地塞米松致子代大鼠海馬軸突發(fā)育損傷

謝露露， 姚寶珍

武漢大學(xué)人民醫(yī)院兒科，武漢430000

據(jù)統(tǒng)計，每年有眾多的新生兒死于早產(chǎn)并發(fā)癥。而在早產(chǎn)新生兒中，最常見的死亡原因是呼吸窘迫綜合征，這是一種與肺不成熟有關(guān)的急性肺疾病。地塞米松是一種合成的糖皮質(zhì)激素受體（glucocorticoid receptor，GR）激動劑，已廣泛應(yīng)用于早產(chǎn)新生兒，以降低新生兒呼吸窘迫綜合征的風(fēng)險［1］。早期研究表明，應(yīng)對預(yù)產(chǎn)期在34 周以下的早產(chǎn)孕婦給予合成糖皮質(zhì)激素（glucocorticoid，GC）治療后再進行分娩［2］。目前，對于有早產(chǎn)風(fēng)險的孕婦來說，產(chǎn)前合成GC 治療已成為預(yù)防呼吸窘迫綜合征、降低早期新生兒死亡率和發(fā)病率最有效的干預(yù)措施［3］。其經(jīng)典用法為每12小時肌注一次，每次6 mg，共4 次，且一般采用多療程治療。本室前期研究證實大鼠孕期注射地塞米松暴露（prenatal dexamethasone exposure，PDE）可導(dǎo)致胎兒出生后海馬神經(jīng)發(fā)育毒性和下丘腦-垂體-腎上腺軸編程改變［4-5］。研究表明，PDE 可引起子代海馬體質(zhì)量降低、體積減少，且細胞凋亡增加［5］。還有研究表明，PDE 可減少齒狀回中海馬細胞的增殖以及降低海馬神經(jīng)可塑性［6-7］。Uno 等［8］實驗發(fā)現(xiàn)PDE 的恒河猴海馬CA 區(qū)錐體神經(jīng)元和齒狀回顆粒神經(jīng)元數(shù)量減少，CA3 海馬區(qū)的苔蘚纖維的軸突突觸末端顯示出明顯的變性。有大鼠實驗表明，產(chǎn)前孕鼠使用地塞米松不同劑量及不同療程會對大鼠發(fā)育造成損傷，且免疫組化結(jié)果顯示海馬腦神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuro-specific enolase，NSE）陽性表達細胞減少，表達強度減弱［9］。因此，推測PDE 可能導(dǎo)致子代海馬發(fā)育不良。然而，PDE 所導(dǎo)致海馬發(fā)育不良的機制在很大程度上尚不清楚。

軸突在海馬發(fā)育中起著重要作用。軸突將自身神經(jīng)元的信號傳遞給其他神經(jīng)元，通過軸突和胞體-樹突之間的信號傳遞構(gòu)成了復(fù)雜的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)［10］。軸突生長是一個不連續(xù)的過程，旁側(cè)分支往往從生長錐停滯的地方長出，當(dāng)停滯的生長錐繼續(xù)生長時，分支出來的軸突也隨之同時延伸。軸突作為神經(jīng)元的組成結(jié)構(gòu)，最主要的功能是將神經(jīng)元胞體整合的神經(jīng)電信號輸出，其中軸突起始部的軸丘在絕大多數(shù)神經(jīng)元中是產(chǎn)生神經(jīng)信號的場所［11-12］。當(dāng)海馬神經(jīng)元軸突發(fā)育損傷時，神經(jīng)信號傳遞異常，導(dǎo)致海馬正常功能障礙，并可引起多種神經(jīng)精神類疾病易感。研究表明，對壬基酚的發(fā)育暴露會導(dǎo)致海馬軸突長度和密度明顯降低，并損害軸突功能，從而造成海馬神經(jīng)毒性，包括動作電位產(chǎn)生和傳播障礙、突觸小泡再循環(huán)受到破壞以及神經(jīng)可塑性抑制［13］。另有研究表明，藏紅花可通過促進海馬軸突生長，從而提高海馬神經(jīng)元活力以及促進神經(jīng)可塑性和神經(jīng)發(fā)生［14］。然而PDE是否可致子代海馬軸突發(fā)育損傷尚不清楚。

為此，本研究擬在前期工作基礎(chǔ)上開展海馬GR 改變介導(dǎo)孕期地塞米松暴露致子代大鼠海馬軸突發(fā)育損傷的研究。本研究的實施對于貫徹優(yōu)生優(yōu)育國策和早期防治胎源性海馬軸突發(fā)育不良，具有重要理論和現(xiàn)實意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF 級Wistar 大鼠雌雄各20 只（雌性平均體質(zhì)量為220±20 g，雄性平均體質(zhì)量為260±20 g）由湖北省醫(yī)院實驗中心（編號2012—2014，認證號42000600002258）提供。常規(guī)飼料飼養(yǎng)。試驗符合動物倫理學(xué)要求，實驗方案得到武漢市中南醫(yī)院倫理委員會認可與批準。

1.1.2 試劑 PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成，GR（批號sc-12763）和NAPDH（批號sc-25778）抗體購于美國Santa Ctuz 公司；GAPDH（批號AC002）抗體購于武漢愛博泰克生物科技有限公司；核酸提取劑Trizol 購于美國Invitrogen 公司；4%多聚甲醛固定購于北京艾斯本技術(shù)有限公司；異氟醚購于美國Baxter Healthcare 有限公司；地塞米松（國藥準字H42020019）購于武漢雙和藥業(yè)有限公司。

1.1.3 儀器 分光光度計和ABI Step One RT-PCR熱循環(huán)儀購于美國賽默飛世爾科技公司；光學(xué)顯微鏡購于北京生物科技公司；石蠟組織切片機購于湖南榮和科技公司；高速離心機購于上海佳德儀器公司；凈化工作臺購于蘇潔醫(yī)療器械（蘇州）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 建立地塞米松暴露大鼠模型 大鼠經(jīng)過1周的適應(yīng)性喂養(yǎng)后進行繁殖和交配。將妊娠大鼠隨機分為對照組和PDE 組，每組8 只。從妊娠第9天至妊娠第20天，PDE組和對照組大鼠分別皮下注射地塞米松0.2 mg·kg-1·d-1和等量的0.9%氯化鈉溶液。在于孕20 天上，將一部分孕鼠用異氟醚麻醉，然后處死。每組產(chǎn)仔數(shù)在8~14只的妊娠大鼠為合格，取出胎鼠并處死。從同窩中收集的剩余胎兒海馬樣本被匯集在一起，立即在液氮中冷凍，并保存在-80°C冰箱中以作進一步分析。

1.2.2 總RNA 提取和逆轉(zhuǎn)錄RT-qPCR 根據(jù)試劑盒說明書提取總RNA。用分光光度計測定分離的總RNA 的濃度和純度，調(diào)整RNA 濃度為1 μg·μL-1。從2 μg 總RNA 制備單鏈cDNA。引物見表1。RT-qPCR 在10 μL反應(yīng)混合物中進行。為了更精確地量化基因轉(zhuǎn)錄本，測量管家基因GAPDH 的mRNA 水平作為定量對照。相對擴增子表達量采用2-ΔΔCt法計算。

表1 RT-qPCR中大鼠寡核苷酸引物及反應(yīng)條件Table 1 Rat oligonucleotide primers and reaction conditions used in RT-qPCR

1.2.3 蛋白免疫印跡 使用蛋白免疫印跡法檢測大鼠海馬和H19-7 細胞中相應(yīng)的蛋白表達。用GR 抗體（1∶2 000 稀釋）、GAPDH 抗體（1∶5 000 稀釋）在4°C 過夜。洗膜后再加入二抗繼續(xù)室溫孵育1 h，采用Image Pro Plus 軟件通過光密度測定法對條帶進行分析。

1.2.4 統(tǒng)計與分析 采用SPSS 20.0 和Prism 8.0對實驗數(shù)據(jù)進行分析。所有數(shù)據(jù)均表示為平均值±標準差。獨立樣本t檢驗比較了對照組和PDE組的平均值。多組比較采用單因素方差分析檢驗，然后采用Dunnett-t檢驗確定兩組之間的顯著差異。P＜0.05被認為有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 PDE致子代胎鼠海馬軸突損傷

生長相關(guān)蛋白43（growth associated protein-43，GAP43）、信號素3A（semaphorin 3A，SEMA3A）和集聚蛋白（AGRIN）是反映軸突生長發(fā)育的重要指標。與對照組相比，PDE組子代胎鼠GAP43、SEMA3A和AGRIN mRNA 表達明顯下調(diào)（P＜0.01，圖1）。提示PDE可致子代胎鼠海馬軸突損傷。

圖1 子代胎鼠海馬軸突損傷指標表達變化Fig.1 Changes of hippocampal axon injury index in offspring fetal rats

2.2 PDE成年子代大鼠海馬軸突損傷

本研究檢測了成年子代大鼠的GAP43、SEMA3A 和AGRIN 的表達。結(jié)果顯示，與對照組相比，成年子代大鼠GAP43、SEMA3A 和AGRIN mRNA 表達也出現(xiàn)了明顯下調(diào)（P＜0.01，圖2）。提示PDE 致子代大鼠軸突發(fā)育損傷，并可延續(xù)至出生后。

圖2 子代成年大鼠海馬軸突損傷指標表達變化Fig.2 Expression changes of hippocampal axon injury indexes in offspring adult rats

2.3 PDE子代胎鼠海馬GR活化

地塞米松通過活化海馬GR 信號發(fā)揮效應(yīng)，糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)激酶1（glucocorticoid-regulated kinase 1，SGK1）和FK506 結(jié) 合 蛋 白（FK506 binding protein 5，F(xiàn)KBP5）是GR 的下游效應(yīng)分子，其表達可反映GR 活化情況。如圖3 所示，與對照組相比，宮內(nèi)PDE 胎鼠海馬GR mRNA 和蛋白表達顯著增加（P＜0.01），同時下游效應(yīng)分子SGK1 和FKBP5 mRNA 表 達 也 顯 著 增 加（P＜0.01）。結(jié)果表明，宮內(nèi)時期PDE 可致胎鼠海馬GR 活化。

圖3 子代胎鼠海馬GR活化指標變化Fig.3 Changes of hippocampal GR activation in offspring fetal rats

2.4 PDE成年子代大鼠海馬GR無明顯變化

與對照組相比，PDE 出生后子代大鼠海馬GR、SGK1 和FKBP5 的mRNA 表達無明顯變化（P＞0.05，圖4A-C）。蛋白免疫印跡結(jié)果也表明，PDE成年子代大鼠海馬GR 蛋白也無明顯變化（P＞0.05，圖4D，E）。結(jié)果表明，宮內(nèi)時期PDE 可致胎鼠海馬GR/HDAC2 信號活化，但該變化不延續(xù)至出生后。

圖4 成年子代大鼠海馬GR活化指標變化Fig.4 Changes of hippocampal GR activation indexes in adult offspring rats

3 討論

地塞米松在臨床上被廣泛用于多種早產(chǎn)相關(guān)疾病的治療，如前置胎盤、多胎妊娠、先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥等［15-16］。臨床對于孕24~34周且有早產(chǎn)傾向的孕婦，常規(guī)給予單療程或多療程地塞米松治療，可促進胎兒肺成熟、減少新生兒呼吸窘迫綜合征發(fā)生和降低圍生兒死亡率［17］。然而，近年來越來越多的研究表明，產(chǎn)前應(yīng)用地塞米松具有“雙刃劍”效應(yīng)，在有效防治妊娠疾病的同時可能引起子代的系列發(fā)育毒性，如胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩、神經(jīng)發(fā)育受損等［18-19］。根據(jù)人和大鼠的劑量轉(zhuǎn)換關(guān)系（人∶大鼠=1∶6.17）和臨床地塞米松用藥劑量標準（0.05~0.2 mg·kg-1·d-1）［19］，本研究中使用0.2 mg·kg-1·d-1地塞米松暴露量相當(dāng)于0.03 mg·kg-1·d-1人群用藥劑量［20］。因此，本研究在實驗中使用的地塞米松劑量是合理的，具有臨床現(xiàn)實意義。

GAP43 是一種胞膜磷酸蛋白質(zhì)，也是神經(jīng)元發(fā)育和可塑性的分子標志物，在引導(dǎo)軸突生長和調(diào)節(jié)軸突形成上起著關(guān)鍵作用［21］。SEMA3A 作為神經(jīng)軸突發(fā)育的一個關(guān)鍵信號蛋白，參與多種生理過程。SEMA3A 是一種分泌性蛋白，屬于3 號信號素家族，參與軸突排斥、樹突分支、突觸形成和神經(jīng)元遷移過程［22］。AGRIN 是誘導(dǎo)神經(jīng)元分化的“終止信號”，能夠調(diào)節(jié)軸突和樹突的生長以及樹突分支［23］。因此，本研究選擇GAP43、SEMA3A和AGRIN作為反映軸突損傷指標。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PDE 子 代 出 生 前、后GAP43、SEMA3A 和AGRIN 表達均顯著增加，這些結(jié)果證實，PDE 可導(dǎo)致子代海馬軸突發(fā)育損傷，且這些改變可一直延續(xù)到出生后。

地塞米松作為外源性糖皮質(zhì)激素作用于組織局部GR后，可以通過調(diào)控胎兒時期組織發(fā)育相關(guān)相關(guān)基因表達介導(dǎo)子代大鼠出生前、后多臟器（睪丸、長骨等）發(fā)育不良并介導(dǎo)相關(guān)成年疾病易感。本研究結(jié)果表明，PDE 可活化子代胎鼠海馬GR。海馬發(fā)育可從胚胎期一直持續(xù)至出生后，但胚胎期和出生后早期為海馬發(fā)育的最重要時期，此階段其發(fā)育過程對外界環(huán)境的變化尤其敏感，而各種母體宮內(nèi)環(huán)境的改變可通過多種機制對海馬的結(jié)構(gòu)與認知功能產(chǎn)生不可逆的長期影響，增加子代成年后對多種神經(jīng)精神疾病的易感性。軸突初始節(jié)（axon initial segment，AIS）的結(jié)構(gòu)和功能可塑性對控制神經(jīng)元興奮性具有重要作用，而癲癇發(fā)病與神經(jīng)元興奮性密切相關(guān)［24］。相關(guān)研究表明，毛果蕓香堿誘發(fā)的癲癇大鼠在海馬新生神經(jīng)元中表現(xiàn)出較短的AIS 長度［24］?；加袊乐匕d癇的患者中重編程神經(jīng)元顯示出明顯的軸突形成缺陷［25］。在毛果蕓香堿誘發(fā)的癲癇模型中，海馬苔蘚纖維發(fā)芽增強，神經(jīng)變性增加，軸突生長抑制以及神經(jīng)元遷移異常［26-27］。近期研究發(fā)現(xiàn)，在毛果蕓香堿誘發(fā)的癲癇模型中，出現(xiàn)軸突異常再生或發(fā)芽，并進一步通過增強GABA 信號從而延遲少突膠質(zhì)細胞成熟以及引起髓鞘形成障礙［28］。此研究也存在一定的局限性，尚未聚焦軸突與相關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)如癲癇的關(guān)聯(lián)，以及GR導(dǎo)致海馬軸突損傷之間的信號通路改變。后續(xù)將在分子水平對PDE 介導(dǎo)GR 活化導(dǎo)致子代海馬軸突損傷的表觀遺傳機制進行研究，并與相關(guān)臨床神經(jīng)精神疾病聯(lián)系。