長(zhǎng)鏈非編碼RNA ZFAS1在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及生物學(xué)功能

武麗娜， 彭小忠， 魯重美*

1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院消化內(nèi)科，北京100730；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100730

結(jié)直腸癌是威脅人類身體健康的高發(fā)腫瘤，據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)結(jié)直腸癌死亡率在所有腫瘤中居第5 位，該病5 年生存率為66.1%，但出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移時(shí)，患者5 年生存率會(huì)降至12.5%［1］。結(jié)腸腺瘤-腺癌序列最早是由病理學(xué)家Basil 發(fā)現(xiàn)并定義的，此后該序列各步驟發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制被逐漸完善［2］，并通過分子遺傳學(xué)研究揭示了一些新的癌基因及抑癌基因參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展［3］。人類基因組大約75%的基因可轉(zhuǎn)錄為RNA，其中僅有約2%的基因與編碼蛋白相關(guān)，其余均為非編碼RNA［4］。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是一類長(zhǎng)度超過200 nt、無蛋白質(zhì)編碼功能的RNA 分子，其可以在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平及表觀遺傳水平發(fā)揮作用［4-5］，同時(shí)與部分腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)［6-7］。LncRNA 鋅指核轉(zhuǎn)錄因子反義鏈1（zinc finger nuclear transcription factor antisense RNA 1，ZFAS1）位于20q13，是鋅指核轉(zhuǎn)錄因子1（zinc finger nuclear transcription factor，Xbox binding 1-type containing 1，ZNFX1）的 反 義RNA，同時(shí)也是3 個(gè)C/D 盒小核仁RNA（C/D-box snoRNAs，SNORDs），即SNORD12C、SNORD12B及SNORD12 的載體。ZFAS1 包括10 種轉(zhuǎn)錄本，長(zhǎng)度為504~1 075 bp。ZFAS1 的全長(zhǎng)尚不清楚，且目前也鮮見對(duì)ZFAS1 進(jìn)行cDNA 末端快速擴(kuò)增技術(shù)（rapid amplification of cDNA ends，RACE）實(shí)驗(yàn)的報(bào)道。本研究旨在探討ZFAS1 在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及生物學(xué)功能，并以ZNFX1 為切入點(diǎn)，以期明確ZFAS1 在結(jié)直腸癌中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2014 年10 月—2015 年7 月于北京協(xié)和醫(yī)院進(jìn)行結(jié)直腸癌手術(shù)，且手術(shù)病理結(jié)果證實(shí)為結(jié)直腸癌的患者67 例作為研究對(duì)象，其中男37例，平均年齡63 歲；女30 例，平均年齡65 歲。統(tǒng)計(jì)所有患者的臨床資料及病理資料，并將所有患者結(jié)直腸癌標(biāo)本及配對(duì)正常結(jié)直腸組織浸入RNA laterTM（Ambion 公司）中，置于?20 ℃冰箱保存。所有患者均對(duì)本研究知情并自愿簽署知情同意書，本研究已通過北京協(xié)和醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 材料

人結(jié)腸癌細(xì)胞系HT-29、LoVo、SW480、HCT-116、RKO、HCT-8、HCT-15、DLD1及人結(jié)腸上皮細(xì)胞系CCD841CoN 均購自北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心，且均源于美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫（https：//www.atcc.org/）。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time PCR）測(cè)定目的基因在結(jié)腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平 所有組織及細(xì)胞均由總RNA 抽提試劑TRIzol（Invitrogen 公司）裂解并提取總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Roche 公司）說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，按照SYBR Premix Ex Taq試劑盒（TaKaRa公司）說明書進(jìn)行realtime PCR檢測(cè)，引物序列見表1。

表1 ZFAS1和ZNFX1的real-time PCR引物Table 1 The real-time PCR primers of ZFAS1 and ZNFX1

1.3.2 Western blot 實(shí)驗(yàn)測(cè)定ZNFX1 在結(jié)腸癌細(xì)胞系中的表達(dá) 裂解結(jié)腸癌細(xì)胞，根據(jù)BCA 蛋白試劑盒（Abcam 公司）說明書檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度。蛋白經(jīng)8%SDS-PAGE 膠分離、轉(zhuǎn)膜、封閉，分別經(jīng)一抗（抗ZNFX1抗體或抗β-actin抗體）及二抗孵育，采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（enhanced chemiluminescence，ECL）顯影。利用Image J 軟件計(jì)算各蛋白條帶吸光度與β-actin 吸光度的比值，并進(jìn)行半定量分析。

1.3.3 通過轉(zhuǎn)染小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）敲低目的基因 根據(jù)INTERFERinTM（Polyplus 公司）說明書將siRNA（30 pmol·mL?1）轉(zhuǎn)染至LoVo、SW480、HCT-116細(xì)胞。針對(duì)ZFAS1基因的2個(gè)siRNA序列見表2。

表2 siRNA序列Table 2 The sequences of siRNA

1.3.4 通過轉(zhuǎn)染表達(dá)載體質(zhì)粒過表達(dá)目的基因 構(gòu)建ZNFX1 CDS 區(qū)第1~5 757 位的克隆質(zhì)粒并命名為ZNFX1-1-5757bp，該表達(dá)載體質(zhì)粒包括ZN-FX1 的全長(zhǎng)；構(gòu)建ZNFX1 CDS 區(qū)第1~3 646 位的克隆質(zhì)粒并命名為ZNFX1-1-3646bp，該表達(dá)載體質(zhì)粒包括ZNFX1 的兩個(gè)AAA 結(jié)構(gòu)域。根據(jù)Lipofectamine 2000（Invitrogen 公司）說明書將這兩個(gè)表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至LoVo、SW480、HCT-116 細(xì)胞，從而過表達(dá)克隆質(zhì)粒所攜帶的基因片段。

1.3.5 細(xì)胞活力試驗(yàn)測(cè)定結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖能力在96 孔板中將各組細(xì)胞以3×103個(gè)細(xì)胞·孔?1鋪板，根據(jù)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)試劑盒（Promega 公司）說明書，將四氮唑化合物［3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-5-（3-carboxymethoxyphenyl）-2-（4-sulfophenyl）-2H-tetrazolium，MTS］及電子偶聯(lián)劑（phenazine methosulfate，PMS）按體積比20∶1 配制MTS/PMS 溶液，將MTS/PMS 與細(xì)胞培養(yǎng)基按體積比為1∶5 加入培養(yǎng)基中，繼續(xù)在37℃、5% CO2孵箱培養(yǎng)4 h。以630 nm 波長(zhǎng)處的吸光度值作為校正，分別取5 個(gè)時(shí)間點(diǎn)（轉(zhuǎn)染后0、24、48、72、96 h）在490 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度，設(shè)3 次生物學(xué)重復(fù)。

1.3.6 平板克隆形成試驗(yàn)測(cè)定結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖能力 在轉(zhuǎn)染后24 h，在6 孔板中將各組細(xì)胞以3×103個(gè)細(xì)胞·孔?1鋪板，置于37 ℃、5%CO2及飽和濕度（95%）環(huán)境下，靜置培養(yǎng)10~14 d，待各孔中出現(xiàn)肉眼可見克隆時(shí)終止培養(yǎng)，并采用4%多聚甲醛固定，2.5%結(jié)晶紫染色，計(jì)數(shù)每孔克隆數(shù)目，設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)。

1.3.7 Transwell遷移試驗(yàn)測(cè)定結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移能力 以1×105個(gè)細(xì)胞·孔?1將各組細(xì)胞接種于Transwell上層小室中，小室中加入無血清培養(yǎng)基，在下層小室中加入含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基。在37 ℃、5% CO2孵箱孵育24~48 h，并采用4%多聚甲醛固定，2.5%結(jié)晶紫染色，在M205 體視顯微鏡（Leica 公司）下統(tǒng)計(jì)遷移到下層小室的細(xì)胞數(shù)，設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩獨(dú)立樣本間比較采用t檢驗(yàn)，多組樣本間比較采用One-Way ANOVA 檢驗(yàn)，兩獨(dú)立樣本的四格表資料采用Chi-square 檢驗(yàn)；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZFAS1 在結(jié)直腸癌組織及結(jié)腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平

如圖1 所示，ZFAS1 在結(jié)腸癌細(xì)胞系（DLD1、HCT-116、LoVo、HCT-8、HT-29 及RKO）中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于正常結(jié)腸上皮細(xì)胞系（CCD841 CoN），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。ZFAS1 在結(jié)直腸癌組織中的相對(duì)表達(dá)量（0.56±0.09）顯著高于癌旁正常組織（0.23±0.04），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果表明，ZFAS1 在結(jié)直腸癌組織及結(jié)腸癌細(xì)胞系中高表達(dá)。

圖1 ZFAS1在結(jié)腸癌細(xì)胞系和結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平Fig.1 The expression levels of ZFAS1 in colorectal cancer cell lines and colorectal cancer tissues

2.2 ZFAS1 在結(jié)直腸癌中表達(dá)水平與臨床病理學(xué)資料的相關(guān)性

ZFAS1在結(jié)直腸癌組織中相對(duì)表達(dá)量的中位數(shù)為0.35，并以此作為分界值將67 例患者分為高表達(dá)組（≥0.35）及低表達(dá)組（＜0.35）。由表3可知，高表達(dá)組與低表達(dá)組在性別、年齡、血癌胚抗原水平、腫瘤部位、腫瘤大小、分化程度、腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及TNM 分期比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果表明，ZFAS1 在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)或低表達(dá)與結(jié)直腸癌患者的臨床病理學(xué)情況無顯著相關(guān)性。

表3 ZFAS1的表達(dá)與結(jié)直腸癌患者的臨床病理資料的相關(guān)性Table 3 Correlation between ZFAS1 and clinicopathological data of colorectal cancer patients n(%)

2.3 敲低ZFAS1 對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)及遷移的影響

選取3 株應(yīng)用廣泛，細(xì)胞培養(yǎng)難度低結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT-116、LoVo 及SW480 進(jìn)行后續(xù)的生物學(xué)功能試驗(yàn)。檢測(cè)ZFAS1 siRNAs 轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細(xì)胞系的敲低效果，由圖2 可知，與control siRNA 相比，ZFAS1 siRNA1 及ZFAS1 siRNA2 均可顯著下調(diào)ZFAS1的表達(dá)量（P＜0.05），且ZFAS1 siRNA1的作用更明顯，因此，選用ZFAS1 siRNA1 進(jìn)行后續(xù)細(xì)胞功能學(xué)試驗(yàn)。敲低ZFAS1 后，結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT-116、LoVo 及SW480 的克隆形成數(shù)量均少于control siRNA。敲低ZFAS1 后，結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT-116、LoVo 及SW480 的活細(xì)胞數(shù)量均顯著少于control siRNA（P＜0.05）。敲低ZFAS1 后，結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT-116、LoVo 及SW480 穿過Transwell微孔濾膜的細(xì)胞數(shù)量均少于control siRNA。結(jié)果表明，敲低ZFAS1，結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)能力和遷移能力均下降，提示ZFAS1 可以促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移。

圖2 敲低ZFAS1對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)及遷移的影響Fig.2 Knockdown effects of ZFAS1 on the growth and migration of colorectal cancer cells

2.4 敲低ZFAS1對(duì)ZNFX1表達(dá)的影響

由圖3 可知，ZNFX1 在結(jié)腸癌細(xì)胞系（LoVo、DLD1、HCT-116、SW480、HCT-8）中的相對(duì)表達(dá)量均低于正常結(jié)腸細(xì)胞系CCD841CoN。敲低ZFAS1 后，與ZFAS1 相比，ZNFX1 表達(dá)水平上調(diào)（P＜0.05）。結(jié)果表明，ZNFX1 在結(jié)腸癌細(xì)胞系中低表達(dá)，ZFAS1可以負(fù)調(diào)控ZNFX1的表達(dá)水平。

圖3 ZFAS1與ZNFX1表達(dá)量的相關(guān)性Fig.3 The relationship between the expression level of ZFAS1 and ZNFX1

2.5 過表達(dá)ZNFX1 對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)及遷移的影響

目前對(duì)于ZNFX1 編碼蛋白的晶體結(jié)構(gòu)尚無解析結(jié)果，本研究根據(jù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)在線軟件（http：//smart. embl-heidelberg.de/）對(duì)ZNFX1 進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)：ZNFX1 的肽鏈從N 端到C 端依次是由2 個(gè)AAA 結(jié)構(gòu)域及3 個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域組成（圖4A）。將兩種表達(dá)載體質(zhì)粒（ZNFX1-1-5757bp和ZNFX1-1-3646bp）分別轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細(xì)胞，檢測(cè)過表達(dá)效果，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染ZNFX1-1-5757bp 的結(jié)腸癌細(xì)胞中ZNFX1 的表達(dá)量高于pcDNA-NC，轉(zhuǎn)染ZNFX1-1-3646bp的結(jié)腸癌細(xì)胞在130~180 kD分子量之間出現(xiàn)一條新的條帶，即為構(gòu)建的ZNFX1-1-3646bp 克隆質(zhì)粒所表達(dá)出的蛋白（圖4B）。過表達(dá)ZNFX1-1-5757bp 及ZNFX1-1-3646bp 后，結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT-116、LoVo 及SW480 的活細(xì)胞數(shù)量顯著少于pcDNA-NC（P＜0.05，圖4C），且結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT-116、LoVo 及SW480 的克隆形成數(shù)量少于pcDNA-NC（圖4D）。同時(shí)，結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT-116、LoVo 及SW480 穿過Transwell 微孔濾膜的細(xì)胞數(shù)量少于pcDNA-NC（圖4E）。結(jié)果表明，ZNFX1可以抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)及遷移，過表達(dá)ZNFX1，結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)及遷移能力下降，并且ZNFX1的AAA結(jié)構(gòu)域區(qū)段可以獨(dú)立發(fā)揮該功能。

圖4 過表達(dá)ZNFX1對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)及遷移的影響Fig.4 Proliferation and migration of CRC cells after ZNFX1 overexpression

3 討論

研究表明ZFAS1 在不同腫瘤組織中的表達(dá)情況存在差異［8］，如Askarian-amiri 等［9］研究發(fā)現(xiàn)，ZFAS1 在正常乳腺中高表達(dá)，在乳腺侵襲性導(dǎo)管腺癌中表達(dá)下調(diào)；大量研究發(fā)現(xiàn)，ZFAS1 在胃癌［10］、腎透明細(xì)胞癌［11］、骨肉瘤［12］中均為高表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)ZFAS1 在結(jié)直腸癌組織及結(jié)腸癌細(xì)胞系中表達(dá)升高，并且可以促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)及遷移，證實(shí)ZFAS1 在結(jié)直腸癌中具有原癌基因的潛質(zhì)，這與既往ZFAS1 在結(jié)直腸癌中的相關(guān)研究結(jié)果相符［13］。

ZFAS1在結(jié)腸癌細(xì)胞中的功能機(jī)制多樣，既往研究主要從以下幾個(gè)方面進(jìn)行探索：①ZFAS1 作為內(nèi)源性競(jìng)爭(zhēng)性RNA（competing endogenous RNAs，ceRNAs）與miRNA 結(jié)合，作為“miRNA 海綿”阻斷miRNA 介導(dǎo)的抑癌功能。在宮頸癌中，ZFAS1可與miR-190a-3p結(jié)合阻斷miR-190a-3p介導(dǎo)的抑癌功能［14］。在結(jié)直腸癌中，ZFAS1作為ceRNAs 可與miR-144［15］、miR-7-5p［16］、miR-150-5p［17］、miR-484［18］等miRNA 結(jié)合，促進(jìn)結(jié)直腸癌的增殖及轉(zhuǎn)移。②ZFAS1是3個(gè)SNORDs的載體，既往研究提示，lncRNA 可以通過snoRNA 起到促進(jìn)腫瘤增殖及轉(zhuǎn)移的作用，如GAS5基因在結(jié)腸癌中的抑癌作用可能與由GAS5衍生的snoRNA相關(guān)，且研究表明在DNA損傷信號(hào)通路中，p53誘導(dǎo)GAS5snoRNA表達(dá)，從而起到促進(jìn)凋亡并減慢細(xì)胞周期的作用［19］。ZFAS1 在結(jié)直腸癌中的作用是否與SNORDs 相關(guān)尚并不清楚，有待進(jìn)一步研究。③ZFAS1是ZNFX1的反義RNA，二者“頭對(duì)頭”轉(zhuǎn)錄，ZFAS1及ZNFX1 在小鼠肺、乳腺、腎臟、腦、脾、心、肝、胚胎等組織中均有表達(dá)［8］，且在大多數(shù)組織中兩者的表達(dá)水平存在相關(guān)性。在侵襲性導(dǎo)管腺癌中ZFAS1 表達(dá)下調(diào)，而ZNFX1 表達(dá)上調(diào)［9］。在結(jié)腸癌中ZFAS1的功能是否與ZNFX1相關(guān)尚不明確。

本研究發(fā)現(xiàn)，敲低ZFAS1 后，ZNFX1 表達(dá)上調(diào)，表明ZFAS1 與ZNFX1 在結(jié)腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平具有相關(guān)性，ZFAS1 能夠潛在負(fù)調(diào)控ZNFX1 的表達(dá)。ZNFX1 在結(jié)腸癌細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)，表明ZNFX1 在結(jié)腸癌細(xì)胞及正常結(jié)腸細(xì)胞中存在差異性表達(dá)。細(xì)胞功能學(xué)試驗(yàn)證明，ZNFX1可以抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)及遷移，提示ZFAS1可能通過抑制ZNFX1 的表達(dá)從而起到促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移的作用。此外ZNFX1 的肽鏈?zhǔn)怯? 個(gè)AAA 結(jié)構(gòu)域及3 個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域組成。AAA 結(jié)構(gòu)域與一系列細(xì)胞活性相關(guān)，包括膜融合、蛋白質(zhì)水解及DNA 復(fù)制等［20-21］。鋅指結(jié)構(gòu)域?qū)儆谙鄬?duì)較小的蛋白模體，通過指樣結(jié)構(gòu)域識(shí)別DNA、RNA、蛋白質(zhì)及脂質(zhì)底物等［22］。為確定ZNFX1 哪個(gè)區(qū)段在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中起到作用，本研究采用截短法，通過轉(zhuǎn)染不同結(jié)構(gòu)域區(qū)段的質(zhì)粒進(jìn)行生物學(xué)功能試驗(yàn)，證明ZNFX1的AAA結(jié)構(gòu)域區(qū)段可以獨(dú)立發(fā)揮抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)及遷移的功能。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，ZFAS1在結(jié)直腸癌組織及結(jié)腸癌細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，可以促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)及遷移，即ZFAS1 具有原癌基因的潛質(zhì)，且ZFAS1 可能通過抑制其潛在靶基因ZNFX1 的表達(dá)從而起到促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移的作用。但本研究未發(fā)現(xiàn)ZFAS1 的高表達(dá)或低表達(dá)與結(jié)直腸癌患者的臨床病理學(xué)資料之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，考慮可能與納入的患者例數(shù)較少有關(guān)，未來需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量評(píng)估二者的相關(guān)性。另外，本研究發(fā)現(xiàn)ZFAS1 可能通過抑制ZNFX1的表達(dá)從而起到促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移的作用，但具體的分子機(jī)制尚不清楚，未來需進(jìn)一步完善分子生物學(xué)機(jī)制研究。