雌激素對(duì)SD 大鼠腎臟缺血再灌注腎小管上皮細(xì)胞Cx43 蛋白表達(dá)的影響

馬義博， 常越辰， 馬克濤， 李麗， 王勤章， 李應(yīng)龍，3*

1.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆 石河子832000；2.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院泌尿外科，新疆 石河子832000；3.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬第五人民醫(yī)院泌尿外科，成都611130

臨床上缺血-再灌注損傷（ischemic reperfusion injury，IRI）多見于冠心病、腎移植手術(shù)、肝移植手術(shù)等疾病或手術(shù)中。當(dāng)血流中斷或減少時(shí)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞缺血缺氧，進(jìn)而引發(fā)組織或器官損傷，且缺血時(shí)產(chǎn)生的代謝物及介質(zhì)會(huì)導(dǎo)致?lián)p傷加重，具體表現(xiàn)為細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)、功能、代謝及電生理方面發(fā)生進(jìn)一步的損傷［1］。腎臟缺血再灌注（ischemia-reperfusion，I/R）在臨床中多由心臟驟停（全身低灌注）及腎臟外科手術(shù)干預(yù)造成［2］。在腎臟移植手術(shù)中，腎臟損傷開始于供體器官取出后短暫的熱缺血，然后在低溫保存中進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的冷缺血，最后在受體植入期間以熱缺血結(jié)束。血運(yùn)重建后，腎臟血流再灌注激活一系列事件會(huì)加重腎臟損傷［3］，進(jìn)而導(dǎo)致腎臟出現(xiàn)血流動(dòng)力學(xué)改變、炎癥和腎小管上皮細(xì)胞損傷［4-5］。有研究發(fā)現(xiàn)，腎臟I/R 后腎小管上皮細(xì)胞胞膜離子進(jìn)出功能障礙，細(xì)胞粘附能力減弱，最終導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞凋亡［6］。縫隙連接（gap junctions，GJs）膜通道由連接蛋白（connexin，Cx）組成，為小分子和離子進(jìn)出以及旁分泌信號(hào)傳導(dǎo)提供管道，其中Cx43在腎臟組織中表達(dá)最為豐富［7-9］。當(dāng)腎臟發(fā)生缺血再灌注損傷時(shí)，Cx43 通過多種作用參與細(xì)胞的損傷和凋亡［10］。有研究發(fā)現(xiàn)，抑制Cx43的表達(dá)可減少相鄰細(xì)胞間活性氧（reactive oxygen species，ROS）通過，抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，減少壞死性凋亡，從而減輕肝移植后的急性腎臟損傷［11］。

雌激素是一種性激素，在人體中主要由卵巢產(chǎn)生，包括雌酮（estrone，E1）、17β-雌二醇（17β-estradiol，E2）和雌三醇（estriol，E3），但大多數(shù)的雌激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)主要是由E2來完成的［12］。E2除了在可生育女性卵巢中產(chǎn)生外，在其他組織中可通過芳香化酶將睪酮轉(zhuǎn)化為E2［13］，芳香化酶在不同的性腺外組織中均有表達(dá)，如脂肪、骨骼和大腦［14］。雌激素可明顯減輕多個(gè)臟器的缺血再灌注損傷及腦海馬細(xì)胞和肝細(xì)胞的凋亡［15?16］。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，E2可調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞、皮質(zhì)骨和小梁骨中Cx43的表達(dá)，從而影響心肌細(xì)胞和骨細(xì)胞的凋亡［17-18］。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，雌激素受體激動(dòng)劑對(duì)腎臟I/R 后腎小管上皮細(xì)胞凋亡起保護(hù)作用［19］，但對(duì)腎缺血再灌注損傷腎組織GJs 功能的影響尚不明確?；诖耍狙芯恐荚谔接懘萍に貙?duì)腎臟I/R 的保護(hù)作用機(jī)制與腎小管上皮細(xì)胞中Cx43 表達(dá)水平的關(guān)系，以期為治療腎臟I/R 探索新的途徑。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

由新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心購(gòu)入32 只SPF 級(jí)雌性SD 大鼠［許可證編號(hào)：SCXK（新）2018-0001］，周齡10～13 周，平均體質(zhì)量250±30 g，本試驗(yàn)已通過石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物管理與使用委員會(huì)批準(zhǔn)（編號(hào)：A2019-170-01）。在清潔動(dòng)物房標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)雌性SD 大鼠，每籠4 只，保證墊料、食水充足，動(dòng)物房溫度24±2 ℃，濕度50%±5%。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

雌激素（E2）購(gòu)于美國(guó)Sigma 公司；兔抗Cx43購(gòu)于美國(guó)Abcam 公司；大鼠抗β-actin、山羊抗兔抗體、山羊抗大鼠抗體購(gòu)于北京中杉金橋公司；戊巴比妥鈉購(gòu)于上海生工生物有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。Cobas8000 全自動(dòng)生化分析儀購(gòu)于瑞士Roche公司；DYY-6D 型電泳儀購(gòu)于北京六一生物科技公司；5920 R 低溫高速離心機(jī)購(gòu)于德國(guó)Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 雌性SD 大鼠去卵巢模型及腎臟缺血再灌注損傷模型的制備 32 只健康雌性SD 大鼠均在禁食禁水6 h 后，于左下腹外側(cè)部注射3%戊巴比妥鈉（50 mg·kg?1）進(jìn)行麻醉，選擇大鼠雙側(cè)背部外側(cè)最凸起的位置做一手術(shù)切口切除雙側(cè)卵巢［20］。術(shù)后恢復(fù)14 d后，32只雌性SD大鼠隨機(jī)分為OVX組、OVX+Sham 組、OVX+I/R 組和OVX+I/R+E2組，每組8只。OVX組不進(jìn)行任何處理；OVX+Sham組行假手術(shù)處理：麻醉成功后沿雙側(cè)肋中線分別縱行切開，暴露雙側(cè)腎臟，并切除右腎，45 min后關(guān)閉腹腔；OVX+I/R組行缺血再灌注處理：麻醉成功后沿雙側(cè)肋中線分別縱行切開，暴露雙側(cè)腎臟，并切除右腎，剝離左腎蒂周圍組織，使用無創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉腎蒂中分離的左腎腎動(dòng)脈，腎臟由鮮紅變?yōu)榘导t，持續(xù)缺血45 min 后，去除動(dòng)脈夾，腎臟再次變?yōu)轷r紅色后，關(guān)閉腹腔，恢復(fù)血流灌注24 h；OVX+I/R+E2組在行缺血再灌注處理前3 d連續(xù)進(jìn)行雌激素干預(yù)處理：在OVX+I/R組基礎(chǔ)上，于缺血再灌注損傷建立前經(jīng)腹腔注射給予100 μg·kg?1·d?1雌激素進(jìn)行干預(yù)，連續(xù)干預(yù)3 d，其他3組均給予等量溶劑（棉籽油）。

1.3.2 各組大鼠血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）和血肌酐（serum creatinine，SCr）檢測(cè) 各組大鼠血流灌注24 h后，腹腔注射3%戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉，于主動(dòng)脈采血，將采集的血液標(biāo)本，于4 ℃4 000 r·min?1離心10 min，分離上清，送石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)各組大鼠血液標(biāo)本BUN、SCr水平。

1.3.3 各組大鼠腎臟組織病理檢查和Paller 評(píng)分比較 各組大鼠血流灌注24 h 后，腹腔注射3%戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉，取左側(cè)腎臟行常規(guī)石蠟包埋，光鏡下觀察大鼠腎臟組織病理情況。采用Paller評(píng)分［21］評(píng)估腎小管損傷程度，所有切片光鏡下觀察均采用雙盲法，由兩名病理科主任醫(yī)師閱片，兩人結(jié)果一致則記錄結(jié)果，如有爭(zhēng)議請(qǐng)第3名病理科醫(yī)生看片，以兩名醫(yī)生結(jié)果相同為最終結(jié)果。每張切片隨機(jī)選擇10 個(gè)含有腎小球的視野并進(jìn)行評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：腎小管結(jié)構(gòu)正常計(jì)0分，腎小管管徑增寬變形計(jì)1 分，管腔內(nèi)有脫落壞死細(xì)胞（未成管型/細(xì)胞碎片）計(jì)1 分，上皮細(xì)胞形態(tài)改變計(jì)1 分，刷狀緣損傷計(jì)1 分，刷狀緣脫落計(jì)2分，有管型計(jì)2分［22］。

1.3.4 免疫組化檢測(cè)Cx43 蛋白的表達(dá) 石蠟切片在67 ℃恒溫箱烘烤2 h，二甲苯脫蠟后乙醇復(fù)水，抗原修復(fù)液修復(fù)抗原后用PBS 漂洗，加入Cx43 一抗（1∶200）4 ℃孵育過夜，次日復(fù)溫45 min后，PBS漂洗，加入二抗（1∶200），室溫孵育30 min，洗3 次，二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）染色后觀察。

1.3.5 蛋白印跡法檢測(cè)Cx43 蛋白表達(dá) 取凍存腎臟組織加入蛋白裂解液研磨提取蛋白，離心機(jī)4 ℃、12 000 r·min?1離心5 min，離心后分離上清，使用BCA 試劑盒測(cè)定蛋白濃度。各組取15 μg 進(jìn)行凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF 上，封閉2 h。TBST 漂洗3次，加入Cx43一抗（1∶1 000）4 ℃孵育過夜；次日TBST 漂洗3 次，加入Cx43 二抗（1∶10 000）孵育2 h，暗室中顯色曝光，顯影后定影。Image J 測(cè)定蛋白條帶灰度值，以β-actin 蛋白為內(nèi)參，并進(jìn)行半定量分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 雌激素對(duì)腎臟I/R后腎功能的影響

如圖1 所示，OVX 組與OVX+Sham 組SCr 和BUN 水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說明手術(shù)對(duì)大鼠腎功能無明顯影響；OVX+I/R 組SCr 和BUN 水平均顯著高于OVX 組（P＜0.05），說明 腎 臟I/R 模 型 制 備 成 功；OVX+I/R+E2組SCr、BUN 水平均顯著低于OVX+I/R 組（P＜0.05），說明雌激素可以減輕大鼠腎功能損傷。

圖1 各組大鼠BUN和SCr水平比較Fig.1 Comparison of the levels of BUN and SCr among different groups of rats

2.2 雌激素對(duì)腎臟I/R 后腎實(shí)質(zhì)及腎小管上皮細(xì)胞的影響

如圖2 所示，光鏡下觀察HE 染色結(jié)果顯示，OVX 組及OVX+Sham 組可見腎小管無擴(kuò)張，內(nèi)皮細(xì)胞排列整齊，無管型堆積。與OVX 組相比，OVX+I/R 組腎小球皺縮變形明顯，部分腎小管管腔內(nèi)刷狀緣損傷脫落明顯，結(jié)構(gòu)改變，腎小管上皮細(xì)胞水腫及細(xì)胞核脫落明顯；OVX+I/R+E2組腎小管擴(kuò)張減輕，管型相對(duì)完整，腎小球皺縮及腎小管上皮細(xì)胞核脫落少于OVX+I/R 組。OVX 組與OVX+Sham 組Paller 評(píng)分比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與OVX 組相比，OVX+I/R 組Paller 評(píng)分顯著升高（P＜0.05）；OVX+I/R+E2組Paller 評(píng)分顯著低于OVX+I/R組（P＜0.05）。結(jié)果表明假手術(shù)不會(huì)造成腎臟損傷，缺血再灌注對(duì)腎臟造成巨大損傷，雌激素干預(yù)后腎臟損傷明顯減輕。

圖2 各組大鼠腎組織病理改變和Paller評(píng)分比較Fig.2 Comparison of histopathological changes in kidney tissues and Paller scores among different groups of rats

2.3 Cx43 蛋白在大鼠腎小管上皮細(xì)胞中的表達(dá)分析

如圖3 所示，免疫組化結(jié)果表明，腎小管上皮細(xì)胞中Cx43 蛋白主要分布于細(xì)胞胞漿中。OVX組與OVX+Sham 組Cx43 蛋白陽(yáng)性表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與OVX組相比，OVX+I/R組Cx43 蛋白陽(yáng)性表達(dá)顯著增加（P＜0.05）；與OVX+I/R 組 相 比，OVX+I/R+E2組Cx43 蛋 白 陽(yáng) 性表達(dá)顯著減少（P＜0.05）。結(jié)果表明假手術(shù)不會(huì)影響腎小管上皮細(xì)胞Cx43的表達(dá)，腎臟缺血再灌注后腎小管上皮細(xì)胞Cx43的表達(dá)明顯增加，雌激素干預(yù)后腎小管上皮細(xì)胞Cx43表達(dá)減少。

圖3 Cx43在各組大鼠腎小管上皮細(xì)胞中的表達(dá)Fig.3 The expression of Cx43 in renal tubular epithelial cells among different groups of rats

3 討論

泌尿外科手術(shù)中常需要阻斷腎臟血供，而血運(yùn)重建后會(huì)加重腎臟損傷，這種病理現(xiàn)象被稱為腎臟I/R［23］。腎臟I/R 可引起急性腎損傷，導(dǎo)致BUN、SCr 水平升高［24］，最終導(dǎo)致腎臟功能障礙，但目前尚缺乏有效的治療方法［25-26］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，通過激活雌激素受體可抑制腎臟I/R后產(chǎn)生的氧化應(yīng)激反應(yīng)［27］，并抑制腎小管上皮細(xì)胞的凋亡［19］。有研究為避免雌性大鼠自身產(chǎn)生雌激素對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響，對(duì)雌性大鼠實(shí)施了切除雙側(cè)卵巢處理［28-29］，結(jié)果表明，在去卵巢2 周后E2水平明顯降低。本研究結(jié)果表明，與OVX 組相比，OVX+I/R 組大鼠SCr、BUN 水平和Paller 評(píng)分均顯著升高（P＜0.05），提示腎功能及腎小管上皮細(xì)胞有明顯損傷；與OVX+I/R 組相比，OVX+I/R+E2組SCr、BUN水平和Paller評(píng)分顯著降低，腎組織病理學(xué)改變及Paller評(píng)分結(jié)果顯示，雌激素干預(yù)后腎小管管型結(jié)構(gòu)受損減輕，管狀緣、刷狀緣脫落減少，腎小管上皮細(xì)胞核脫落減少，Paller 評(píng)分降低，說明腎功能得到了改善，與前人研究結(jié)果一致［27-19］。

縫隙連接介導(dǎo)分子和電荷的細(xì)胞間轉(zhuǎn)移［30］，是多數(shù)器官功能障礙的生物學(xué)基礎(chǔ)。因此，探討雌激素抑制腎小管上皮細(xì)胞凋亡相關(guān)的機(jī)制具有重要意義?？p隙連接細(xì)胞間通訊對(duì)于細(xì)胞分化和生長(zhǎng)、正常生理以及不同組織中氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)至關(guān)重要［31］。相關(guān)研究［32］表明，在心肌缺血再灌注損傷中可通過抑制Cx43 從而減少心肌缺血后的梗死面積，此外，在腦缺血再灌注損傷中星形細(xì)胞Cx43 在神經(jīng)炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用［33］。Cx43 縫隙連接蛋白在成骨細(xì)胞中也充分表達(dá)，在骨重塑及成骨細(xì)胞活動(dòng)中發(fā)揮重要作用。當(dāng)雌激素水平降低時(shí)，成骨細(xì)胞Cx43半通道活性降低，進(jìn)而導(dǎo)致成骨細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激抵抗力下降［34］。另外在成骨細(xì)胞中雌激素可以通過Cx43介導(dǎo)的縫隙連接信號(hào)通路MC3T3-E1 調(diào)節(jié)成骨樣細(xì)胞的增殖及分化，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)礦化［35］。在心血管疾病中，雌激素可通過降低淋巴細(xì)胞中Cx40/Cx43 的表達(dá)，以減輕高血壓的炎癥和終末器官損傷［36］；同時(shí)，雌激素還可通過抑制淋巴細(xì)胞白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-6釋放并下調(diào)Cx40 水平［37］。雌激素的生理效應(yīng)由經(jīng)典的雌激素受體ERa和ERb以及G蛋白偶聯(lián)雌激 素 受 體（G protein-coupled estrogen receptor，GPER）介導(dǎo)［38-39］。雌激素與雌激素受體結(jié)合導(dǎo)致構(gòu)象變化，促進(jìn)受體二聚化并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，在細(xì)胞核中識(shí)別目標(biāo)基因啟動(dòng)子區(qū)域的不同DNA 序列［40-41］。ERα 和ERβ 在小鼠和大鼠的腎臟中均有表達(dá)［42-43］，但二者主要定位于小鼠腎近端小管，較少定位于遠(yuǎn)端腎單位［42］。雌激素和ER 在腎臟的多種病理過程中發(fā)揮重要作用，雌激素通過其受體參與腎臟修復(fù)和再生，改變或失調(diào)的雌激素/ERs 信號(hào)通路可能導(dǎo)致多種腎臟疾病，包括急性腎損傷、糖尿病腎病、狼瘡腎炎、IgA 腎病等。臨床研究表明，靶向雌激素/ERs 信號(hào)通路可能對(duì)某些腎臟疾病具有保護(hù)作用［44］。Kurtz 等［45］在腎血管系統(tǒng)、系膜細(xì)胞以及集合管中發(fā)現(xiàn)Cx43廣泛存在。Wagner等［46］研究表明，Cx在腎循環(huán)中具有重要意義。Cx43被認(rèn)為是表達(dá)最廣泛的Cx，并認(rèn)為其在腎臟疾病中扮演重要角色［7］。GJs 介導(dǎo)不同器官中細(xì)胞信號(hào)分子的細(xì)胞間運(yùn)動(dòng)，其是導(dǎo)致器官進(jìn)一步損傷的生物學(xué)基礎(chǔ)，且通常與Cx43通道介導(dǎo)的不同類型的信號(hào)傳遞有關(guān)，如“死亡信號(hào)”和“保護(hù)信號(hào)”［47］。Hver-garae 等［48］發(fā)現(xiàn)抑制Cx43有利于腎臟保護(hù)，主要是通過減少“死亡信號(hào)”的傳遞實(shí)現(xiàn)的，原因?yàn)樵谀I臟I/R 過程中，可能導(dǎo)致大量“死亡信號(hào)”的產(chǎn)生，并增加腎臟中Cx43的表達(dá)?！八劳鲂盘?hào)”通過由Cx43 組成的GJs 持續(xù)傳遞到鄰近細(xì)胞，導(dǎo)致?lián)p傷范圍擴(kuò)大和惡化。因此，減少GJs 介導(dǎo)的“死亡信號(hào)”向鄰近細(xì)胞的擴(kuò)散，可在一定程度上保護(hù)細(xì)胞，并防止損傷不斷惡化和擴(kuò)大［11］，這可能是一種預(yù)防腎臟I/R 的新途徑。本研究中免疫組化和蛋白印跡結(jié)果表明，與OVX組相比，OVX+I/R 組Cx43 表達(dá)明顯升高，說明腎臟功能及腎小管上皮細(xì)胞損傷與Cx43 蛋白表達(dá)增加有關(guān)；與OVX+I/R 組相比，OVX+I/R+E2組腎小管上皮細(xì)胞中Cx43蛋白表達(dá)明顯減少，表明雌激素可以減輕腎臟缺血再灌注損傷造成的腎臟損傷，可能是通過調(diào)節(jié)腎小管上皮細(xì)胞中Cx43表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，雌激素可能通過減少腎小管上皮細(xì)胞中Cx43 蛋白的表達(dá)來減輕腎臟缺血再灌注后的腎損傷，說明雌激素對(duì)腎臟缺血再灌注具有保護(hù)作用，但本研究未對(duì)這一過程的直接途徑及信號(hào)傳導(dǎo)進(jìn)行分析，未來還需進(jìn)行更深入的研究以闡明具體機(jī)制，為臨床治療腎臟缺血再灌注后腎損傷提供新思路。