位點細菌多樣性最高，S3位點最低。在不同鹽度采樣點，附生細菌群落物種豐富度和多樣性不同。之前的研究表明，附生細菌群落組成與其附著的顆粒有機質(zhì)性質(zhì)關系密切，顆粒有機質(zhì)性質(zhì)影響附生細菌群落組成[15]。

附生細菌隸屬于變形菌門(Proteobacteria)、藍藻門(Cyanobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、裝甲菌門(Armatimonadetes)、放線菌門(Actinobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)和厚壁菌門(Firmicutes)7個門(圖3)。

圖3 河道水體附生細菌群落結(jié)構(gòu)

變形菌門相對豐度以S0位點為最高，S1位點最低。藍藻門相對豐度以S2位點最高，S0位點最低。擬桿菌門相對豐度以S1位點為最高，S3最低。裝甲菌門、放線菌門、芽單胞菌門和厚壁菌門相對豐度在不同采樣點變化較大。與浮游細菌群落組成相同，變形菌門、藍藻門和擬桿菌門是附生細菌群落的優(yōu)勢菌。藍藻門相對豐度在附生細菌群落中高于浮游細菌，說明影響浮游細菌和附生細菌群落結(jié)構(gòu)的因素不同，菌群結(jié)構(gòu)變化受多種環(huán)境因子的影響。

在屬分類水平上，優(yōu)勢附生細菌隸屬于產(chǎn)卟啉桿菌屬(Porphyrobacter)、玫瑰單胞菌屬(Roseomonas)、Mariniradius、水單胞菌屬(Aquimonas)和微囊藻屬(Microcystis)等(圖3)。微囊藻屬是附生細菌群落的優(yōu)勢菌，其相對豐度在鹽度較高的S3位點顯著低于S1和S2位點，微囊藻耐受的鹽度最高為17.2‰，S3樣品中微囊藻可能主要來自于上游。產(chǎn)卟啉桿菌在各個位點均為優(yōu)勢菌，是藻華暴發(fā)時的常見菌，可刺激藻細胞胞外聚合物質(zhì)的釋放，促進藻華發(fā)生[16]，由于產(chǎn)卟啉桿菌有較高耐鹽性[17]，在S3位點屬于優(yōu)勢細菌。S0位點玫瑰單胞菌屬相對豐度為24.38%，在其他3個位點均未檢測到，說明玫瑰單胞菌屬耐鹽性較低。Mariniradius僅在S0和S1位點檢測到，S1位點相對豐度(11.31%)高于S0位點(7.28%)。水單胞菌屬在S0和S1位點均能檢測到，S0位點相對豐度(7.86%)高于S1位點(2.44%)。

2.4 模擬鹽度對細菌群落組成的影響

不同鹽度細菌群落信息見表2。其中，Sal.5原始序列(102 366條)最多，Sal.20(73 024條)最低。所有樣品共得到315 397條有效序列，Sal.5最多，Sal.20最少。Sal.20覆蓋度最高。共得到物種數(shù)量1 014種，Sal.20最高，Sal.2.5最低。物種豐富度指數(shù)Chao 1以Sal.20為最高，Sal.2.5最低。Sal.20樣品Shannon多樣性指數(shù)最高，Sal.12最低。上述結(jié)果表明，鹽度對水體細菌物種豐富度和多樣性均有影響。

模擬實驗共檢測到藍藻門(Cyanobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)、厚壁桿菌門(Firmicutes)、浮霉菌門(Planctomycetota)、Spirochaetota、Synergistota和梭桿菌門(Fusobacteria)9個門(圖4)。

圖4 室內(nèi)模擬鹽度對水體細菌群落結(jié)構(gòu)的影響

當鹽度由2.5‰升高至12‰時，藍藻門相對豐度從36.11%升高至83.61%，Sal.20處理降至4.39%，由于模擬實驗充足的光照增強了藍藻光合作用效率，導致藍藻耐鹽性較高。Sal.2.5處理變形菌門相對豐度(49.87%)最高，Sal.20處理次之，Sal.12處理最低。擬桿菌門相對豐度在不同鹽度條件下變化較大，Sal.5處理(16.98%)較高，Sal.12處理降至2.88%，Sal.20處理升至20.68%。Sal.2.5、Sal.5和Sal.12處理放線菌門相對豐度均低于0.43%，Sal.20處理升高為9.03%。厚壁菌門相對豐度隨鹽度升高而增加，Sal.20處理最高，厚壁菌門是藍藻常見共生菌[18]，與藍藻門協(xié)同生長，其相對豐度變化與藍藻門相一致。Spirochaetota、Synergistota、梭桿菌門相對豐度以Sal.20處理為最高，說明它們的耐鹽性較高。上述結(jié)果表明，在模擬實驗環(huán)境下優(yōu)勢菌藍藻門、變形菌門和擬桿菌門與原位樣點相同，相對豐度均較高。

在屬分類水平上，檢測到湖絲藻屬 (Limnothrix)、微囊藻屬(Microcystis)、氫噬菌屬(Hydrogenophaga)、Salinarimonas、Mariniradius、根瘤菌屬(Bradyrhizobium)、產(chǎn)卟啉菌屬(Porphyromonas)、普雷沃菌屬(Prevotella)和Geitlerine共9類優(yōu)勢菌(圖4)。Sal.2.5處理氫噬菌屬相對豐度最高，為45.53%，微囊藻屬次之，其后為耐鹽菌Mariniradius[19]。Sal.5處理微囊藻屬相對豐度(40.95%)最高，其后依次為Salinarimonas和Mariniradius。Sal.12處理湖絲藻屬相對豐度(77.70%)最高，其后依次為Salinarimonas和微囊藻屬。Sal.20處理根瘤菌屬相對豐度(8.79%)最高，其后依次為產(chǎn)卟啉菌屬和普雷沃菌屬。上述結(jié)果顯示，模擬實驗和原位實驗均表明在相同鹽度條件下優(yōu)勢細菌群落相近。

2.5 細菌群落與水體理化性質(zhì)的相關性

表3顯示，鹽度、氨氮和總磷與Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)呈正相關，Chao1指數(shù)與鹽度呈顯著正相關，Shannon指數(shù)與鹽度的相關性未達顯著水平；模擬實驗結(jié)果表明，鹽度影響細菌群落的豐富度。浮游細菌群落Chao1指數(shù)與總磷呈顯著正相關。Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)與總氮和硝態(tài)氮呈負相關，浮游細菌群落Shannon指數(shù)與硝態(tài)氮呈顯著負相關。

2.6 主成分分析

PCA分析表明，原位浮游細菌(BA)和原位附生細菌(AB)、模擬實驗細菌分布于不同象限，其相似度較小，差異較大，說明各處理組樣本間菌群結(jié)構(gòu)存在差異(圖5)。原位附生細菌與模擬實驗細菌樣品相似度較高，差異較少，說明各處理組樣本間細菌群落結(jié)構(gòu)相似度較高。相同鹽度菌群差異較小，說明相同鹽度條件下細菌群落組成結(jié)構(gòu)的相似度較高。該結(jié)果與之前研究相似，海岸帶環(huán)境中細菌群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境的鹽度變化有關[20]。

表3 環(huán)境因子與浮游細菌/附生細菌Alpha多樣性指數(shù)相關性

BA為原位浮游細菌，AB為原位附生細菌，S1～S4為原位采樣點， Sal.2.5、Sal.5、Sal.12和Sal.20為室內(nèi)模擬實驗處理代號。

3 結(jié)論

(1)不同鹽度梯度條件下，河流原位樣品細菌群落豐富度和多樣性發(fā)生顯著變化。藍藻門、變形菌門和擬桿菌門在浮游細菌和附生細菌群落均占優(yōu)勢，但浮游細菌和附生細菌的優(yōu)勢細菌明顯不同，浮游細菌亞硝化單胞菌和CandidatusNitrotoga為優(yōu)勢菌，附生細菌產(chǎn)卟啉菌為優(yōu)勢菌。相關性分析、主成分分析及模擬實驗均表明，鹽度影響水體細菌群落結(jié)構(gòu)組成。

(2)模擬實驗優(yōu)勢菌與原位水體浮游優(yōu)勢菌差異較大，與附生細菌群落結(jié)構(gòu)相似，由于附生細菌依附于顆粒物或藻細胞表面，其主要有機物來源為顆粒物與藻類的營養(yǎng)物質(zhì)，而模擬實驗中細菌的主要有機物來源也是顆粒物及藻類，營養(yǎng)成分影響細菌群落組成。

(3)該研究涉及細菌鹽度耐受性，可獲得某鹽度環(huán)境下指示性細菌，如部分細菌玫瑰單胞菌屬、水單胞菌屬和Mariniradius在鹽度小于5‰條件下生長，而在大于5‰鹽度環(huán)境下檢測不到。研究鹽度對細菌群落結(jié)構(gòu)的影響，對弄清濱海河道藍藻水華暴發(fā)過程中水體細菌群落結(jié)構(gòu)變化及未來在耐鹽或嗜鹽功能菌的分離應用等方面具有重要意義。