施氏假單胞菌A1501 鐵吸收調(diào)節(jié)蛋白Fur 的表達(dá)特性與功能鑒定

劉一超， 陸超， 戰(zhàn)崳華， 柯秀彬， 陸偉， 燕永亮

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京100081

鐵元素是幾乎所有微生物生長(zhǎng)、繁殖和代謝所必需的營(yíng)養(yǎng)元素。目前已知鐵元素的功能大都基于其作為關(guān)鍵酶輔因子展開(kāi)，例如，它可以作為輔因子參與構(gòu)成血紅素蛋白和鐵-硫蛋白的核心，或參與構(gòu)成二鐵單核酶的活性中心并穩(wěn)定其構(gòu)象，也可與鐵載體結(jié)合而發(fā)揮作用［1］。研究表明，不同物種內(nèi)鐵元素的存在和作用模式不同，對(duì)微生物來(lái)說(shuō)，并不是鐵的吸收越多越好，胞內(nèi)過(guò)高濃度的鐵會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性，破壞微生物內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定性［2］，微生物必須在鐵的攝取不足與鐵過(guò)多導(dǎo)致毒性之間保持平衡。革蘭氏陰性菌中，胞內(nèi)鐵轉(zhuǎn)運(yùn)、儲(chǔ)存和利用主要由鐵吸收調(diào)節(jié)蛋白Fur（ferric uptake regulator）調(diào)控［3］。大量研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ur 在鐵的轉(zhuǎn)運(yùn)和利用、光合作用、呼吸作用、DNA 的生物合成、微生物-宿主互作、環(huán)境競(jìng)爭(zhēng)等過(guò)程中發(fā)揮重要作用［4-6］。

Fur 蛋白在原核生物中廣泛存在，Hantke 等［7］最早在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了該蛋白，而B(niǎo)agg 等［8］進(jìn)一步通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明了該蛋白可以與亞鐵離子結(jié)合，并對(duì)鐵轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)起調(diào)控作用。Fur 通過(guò)其蛋白結(jié)構(gòu)上一個(gè)富含組氨酸區(qū)域與靶標(biāo)基因啟動(dòng)子上富含A/T 區(qū)域的Fur box 結(jié)合［3］。這種序列的特異性在不同細(xì)菌間存在較大差異［9］。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ur 蛋白對(duì)靶標(biāo)的表達(dá)存在正調(diào)控和負(fù)調(diào)控兩種模式，如Fur 作為轉(zhuǎn)錄因子的負(fù)調(diào)控機(jī)制［10］、apo-Fur 的正調(diào)控機(jī)制［11］和Fe2+-Fur 復(fù)合體的正調(diào)控機(jī)制［12-13］。此外，也有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ur蛋白可通過(guò)非編碼RNA 介導(dǎo)的RNA-RNA 互作調(diào)控模式，對(duì)鐵代謝相關(guān)的基因進(jìn)行精準(zhǔn)調(diào)控，如大腸桿菌中參與氧化脅迫調(diào)控的非編碼RNA RyhB［14-16］。

施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri）A1501是一株分離于水稻根際的聯(lián)合固氮菌［17］，也是目前聯(lián)合固氮研究的模式菌株之一，其高效固氮和根表定殖需要大量含鐵蛋白（如固氮酶）的參與，因此了解其如何適應(yīng)不同生境鐵有助于完善A1501 的生境適應(yīng)機(jī)制及固氮調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。近年來(lái)，科研人員通過(guò)對(duì)A1501在抗氧化脅迫、碳源利用、固氮調(diào)控與氮循環(huán)、生物膜形成以及根表定殖等方面的深入研究，對(duì)其基本調(diào)控模式和適應(yīng)環(huán)境的能力有了更為清晰的理解［18-24］，但是關(guān)于A1501如何響應(yīng)外界鐵信號(hào)并調(diào)控其根際適應(yīng)和高效固氮等的相關(guān)研究仍較匱乏。本研究以A1501 的Fur 蛋白為研究對(duì)象，通過(guò)比較Fur 蛋白及其編碼基因fur的表達(dá)特性，并開(kāi)展功能鑒定，初步明確A1501 中fur影響鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)和氧化脅迫適應(yīng)的作用機(jī)制，以期為進(jìn)一步解析A1501 根際環(huán)境適應(yīng)和高效固氮機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與培養(yǎng)條件 施氏假單胞菌A1501為本實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期保存菌株。Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基：10.0 g·L?1胰蛋白胨，5.0 g·L?1酵母抽提物，10.0 g·L?1氯化鈉。鐵限制培養(yǎng)基通過(guò)在LB 培養(yǎng)基中加入終濃度為200 μmol·L?1的二聯(lián)吡啶獲得。鐵過(guò)量培養(yǎng)基通過(guò)在LB 培養(yǎng)基中加入終濃度為100 μmol·L?1氯化鐵獲得。A1501 及其衍生菌株培養(yǎng)條件為L(zhǎng)B培養(yǎng)基，30 ℃，220 r·min?1。

1.1.2 試劑與耗材 細(xì)菌RNA 提取試劑盒（innu-PREP RNA mini kit）購(gòu)自Analytik Jena AG 公司；逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA 試劑盒（HiScript 1st strand cDNA synthesis kit）及染料法熒光定量預(yù)混液（2×SYBR Mix TaqII）購(gòu)自諾維贊公司；Fur 單抗由北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司制備；羊抗鼠二抗購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；二聯(lián)吡啶購(gòu)自Sigma公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 主要儀器 渦旋振蕩儀（型號(hào)Vortex Genie2）購(gòu)自美國(guó)Scientific Industries 公司；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（型號(hào)U3010 Hitachi）購(gòu)自日立高新技術(shù)公司；微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（型號(hào)Nano Drop 2000）購(gòu)自Thermo Fisher 公司；恒溫培養(yǎng)箱（型號(hào)DH4000AB）購(gòu)自HEB 西安禾普生物公司；臺(tái)式冷凍離心機(jī)（型號(hào)3K-15）購(gòu)自Sigma-aldrich公司；PCR儀（型號(hào)9700）購(gòu)自Bio-Rad 公司；小型離心機(jī)（型號(hào)5424）購(gòu)自Eppendorf 公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（型號(hào)7500）購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 突變株構(gòu)建 通過(guò)同源雙交換的方法構(gòu)建fur缺失突變株，采用pLFRA3 載體構(gòu)建功能回補(bǔ)株，具體方法參照Z(yǔ)han 等［24］的方法。突變株及回補(bǔ)株構(gòu)建涉及的引物見(jiàn)表1。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR（qRT-PCR）引物鐵轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)及氧化脅迫調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)差異涉及的qRT-PCR引物見(jiàn)表1。

1.2.3 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 從固體平板上挑取A1501及其衍生菌單菌落接種至20 mL的LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃、220 r·min?1過(guò)夜培養(yǎng)；次日，將菌液于4 ℃、6 000g離心8 min 收集菌體，棄上清后用20 mL 0.85%的氯化鈉溶液在相同離心條件下清洗菌體2次；初始濃度OD600=0.1轉(zhuǎn)接菌液，每組設(shè)置3 個(gè)平行，于30 ℃、220 r·min?1條件下震蕩培養(yǎng)，每隔1 h 取樣，測(cè)定菌液在600 nm 下的吸光值。根據(jù)所測(cè)得的數(shù)據(jù)，以時(shí)間（h）為橫坐標(biāo)，吸光值（OD600）為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.4Biolog碳源代謝差異分析 野生型A1501與fur突變株于LB 液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)中期，用接種環(huán)蘸取菌液并轉(zhuǎn)接至LB 固體平板，30 ℃過(guò)夜靜止培養(yǎng)；次日，將平板上的新鮮菌體重懸于LB 液體培養(yǎng)基中并調(diào)節(jié)OD600至0.1；將菌懸液接種至預(yù)裝95 種已知碳源的GN2 Biolog 碳源鑒定板中；在30 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)至4 h 和24 h時(shí)用Biolog酶標(biāo)儀讀取吸光值。

1.2.5 胞內(nèi)鐵含量測(cè)定 將調(diào)至OD600=1的A1501與fur突變株接種到500 mL LB 培養(yǎng)基中，調(diào)整終濃度為OD600=0.1，30 ℃、220 r·min?1培養(yǎng)6 h 后收集菌體。菌體用含有5 mmol·L?1乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）的磷酸緩沖液清洗2遍，再用不含EDTA 的PBS緩沖液清洗兩遍，于50 mL 離心管中50 ℃過(guò)夜烘干。稱取干重后用濃硝酸和雙氧水將菌體溶解，經(jīng)蒸發(fā)和定容后用電感耦合等離子體質(zhì)譜測(cè)定鐵元素含量。

1.2.6 Western blotting 將過(guò)夜富集培養(yǎng)的野生型A1501液轉(zhuǎn)接（1%）至LB液體培養(yǎng)基中，并于菌體的指數(shù)生長(zhǎng)期（約6 h）收集細(xì)胞沉淀并制備全細(xì)胞提取液。鐵過(guò)量和鐵限制條件下分別通過(guò)額外添加終濃度為100 μmol·L?1的FeCl3和200 μmol·L?1的二聯(lián)吡啶實(shí)現(xiàn)。利用12%（質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)）的SDS 聚丙烯酰胺凝膠（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels，SDS-PAGE）對(duì)等量的不同蛋白樣品（以定量分析目標(biāo)蛋白的表達(dá)量變化）進(jìn)行分離，然后通過(guò)半干電轉(zhuǎn)印的方法，將蛋白樣品從SDS-PAGE 轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上。帶有蛋白樣品的PVDF 膜分別依次與阻斷緩沖液室溫孵育2 h、抗P. sttzeriA1501 Fur 蛋白的血清（anti-Fur antisera）在4 ℃孵育過(guò)夜后，再與抗鼠二抗室溫孵育2 h，最后采用HRP-DAB 化學(xué)顯色試劑盒對(duì)膜上可能存在的蛋白樣品進(jìn)行化學(xué)顯色。PVDF 膜在不同抗體或顯色緩沖液中切換時(shí)使用含0.1% Tween-20的Tris緩沖液洗滌膜3次，每次10 min。

1.2.7 過(guò)氧化氫沖擊 將A1501野生型、fur突變株以及回補(bǔ)株接入LB液體培養(yǎng)基，30 ℃、220 r·min?1搖床培養(yǎng)，過(guò)夜；按1%接菌量，轉(zhuǎn)接到LB 液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)至OD600=0.5左右；分別取1 mL菌體，用0.85%的氯化鈉溶液分別稀釋到10?1、10?2、10?3、10?4、10?5作為對(duì)照組，然后再取1 mL 菌體加入終濃度為20 mmol·L?1的H2O2沖擊10 min并且依次稀釋至10?5，用移液器分別取出8 μL點(diǎn)在LB平板上，30 ℃過(guò)夜培養(yǎng)；培養(yǎng)16~20 h，用菌落計(jì)數(shù)儀拍照。1.2.8 qRT-PCR 反應(yīng) 根據(jù)細(xì)菌RNA 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)目的菌株提取總RNA。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA 試劑盒說(shuō)明書(shū)去除樣品中的基因組DNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以16S為內(nèi)參基因，測(cè)定菌株中目的基因的表達(dá)情況。每個(gè)反應(yīng)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 A1501 中Fur 及其編碼基因的生物信息學(xué)分析

施氏假單胞菌A1501 基因組中存在一個(gè)Fur編碼基因fur，由PST3330 編碼，該基因在假單胞菌屬中的基因位置非常保守，均位于DNA 修復(fù)蛋白基因recN和外膜蛋白基因omlA之間，而大腸桿菌中fur的側(cè)翼基因與假單胞屬中fur側(cè)翼基因沒(méi)有同緣關(guān)系（圖1A）。A1501 中Fur 蛋白由134 個(gè)氨基酸殘基組成。分別選取了同屬的施氏假單胞菌ATCC 17588、銅綠假單胞菌PAO1、模式菌株大腸桿菌K12、棕色固氮菌CA6的Fur蛋白進(jìn)行了同源性比對(duì)，結(jié)果表明，A1501 與ATCC17588 的Fur蛋白一致性為100%，與銅綠假單胞菌、棕色固氮菌、大腸桿菌的Fur 蛋白一致性分別為90%、89%和60%，表明該蛋白在進(jìn)化上相對(duì)保守。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明，以上菌株中Fur 蛋白均含有5個(gè)α螺旋和5個(gè)β折疊結(jié)構(gòu)域（圖1B），其中β3折疊前具有典型的HHDH 離子結(jié)合區(qū)域，該區(qū)域的功能可能與Fur蛋白形成二聚體結(jié)構(gòu)有關(guān)。

圖1 不同細(xì)菌中fur基因的染色體位置以及Fur蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)比較Fig.1 Comparative analysis of the chromosomal location offurgene and primary structure of Fur protein in different bacteria

2.2 A1501中fur基因的表達(dá)特性分析

為了探究A1501 中fur基因的表達(dá)對(duì)環(huán)境中鐵濃度的響應(yīng)，分別通過(guò)在LB 培養(yǎng)基中添加100 μmol·L?1的FeCl3以及200 μmol·L?1鐵離子螯合劑——二聯(lián)吡啶來(lái)創(chuàng)造鐵過(guò)量和鐵限制條件，通過(guò)qRT-PCR 方法測(cè)定fur基因在不同條件下的表達(dá)水平。結(jié)果表明，相比正常的培養(yǎng)條件，在鐵限制條件下，fur基因的表達(dá)量提高了2.5 倍以上；而在鐵過(guò)量條件下，fur的表達(dá)量均下降了50%左右（圖2A）。此外，本研究制備了Fur 蛋白的單克隆抗體，通過(guò)Western blotting 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了A1501在含有不同鐵離子濃度的LB 培養(yǎng)條件下Fur 蛋白的表達(dá)差異，結(jié)果表明，在鐵限制條件下Fur 蛋白的表達(dá)量明顯高于正常培養(yǎng)條件和鐵過(guò)量條件（圖2B）。以上結(jié)果表明，在施氏假單胞菌中，fur的表達(dá)受到環(huán)境中鐵含量的影響，在環(huán)境中鐵缺乏時(shí)，F(xiàn)ur 蛋白的表達(dá)量會(huì)升高；在環(huán)境中鐵過(guò)量時(shí)，F(xiàn)ur蛋白的表達(dá)量會(huì)降低。

圖2 A1501fur基因及Fur蛋白在不同鐵離子濃度培養(yǎng)條件下的表達(dá)水平Fig.2 Expression offurgene and Fur protein in wild type A1501 under different iron conditions

2.3fur基因突變對(duì)菌株的碳代謝及鐵元素跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的影響

通過(guò)同源雙交換的方法構(gòu)建了fur基因的缺失突變株和功能回補(bǔ)菌株。采用GN2 Biolog 碳源鑒定板測(cè)定了fur基因突變對(duì)碳源代謝利用的影響，結(jié)果表明，在測(cè)定的95種碳源中，fur基因的突變改變了A1501 種類的碳源利用種類：與野生型A1501 相比，fur突變使菌株幾乎完全喪失了對(duì)碳源L-天冬氨酸的利用能力，但是對(duì)α-丁酮酸的利用能力增強(qiáng)。除此之外，fur的突變降低了糊精、α-D葡萄糖、丙酮酸甲酯、D，L-乳酸、D-丙氨酸、L-焦谷氨酸的利用能力（圖3）。這說(shuō)明Fur 可能通過(guò)參與某些關(guān)鍵的細(xì)胞代謝過(guò)程影響了A1501 的碳代謝。

圖3 野生型A1501和fur突變株的碳源代謝譜比較Fig.3 Changes in the carbon metabolite profiling between wild type A1501 andfurmutant

本研究進(jìn)一步測(cè)定了野生型、突變株和回補(bǔ)株在鐵豐富培養(yǎng)基LB中的生長(zhǎng)曲線。結(jié)果表明，在正常鐵濃度條件下，與野生型相比，fur突變株的生長(zhǎng)情況沒(méi)有受到明顯的影響（圖4A），而在鐵限制條件下，fur突變株的生長(zhǎng)受到影響（圖4B）。推測(cè)其可能的原因在于，F(xiàn)ur 在鐵限制條件下高表達(dá)以適應(yīng)鐵限制環(huán)境，而fur的基因缺失突變導(dǎo)致菌體無(wú)法合成足夠的Fur 蛋白，胞內(nèi)的鐵代謝紊亂從而影響菌株生長(zhǎng)，具體機(jī)制值得進(jìn)一步研究。

圖4 野生型A1501、fur突變株和回補(bǔ)株在鐵過(guò)量和鐵限制條件下的生長(zhǎng)情況Fig.4 Growth curves of wild type A1501,furmutant and C-furunder iron-excessive and iron-limited conditions

大量研究表明，F(xiàn)ur 對(duì)鐵元素的吸收發(fā)揮調(diào)控作用，以適應(yīng)鐵缺乏的環(huán)境。為了驗(yàn)證fur突變是否對(duì)A1501 的鐵離子運(yùn)輸產(chǎn)生影響，本研究采用電感耦合等離子體質(zhì)譜技術(shù)測(cè)定了A1501 和fur突變株胞內(nèi)的鐵離子濃度。結(jié)果如圖5 所示，在LB 條件下，與野生型相比，fur突變株的胞內(nèi)鐵含量上升了30%左右（圖5A），推測(cè)可能的原因是fur突變導(dǎo)致鐵離子的胞內(nèi)主動(dòng)運(yùn)輸能力增強(qiáng)，并且Fur 對(duì)鐵離子的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)存在負(fù)調(diào)控作用。為了驗(yàn)證上述推測(cè)，進(jìn)一步挑選了與鐵轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因進(jìn)行了qRT-PCR 分析，其中PST_0819、PST_0820、PST_0821 和PST_0822 分別與編碼鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的TonB 系統(tǒng)關(guān)鍵組分高度同源，PST_4066是ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，PST_2271是一個(gè)細(xì)胞外膜特異性受體。qRT-PCR 發(fā)現(xiàn)其TonB 系統(tǒng)相關(guān)基因、ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和TonB 依賴的受體表達(dá)量都顯著上升至少8倍以上（圖5B）。該結(jié)果表明，A1501中fur突變導(dǎo)致了鐵轉(zhuǎn)運(yùn)的表達(dá)量上升從而導(dǎo)致了細(xì)胞內(nèi)鐵含量升高。

圖5 野生型A1501和fur突變株胞內(nèi)鐵元素水平Fig.5 Intracellular iron level between wild type A1501 andfurmutant

2.4fur基因突變對(duì)菌體過(guò)氧化氫沖擊的影響

細(xì)胞內(nèi)過(guò)量的鐵會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性：胞內(nèi)鐵離子含量的增加會(huì)引發(fā)芬頓反應(yīng)，產(chǎn)生大量的自由基對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生氧化損傷［25］。過(guò)氧化氫是可以引起細(xì)胞氧化損傷的成分，本研究檢測(cè)了野生型A1501、fur突變株及回補(bǔ)株在過(guò)氧化氫沖擊下的存活率并對(duì)fur基因突變前后菌株的氧化應(yīng)激耐受能力進(jìn)行了比較。結(jié)果如圖6 所示，fur基因突變后，菌株的抗氧化脅迫能力明顯減弱，經(jīng)H2O2沖擊后的fur突變株存活率較野生型明顯降低約3 個(gè)數(shù)量級(jí)，而回補(bǔ)株C-fur與野生型A1501 差異不顯著。

圖6 H2O2沖擊條件后野生型A1501、fur突變株及回補(bǔ)株存活率的比較Fig.6 Comparision of survival rates among wild type A1501,furmutant and complementary strain after treatment with H2O2

通過(guò)分析H2O2沖擊前后fur突變株的存活情況，我們推測(cè)fur可能參與了A1501 的抗氧化脅迫調(diào)控。本研究進(jìn)一步選取了A1501中可能與氧化脅迫相關(guān)的5 個(gè)基因——超氧化物歧化酶sodB（鐵超氧化物歧化酶）、sodC（銅超氧化物歧化酶）、katE（過(guò)氧化氫酶）基因和2 個(gè)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶編碼基因（分別由PST_1360 和PST_2535編碼）進(jìn)行了qRT-PCR 分析。結(jié)果表明，在過(guò)氧化氫沖擊條件下，fur突變株中sodB基因表達(dá)顯著下調(diào)（圖7），其他基因的變化并不顯著。SodB 蛋白是以鐵離子為核心的超氧化物歧化酶，由此推測(cè)，fur可能通過(guò)某種機(jī)制調(diào)控sodB基因的表達(dá)，并進(jìn)而影響了菌體的抗氧化脅迫能力。

圖7 qRT-PCR檢測(cè)H2O2沖擊條件下野生型A1501、fur突變株氧化脅迫相關(guān)基因表達(dá)Fig.7 Expression of oxidative-response genes in wild type A1501,furmutant after treated with H2O2by qRT-PCR

3 討論

自然環(huán)境中，大多數(shù)微生物并不能完全“積極”地生長(zhǎng)。正如對(duì)植物抗性研究一樣，關(guān)于微生物的研究也越來(lái)越多地考慮到脅迫耐受以及競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系和生理或生物干擾等諸多因素［26］。微量元素是所有植物生長(zhǎng)的必需營(yíng)養(yǎng)素，但與C、H、O 等大量元素不同，植物對(duì)微量元素的需求量少，即營(yíng)養(yǎng)缺乏與過(guò)量毒害之間的含量范圍很小［27］。對(duì)于植物根際微生物來(lái)說(shuō)，如何高效適應(yīng)根際環(huán)境中不斷變化的微量元素顯得尤為重要。目前微生物學(xué)領(lǐng)域?qū)τ贔e 和Mg 等關(guān)鍵酶輔因子吸收、利用及相關(guān)穩(wěn)態(tài)的相關(guān)研究大多集中在致病細(xì)菌，如銅綠假單胞菌等［28］以及根瘤菌等物種［4］。

施氏假單胞菌A1501生物固氮的核心組分是固氮酶，其一般由鐵蛋白和鉬鐵蛋白兩個(gè)組分組成，其結(jié)構(gòu)中共需34 個(gè)鐵原子［29］。因此，A1501的高效固氮和根際定殖同樣需要很多含鐵蛋白的參與。在關(guān)于A1501 的早期研究中，Yan 等［18］發(fā)現(xiàn)該菌基因組上存在1個(gè)由11個(gè)轉(zhuǎn)錄單元構(gòu)成的49 kb的固氮島，該固氮島內(nèi)許多基因直接編碼了含鐵酶或鐵硫簇。關(guān)于這些蛋白表達(dá)模式的相關(guān)研究中，除了已知受到NifA-RpoN 的調(diào)控外［20，30］，其他轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子是否對(duì)這些固氮相關(guān)基因表達(dá)存在直接或間接的調(diào)控作用等相關(guān)研究尚未開(kāi)展。由于這些固氮相關(guān)基因（如nifHDK、nifU和hesB等）所編碼的產(chǎn)物蛋白的生物學(xué)活性的形成及生物學(xué)功能的發(fā)揮均需要大量的鐵作為輔基，因此我們推測(cè)這些基因的表達(dá)可能受到Fur 蛋白的影響。

Fur 蛋白經(jīng)證實(shí)是一個(gè)重要的全局調(diào)控因子。在不同的細(xì)菌中，其調(diào)控的靶標(biāo)存在差異。在革蘭氏陰性菌中，F(xiàn)ur 的一個(gè)基本功能是調(diào)控鐵吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)體系。通過(guò)控制鐵轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的表達(dá)來(lái)維持菌體內(nèi)的鐵穩(wěn)態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)，A1501中，fur的突變導(dǎo)致了細(xì)菌鐵吸收系統(tǒng)解除抑制，進(jìn)而導(dǎo)致了胞內(nèi)鐵含量的升高，說(shuō)明在A1501 中fur的基本功能也與其他假單胞菌屬中Fur 蛋白功能相似，是鐵吸收的一個(gè)調(diào)控基因［31］。該基因可以抑制A1501中參與鐵吸收與運(yùn)輸?shù)囊蕾囉谑辱F素的鐵吸收系統(tǒng)，該系統(tǒng)一般由嗜鐵素、特異性的受體、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)和TonB 系統(tǒng)組成［32］。通過(guò)熒光定量數(shù)據(jù)分析，本研究發(fā)現(xiàn)A1501 中該系統(tǒng)與其他細(xì)菌中一樣，也受到了Fur 的負(fù)調(diào)控。由于細(xì)胞內(nèi)鐵含量的升高，可能導(dǎo)致了芬頓反應(yīng)產(chǎn)生過(guò)多的自由基對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生了損害，降低了對(duì)氧化脅迫的抗性［33］。在幽門(mén)螺旋桿菌中，apo-Fur 可以激活sodB基因的表達(dá)［11］，從而調(diào)控細(xì)胞對(duì)氧化脅迫的抗性，而A1501 中是否存在這一直接調(diào)控途徑還有待進(jìn)一步研究。

通過(guò)正常條件下和鐵缺乏條件下生長(zhǎng)曲線的測(cè)定，本研究發(fā)現(xiàn)，突變株對(duì)鐵缺乏的脅迫更敏感，這與前面的fur突變導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鐵含量升高的結(jié)果并不矛盾，分析原因?yàn)镕ur 的缺失引起了包括鐵吸收和利用在內(nèi)的鐵穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)的紊亂，由于鐵吸收是受到Fur 負(fù)調(diào)控的，所以導(dǎo)致了細(xì)胞內(nèi)鐵含量的升高；而其他Fur 調(diào)控涉及TCA 循環(huán)、呼吸作用等的基因有一大部分是受到了Fur 的正調(diào)控。由于fur的缺失，A1501 的維持鐵吸收和鐵代謝的穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)已經(jīng)被破壞，一方面導(dǎo)致了突變株細(xì)胞內(nèi)鐵含量的升高，另一方面導(dǎo)致了細(xì)胞對(duì)缺鐵環(huán)境的抗性降低。

綜上所述，本研究初步解析了A1501 中Fur蛋白在鐵離子運(yùn)輸和氧化脅迫適應(yīng)中的功能，即Fur 蛋白在高濃度鐵環(huán)境下表達(dá)下調(diào)，對(duì)鐵轉(zhuǎn)運(yùn)基因表達(dá)存在負(fù)調(diào)控作用，維持了菌株鐵穩(wěn)態(tài)平衡，此外Fur 通過(guò)正調(diào)節(jié)sodB基因表達(dá)參與菌株的氧化脅迫適應(yīng)，從而降低鐵過(guò)量導(dǎo)致的芬頓反應(yīng)對(duì)細(xì)胞的損害。未來(lái)的研究將在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步聚焦Fur 蛋白調(diào)控相關(guān)基因的分子機(jī)制，同時(shí)探索Fur 蛋白對(duì)固氮酶表達(dá)的影響，為進(jìn)一步探究A1501適應(yīng)生境鐵并調(diào)節(jié)固氮過(guò)程的分子機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。