PRNs基因家族研究進(jìn)展

樊錦瑞， 王磊， 鄒俊杰

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京100081

Pirin（PRN、PIR）蛋白在人類中最初是通過酵母雙雜交篩選發(fā)現(xiàn)的，其與轉(zhuǎn)錄因子NFI/CTF1（nuclear factor I/CCAAT box transcription factor）相互作用，發(fā)揮相關(guān)功能［1］。已有報道表明，人hPRN 可作為轉(zhuǎn)錄因子輔因子和氧化還原感受器，參與多個生物學(xué)過程，與癌癥的發(fā)生密切相關(guān)［2］。除了人類，在其他哺乳動物、植物、真菌甚至原核生物中也都存在PRN 同源蛋白，PRN 蛋白的N 端蛋白結(jié)構(gòu)高度保守［1，3-5］。本文總結(jié)了PRN蛋白的基本結(jié)構(gòu)和生化特征，重點(diǎn)綜述了不同物種的PRN 蛋白生物學(xué)功能研究進(jìn)展，并對植物PRN 蛋白今后的研究進(jìn)行了展望，以期為癌癥治療和作物改良提供新的靶點(diǎn)。

1 PRNs的結(jié)構(gòu)

PRNs 在哺乳動物、植物、真菌和原核生物中高度保守，根據(jù)序列和結(jié)構(gòu)相似性被歸類為Cupin 超家族的一個亞家族。Cupin 來源于拉丁文“cupa”，在拉丁語中是指木桶或小桶的意思，因此，將具有β 折疊片圍成的桶狀結(jié)構(gòu)的蛋白命名為Cupin［6］。Cupin 家族蛋白除具有保守的β-barrel 結(jié)構(gòu)外，還有兩個保守的基序（motif），即［G（X）5HXH（X）3，4E（X）6G］和［G（X）5PXG（X）2H（X）3N］，兩個基序由15~50 個氨基酸隔開，形成了與金屬離子結(jié)合的區(qū)域，被保護(hù)在β 桶狀結(jié)構(gòu)中［7-9］。

Winaker 等［1］首次克隆了人類hPRN基因，對hPRN基因的表達(dá)、蛋白結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞定位進(jìn)行了分析。如圖1所示，hPRN 蛋白的晶體結(jié)構(gòu)含有兩個不同的Cupin 家族基序：一個是β-桶狀折疊區(qū)域，在其N 端區(qū)域，含有金屬離子結(jié)合位點(diǎn)，由3個組氨酸和1個谷氨酸組成；另一個是含α-螺旋的C-末端結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域不含金屬結(jié)合位點(diǎn)，也不含保守的金屬配位殘基。C-末端的α-螺旋結(jié)構(gòu)并不是在所有物種中都保守，如大腸桿菌中就缺失了這段保守序列［4，10］。

PRN蛋白的晶體結(jié)構(gòu)與槲皮素2，3-雙加氧酶結(jié)構(gòu)相似，具有類似槲皮素酶的功能，能夠降解槲皮素。槲皮素是一種類黃酮物質(zhì)，具有抗氧化、預(yù)防癌癥、DNA 防護(hù)、抗炎反應(yīng)和保護(hù)心臟等作用［11］。PRN與槲皮素2，3-雙加氧酶均是利用槲皮素作為底物，酶促反應(yīng)過程中均釋放一氧化碳，且槲皮素2，3-雙加氧酶抑制劑還能抑制PRN 活性，表明PRN蛋白具有類似槲皮素酶的活性［4］。

不同物種PRNs 結(jié)合不同金屬離子的能力存在差異，與其功能密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，PRN 可以結(jié)合Fe2+、Fe3+、Cu2+、Ni2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+等不同金屬離子［9，12］。hPRN結(jié)合的最適金屬離子是Fe2+/Fe3+，大腸桿菌YhhW 為Ni2+，假單胞菌pirin-like為Cu2+［9，12］。這些物種中，PRN 與最適金屬離子結(jié)合后，可以增強(qiáng)其槲皮素酶的活力。保守的金屬離子結(jié)合域表明，PRN 可能通過結(jié)合不同金屬離子來改變蛋白酶活性，也可通過結(jié)合不同價態(tài)的離子來參與基因表達(dá)調(diào)控。

2 不同物種PRNs進(jìn)化關(guān)系

與哺乳動物、微生物僅有1個PRN 成員不同，不同植物的PRNs 均包含1 個小基因家族（圖2），其中擬南芥中有4 個成員，水稻有3 個成員，玉米有4個成員，推測植物的PRNs可能具有更豐富的功能。同時，同一家族中的成員并未形成一個基因簇，而是分散在同一染色體的不同部位，或位于不同染色體上，暗示同一物種PRNs 可能具有不同的表達(dá)調(diào)控模式；一些同種家族成員也并未分布在同一進(jìn)化分支中，進(jìn)化距離較遠(yuǎn)，可能發(fā)揮不同的生物學(xué)功能。水稻的3 個成員在進(jìn)化關(guān)系上分布于3 個不同的分支。擬南芥4 個成員中，AtPRN1、AtPRN2 和AtPRN3 進(jìn) 化 關(guān) 系 更 近，而AtPRN4 被聚集到另一組（圖1）。大量研究報道AtPRN1 和AtPRN2 具有不同的生物學(xué)功能［3，13-18］，不同植物PRNs生物學(xué)功能仍有待進(jìn)一步研究。

圖1 部分植物PRN蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹[13]Fig.1 Phylogenetic tree of parts of plant PRN proteins[13]

3 PRN蛋白的生物學(xué)功能

自1997年P(guān)RN蛋白首次被發(fā)現(xiàn)以來，PRN的相關(guān)研究持續(xù)開展，PRNs在人、微生物、植物等不同物種中的生物學(xué)功能見表1。

表1 PRN蛋白在不同物種中的生物學(xué)功能Table 1 Biological functions of PRN proteins in different species

3.1 PRN在人體中的生物學(xué)功能

hPRN 是一個32 kD 的蛋白質(zhì)，由290 個氨基酸組成，定位于細(xì)胞核并呈點(diǎn)狀分布［1］。hPRN 蛋白在人體中的研究較為廣泛，在人體正常組織中表達(dá)水平相對較低，癌癥發(fā)生過程中其表達(dá)量或定位發(fā)生變化。在急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）中hPRN的 表 達(dá) 下 調(diào)，hPRN是終末期髓細(xì)胞成熟必須的，其下調(diào)可能與AML 相關(guān)的分化受阻有關(guān)［26］。hPRN在大部分癌癥中受到誘導(dǎo)會上調(diào)表達(dá)，與癌癥發(fā)生密切相關(guān)。香煙刺激氣道上皮細(xì)胞hPRN表達(dá)增加，轉(zhuǎn)錄因子Nrf2 能夠結(jié)合hPRN的啟動子區(qū)域的AREs 元件，調(diào)控hPRN的表達(dá)，參與上皮細(xì)胞凋亡和口腔癌的過程［19-20］。HPV16 E7 癌蛋白可以促進(jìn)hPRN上調(diào)，導(dǎo)致上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymal transition，EMT）和細(xì)胞遷移增加，從而引起口腔腫瘤細(xì)胞中hPRN/NF-κB 的活化［35］。在黑色素瘤細(xì)胞中，hPRN高表達(dá)，可抑制細(xì)胞衰老。黑色素瘤細(xì)胞中hPRN 亞細(xì)胞定位發(fā)生由細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移，細(xì)胞質(zhì)hPRN 的水平與黑色素瘤的進(jìn)展密切相關(guān)［26，36］。

hPRN 蛋白具有槲皮素酶的功能，同樣參與了疾病的進(jìn)展過程。在人體中高表達(dá)hPRN降低了體內(nèi)槲皮素的含量，進(jìn)而降低了槲皮素對脊髓灰質(zhì)炎病毒的抑制作用，而siRNA 誘導(dǎo)hPRN水平的下降，使該病毒復(fù)制時對黃酮類化合物更加敏感［37］。

hPRN 可作為轉(zhuǎn)錄因子輔因子發(fā)揮功能，參與調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄。hPRN 能夠與誘導(dǎo)凋亡的轉(zhuǎn)錄因子NF-κB（p50）相互作用，與原癌蛋白Bcl3形成復(fù)合物，抑制hPRN 與Bcl3 的結(jié)合，降低轉(zhuǎn)錄因子SNAI2表達(dá)和黑色素瘤細(xì)胞移動［22］。NF-κB 是一種普遍存在的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，被認(rèn)為在免疫反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、炎癥和氧化應(yīng)激中起重要作用［38-39］。在氧化條件下，hPRN 的結(jié)構(gòu)從Fe2+（非活性形式）轉(zhuǎn)變?yōu)镕e3+（活性形式），可改變蛋白R-shape 構(gòu)象，氧化態(tài)的hPRN-Fe3+可促進(jìn)p65 與DNA 分子的結(jié)合［2，29-30］，說明hPRN 可作為氧化還原感受器（redox sensor），感受體內(nèi)氧化還原變化，參與基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控。另外，hPRN 也能通過直接結(jié)合細(xì)胞周期激活因子E2F1啟動子區(qū)域，激活E2F1的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)一步調(diào)控E2F1 的靶基因cdk4、cdk6、cycD、cycE和DDR1的表達(dá)，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞G1期到S期的轉(zhuǎn)變［25］。

hPRN 主要通過以下兩個方面發(fā)揮其生物學(xué)功能：一是具有槲皮素酶的功能，參與調(diào)節(jié)體內(nèi)槲皮素水平；二是可以作為轉(zhuǎn)錄因子輔因子，通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子的活性，參與基因表達(dá)調(diào)控，以及癌癥的發(fā)生和增殖過程。研究表明，降低hPRN的表達(dá)水平，有助于治療癌癥，如宮頸癌發(fā)生過程中hPRN 通過降低上皮細(xì)胞鈣粘附蛋白（E-cadherin）的表達(dá)而誘導(dǎo)EMT；敲除hPRN基因可提高E-cadherin 水平，降低宮頸癌細(xì)胞中粘附素、鋅指蛋白ZeB和鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snail的轉(zhuǎn)錄水平［40］。而在黑色素瘤細(xì)胞中，利用小分子抑制劑TphA可以阻斷hPRN 和BCL-3之間的相互作用，最終抑制黑色素瘤細(xì)胞的遷移［22］。此外，降低hPRN的水平后發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細(xì)胞的形態(tài)和大小均發(fā)生了改變，呈現(xiàn)出衰老的表型［23］。乳腺癌中，hPRN的敲除顯著降低了乳腺癌細(xì)胞的增殖率，并降低了小鼠異種移植瘤的生長［25］。以上研究表明，hPRN可能成為一個重要的潛在生物標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)。

3.2 PRN在微生物中的生物學(xué)功能

細(xì)菌PRNs 同樣具有槲皮素酶活性，并且可以與不同金屬離子結(jié)合改變其活性。斯氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri）的pirin-like通過大腸桿菌中異源表達(dá)，在二價金屬離子的作用下表現(xiàn)出槲皮素酶活性，并且在Cu2+的情況下表現(xiàn)出最高的活性［12］。而大腸桿菌中的PRN 同源蛋白YhhW也具有降解槲皮素的酶活性，其被鑒定為一個新的含鎳雙加氧酶成員。此外，在催化腔附近有一個靈活的“Ω 環(huán)”，這可能有助于通過鎳-黃酮醇絡(luò)合物穩(wěn)定反應(yīng)中間產(chǎn)物［9］。

另外，原核生物PRNs 也參與逆境和氧化脅迫等過程。在原核生物中，藍(lán)藻prnA的表達(dá)受到高鹽、山梨醇、乙醇和甲基紫精處理誘導(dǎo)增加，而不受高低溫和強(qiáng)光誘導(dǎo)［33］。沙雷氏菌（Serratia marcescens）pirinSm與丙酮酸脫氫酶E1亞基相互作用，通過調(diào)節(jié)丙酮酸脫氫酶活性來調(diào)節(jié)丙酮酸分解代謝，參與丙酮酸代謝向三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid cycle，TCA 循環(huán)）或發(fā)酵途徑的過程［31］。鏈霉菌（Streptomyces ambofaciens）中PirA 對中樞碳代謝和能量代謝基因的表達(dá)有顯著影響，pirA突變體表現(xiàn)為對氧化損傷和聚酮化合物抗生素產(chǎn)生的抑制高度敏感，其突變體負(fù)調(diào)控長鏈乙酰輔酶，可催化β-氧化途徑的第一步［32］。

3.3 PRN在植物中的生物學(xué)功能

擬南芥的PRNs 影響種子萌發(fā)、木質(zhì)素積累和器官發(fā)育等過程。擬南芥AtPRN1定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，其表達(dá)受脫落酸（abscisic acid，ABA）和紅光誘導(dǎo)增加，能夠與G 蛋白的α 亞基GPA1 互作，位于GPA1 的下游。AtPRN1突變體發(fā)芽率降低，脫落酸處理下發(fā)芽和早期幼苗發(fā)育延遲，參與了種子萌發(fā)和早期的幼苗生長［3］。研究表明AtPRN1 是一種穿梭蛋白，在感受信號后進(jìn)入細(xì)胞核與轉(zhuǎn)錄因子NF-Y 結(jié)合，G 蛋白偶聯(lián)受體GCR1、GPA1、AtPRN1和NF-Y 形成信號通路介導(dǎo)藍(lán)光和ABA 響應(yīng)，影響種子萌發(fā)［14］。AtPRN2定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，主要在維管束附近的細(xì)胞中表達(dá)。通過調(diào)節(jié)木質(zhì)素生物合成基因的表達(dá)抑制了木質(zhì)部導(dǎo)管附近S 型木質(zhì)素的積累［13］。另外，寄生植物利用寄主根提供的特定分子來啟動吸器的發(fā)育，吸器是植物寄生的關(guān)鍵入侵結(jié)構(gòu)。TvPRN在寄生植物雜色三葉草（Triphysaria versicolor）的根中受到吸器誘導(dǎo)分子2，6-二甲氧基苯醌（2，6-dimethoxybenzoquinone，DMBQ）的誘導(dǎo)后表達(dá)上調(diào)，說明TvPRN與吸器發(fā)育相關(guān)，可能在寄生植物的寄主因子識別中發(fā)揮作用［41］。

AtPRNs家族成員具有槲皮素酶的功能，其中AtPRN1能夠分解槲皮素，且其槲皮素酶活性受到其互作蛋白GPA1 影響，AtPRN1的突變體prn1中槲皮素含量增加。AtPRN1啟動子區(qū)域存在可能與ABA 和激素信號有關(guān)的順式作用元件，影響光或激素導(dǎo)向的早期發(fā)育［16］。說明AtPRN1 的槲皮素酶活性和轉(zhuǎn)錄輔因子活性相關(guān)，并共同參與擬南芥多個生物學(xué)過程。同時，AtPRNs還參與植物防御過程。AtPRN1影響真菌條件下種子的萌發(fā)過程，突變體對不同真菌敏感性存在差異［15］。擬南芥AtPRN2參與抗病反應(yīng)，其突變體降低了侵染的發(fā)展和細(xì)菌的生長，表現(xiàn)出對維管束植物病原菌青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）的抗病反應(yīng)。細(xì)胞質(zhì)中AtPRN2 通過穩(wěn)定半胱氨酸蛋白酶XCP2，抑制XCP2 自噬，增加對青枯雷爾氏菌的敏感性［18］。番茄Le-PRN的表達(dá)與細(xì)胞死亡密切相關(guān)，表達(dá)量隨著細(xì)胞衰老和死亡顯著升高，這為研究PNN 在植物防御機(jī)制中的作用提供了新的線索［34］。

4 展望

最初鑒定的hPRN被認(rèn)為定位于細(xì)胞核，后來研究證明hPRN也可定位于細(xì)胞質(zhì)中，且其發(fā)揮作用的潛在分子機(jī)制通常被認(rèn)為是與核蛋白的相互作用［1，23］。擬南芥中PRNs 也存在穿梭入核的現(xiàn)象［14］，因此植物的PRNs 蛋白可能與hPRN 蛋白類似，在細(xì)胞核中也起到轉(zhuǎn)錄協(xié)同調(diào)節(jié)的作用。另外，根據(jù)亞細(xì)胞定位預(yù)測，玉米和水稻PRNs 部分成員具有線粒體和葉綠體定位肽（http：//cello.life.nctu.edu.tw/），這些細(xì)胞器是活性氧產(chǎn)生的重要場所，同時也是植物生長發(fā)育的關(guān)鍵［42］。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹中同種植物基因家族間距離較遠(yuǎn)的進(jìn)化關(guān)系［5］，推測植物中不同的PRNs 可能發(fā)揮不同的功能。同時擬南芥AtPRN1具有槲皮素酶活性，可改變植物體內(nèi)槲皮素含量［16］。與細(xì)胞核的定位相結(jié)合，槲皮素酶活性和轉(zhuǎn)錄輔因子活性可能存在相關(guān)性，參與多個生物學(xué)過程。此外，槲皮素含量改變可能影響植物體內(nèi)活性氧的水平，進(jìn)而影響代謝、激素水平和抗逆，暗示植物PRNs 可能參與植物生長發(fā)育和抗逆過程，在抗逆品種培育方面具有一定的潛力。

目前植物PRNs 在調(diào)節(jié)重要的生物學(xué)功能的分子機(jī)制和功能多樣性仍未明確。hPRN 可作為藥物靶點(diǎn)，用于開展癌癥治療［43］。植物中是否存在類似hPRN 的氧化還原反應(yīng)感應(yīng)機(jī)制，以及是否在逆境脅迫調(diào)控中發(fā)揮重要作用還有待于進(jìn)一步研究。未來可通過進(jìn)一步闡明植物PRNs 功能及其調(diào)控機(jī)制，為作物分子設(shè)計育種提供新的靶點(diǎn)。