多肽/蛋白類物質(zhì)的合成研究進(jìn)展

＊田莉 耿慶信 彭日麗 李振環(huán)

（1.山東省泗水縣實驗中學(xué) 山東 273299 2.山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬中心醫(yī)院 山東 250014 3.天津工業(yè)大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院 天津工業(yè)大學(xué)省部共建分離膜與膜過程國家重點實驗室 天津 300387）

多肽/蛋白類物質(zhì)具有良好的生物相容性、抗菌性和可降解性，是調(diào)節(jié)生理平衡不可缺少的重要物質(zhì)，可以促進(jìn)細(xì)胞或其他生物質(zhì)的黏附和生長，并對生命體起到抑制、激活、促進(jìn)和修復(fù)等作用[1-3]。多肽/蛋白類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)單元為氨基酸，氨基酸類物質(zhì)既具有酸性，又具有堿性，因此多肽/蛋白類物質(zhì)可有效賦予無機材料表面攜帶正電荷，以調(diào)節(jié)材料表面的親疏水性，此外，多肽/蛋白類物質(zhì)（或氨基酸）在其他領(lǐng)域也應(yīng)用廣泛，例如組織工程、基因工程、臨床應(yīng)用和生物煉制等[3-4]。

圖1 多肽的常規(guī)合成方法

1.固相合成法合成多肽技術(shù)進(jìn)展

1963年Merrifield[5]開發(fā)了一種合成低肽序列的固相合成法（SPPS），即將氨基酸的羧基末端固定在不溶性樹脂上逐個縮合（圖1左）。SPPS法通過芐氧羰基（Cbz）保護(hù)氨基酸中的氨基，然后氨基酸與芐氯縮合后，再通過HBr-HOAc脫氨基保護(hù)基。脫出保護(hù)劑的氨基酸再用二胺化合物去除氨基質(zhì)子化等。該多肽合成法時間長、成本高、產(chǎn)量較低、難以合成較高分子量的產(chǎn)等[6]。

2.α-氨基酸-N-羧基內(nèi)酸酐法合成多肽技術(shù)進(jìn)展

α-氨基酸-N-羧基內(nèi)酸酐（NCAs）是一類非常重要的氨基酸衍生物，在開環(huán)縮聚中釋放CO2，生成相應(yīng)的多肽（圖1右），可根據(jù)氨基酸種類、數(shù)目及其排列方式，生成不同的聚合體結(jié)構(gòu)[8-9]。NCAs開環(huán)聚合具有反應(yīng)時間短、操作簡單、成本低、聚合物分子量高等優(yōu)點，但合成的聚合物缺少特定的序列，且分散性高。

NCAs通常用來合成特殊屬性和特定用途的多肽及其衍生物[10]，因此NCAs聚合在制備多肽和合成特定結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的研究中備受關(guān)注，研發(fā)人員系統(tǒng)篩選了用于NCAs聚合的引發(fā)劑，研究了引發(fā)劑的反應(yīng)效率，并考察了NCAs在合成多肽序列中分子量及其分子分布范圍的調(diào)控機制等[11-13]。近10年來，科學(xué)家們越來越關(guān)注高純NCAs制備，目的是控制NCAs有序開環(huán)，實現(xiàn)結(jié)構(gòu)明確的多肽合成[14]，促進(jìn)多肽嵌段共聚物的合成和自組裝，以及多肽耦合膠束和納米顆粒制備等[15]。因此，構(gòu)建具有精確分子量、精準(zhǔn)序列和明確拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的多肽聚合物，有利于多肽/蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系上取得巨大進(jìn)步，促進(jìn)多肽/蛋白質(zhì)類新藥的開發(fā)。

1906年，Leuchs首次報道了NCAs的合成新方法，開發(fā)了NCAs在多肽構(gòu)建中的應(yīng)用途徑[16]。隨后，α-氨基酸衍生物和鹵化劑（光氣、三光氣、PBr3、PCl3）合成NCAs技術(shù)相繼取得突破，合成了各種NCAs和不同結(jié)構(gòu)的多肽。此外，利用氯甲酸甲酯、NO/O2、氯甲酸芐酯、雙（2,4-二硝基苯基）碳酸酯和碳酸二苯酯等作為環(huán)化試劑也成功合成了NCAs。但這些NCAs合成法均具有諸多缺點和局限性，如原料劇毒和雜質(zhì)含量過高等問題[17]。

3.碳酸二甲酯（DMC）兩步法合成CA進(jìn)展

圖2 以DMC為環(huán)合劑合成NCAs反應(yīng)途徑

2019年李振環(huán)等人[18]開發(fā)了DMC法綠色合成NCAs技術(shù)，首先是合成N-甲氧基羰基-L-谷氨酸-γ-芐酯中間化合物，然后再由乙酸催化中間化合物環(huán)化生成L-谷氨酸-γ-芐酯羧酸酐（NCA-BLG）（圖2：上）。在60℃、110℃、120℃等溫度下反應(yīng)，幾乎沒有NCA-BLG的生成；但反應(yīng)溫度調(diào)控在90℃附近，NCAs收率最大為65.76%。隨后，該課題組[19]又開發(fā)了DMC“一鍋法”合成NCAs技術(shù)（圖2：下），發(fā)現(xiàn)在碳酸鈉和乙酸鋅協(xié)同催化下，DMC與丙氨酸“一鍋法”合成了N-羧基丙氨酸酸酐（NCAA），但NCAA收率只有53.2%。以磷酸鋅鈉為催化劑，在DMC與丙氨酸“一鍋法”反應(yīng)中，NCAA收率提高到了68.59%。P-O-Na+促進(jìn)了氨基酰基化反應(yīng)，生成的P-O-H與Zn2+協(xié)同催化了酰基化中間體靶向成環(huán)。然而，不論是分步反應(yīng)，還是“一鍋法”反應(yīng)，均存在多肽副產(chǎn)物，造成NACs收率下降。多肽的生成，一方面是NCAs原位開環(huán)聚合形成，另一方面是氨基酸酰基化中間體之間脫羧縮聚所致。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，在DMC法合成NCAs中，CO2能有效阻止N-甲氧?；被幔ò被狨；虚g體）脫羧，促進(jìn)NCAs收率提高。特別是當(dāng)反應(yīng)在負(fù)壓下進(jìn)行，更能促進(jìn)N-甲氧酰基氨基酸脫酸縮聚，提高了多肽生成的機會。由此可見，通過抑制N-甲氧?；被岱肿觾?nèi)關(guān)環(huán)，可為定向縮聚和可控聚合提供良好的反應(yīng)基礎(chǔ)。

4.NCAs在材料降解和環(huán)境治理中的新型用研進(jìn)展

李振環(huán)等人[20]利用谷氨酸（Glu）、丙氨酸（Ala）、纈氨酸（Val）和異亮氨酸（Ile）為原料制備了4種類型的NCAs。并以不同的NCAs改性3-羥基丁酸與3-羥基己酸的共聚酯（PHBHHx），實驗發(fā)現(xiàn)：PHBHHx-P(Glu)、PHBHHx-P(Ala)、PHBHHx-P(Val)和PHBHHx-P(Ile)等改性材料在模擬體液中比PHBHHx具有更好的降解效果，然而在模擬體液中，即使混合等量谷氨酸、丙氨酸、纈氨酸或異亮氨酸，PHBHHx降解效果依然很差，甚至不降解（圖3）。這說明改性PHBHHx過程中，NCAs開環(huán)縮聚生成的多肽促進(jìn)了PHBHHx基體分解。此外，通過硝化還原法，實現(xiàn)PPS多孔膜的表面氨化，再通過氨基引發(fā)NCAs聚合反應(yīng)，將不同種類的氨基酸多肽聚合物接枝到PPS多孔膜表面，該膜具有良好的抗污染性[21]。由此可見，多肽/蛋白類物質(zhì)不僅在制藥和臨床領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用價值，在環(huán)境治理領(lǐng)域也有不俗的表現(xiàn)，如固體廢棄物降解和污水治理等。

圖3 改性材料合成路線；改性材料在SBF溶液中的降解性（材料N原子的摩爾含量，PHBHHx0.04%、PHBHHx-block-P(Ala)1.46%、PHBHHx-block-P(Val)0.49%、PHBHHx-block-P(Ile)0.22%、PHBHHx-block-P(Glu)0.16%）

5.N-甲氧?；被嶂苯影邢蛎擊群铣呻募夹g(shù)進(jìn)展

圖4 新技術(shù)未來的研究思路

天津工業(yè)大學(xué)李振環(huán)課題組目前提出基于N-甲氧?；被岚邢蛎擊群铣啥嚯募夹g(shù)（圖4）。利用調(diào)控羧基催化活化機制，利用溶劑效應(yīng)，結(jié)合負(fù)壓反應(yīng)等抑制N-甲氧酰基氨基酸分子內(nèi)關(guān)環(huán)，實現(xiàn)分子間靶向縮聚。利用氨基酸中R基團(tuán)的空間結(jié)構(gòu)效應(yīng)調(diào)控分子內(nèi)關(guān)環(huán)和分子間脫羧的競爭反應(yīng)成效，在非鍵作用力（氫鍵和范德華力等）調(diào)控下，制備氨基酸序列可控的多肽，解析多肽結(jié)構(gòu)與性能的關(guān)系，開拓多肽的應(yīng)用領(lǐng)域。

6.結(jié)論

文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，固相合成法耗時長、成本高、產(chǎn)量低、且無法合成高分子量的多肽。盡管NCAs法制備多肽技術(shù)備受關(guān)注，但合成的多肽缺少特定的序列、分散性高、聚合過程可控性差、且聚合中存在不可預(yù)測的副反應(yīng)等。然而在碳酸二甲酯法合成NCAs中，如果能有效的促進(jìn)N—甲氧基?；被嶂虚g體的靶向脫羧縮聚，可實現(xiàn)直接合成多肽，即利用N-甲氧?；被幔∟-MC-AC）靶向脫羧（脫CO2）合成多肽。