一種新型植物乳桿菌素的分離純化研究

＊王金澤 劉哲 黃一剛 裴金金,2,3,4*

（1.陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院 陜西 723000 2.陜西省資源生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 陜西 723000 3.陜南秦巴山區(qū)生物資源綜合開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心 陜西 723000 4.陜西理工大學(xué)秦巴生物資源與生態(tài)環(huán)境省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（培育） 陜西 723000）

細(xì)菌素具有優(yōu)勢(shì)，因?yàn)樗鼈儫o(wú)毒、高抗菌活性和良好的選擇性[1]。因此，它們有望在食品工業(yè)中用作抗菌劑/防腐劑[2]。馴養(yǎng)牦牛在青海省已經(jīng)飼養(yǎng)了數(shù)千年。牦牛干酪含有不同的微生物含量，這取決于原產(chǎn)牛奶和發(fā)酵環(huán)境的不同。因此，它可能是細(xì)菌素產(chǎn)生菌分離的理想來(lái)源。盡管從許多其他來(lái)源[3]分離出細(xì)菌素已有報(bào)道，但目前從青海牦牛乳干酪中分離到細(xì)菌素的報(bào)道還很少。本研究從青海牦牛乳干酪分離株Lb的上清液中分離純化出一種新的細(xì)菌素植物乳桿菌素SLG1，命名為L(zhǎng)b.植物乳桿菌SLG1。在本研究中，我們還對(duì)植物乳桿菌素SLG1的理化性質(zhì)進(jìn)行了表征。

1.材料與方法

(1)產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌(LAB)的篩選

①乳酸菌（LAB）的分離

傳統(tǒng)的青海牦牛奶酪是從當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)購(gòu)買的。然后將牦牛奶酪切成20g/片，并將它們均化至均勻。然后將奶酪加入100mL MRS肉湯中并在30℃溫育。溫育24h后，使用培養(yǎng)環(huán)將液體懸浮液涂在MRS板上。將革蘭氏陽(yáng)性且過(guò)氧化氫酶陰性的菌暫定為乳酸菌（LAB）[4]。無(wú)細(xì)胞上清液（CFs）是通過(guò)離心和0.26mm微過(guò)濾器過(guò)濾獲得的[5]。以金黃葡萄球菌指示菌株CICC10384為指示菌株，采用牛津杯法測(cè)定CFS對(duì)金黃色葡萄球菌的抗菌活性[6]。

②產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的鑒定

使用鑒定試劑盒（API 50CHL，BioMerieux，法國(guó)Montalieu Vercie）根據(jù)菌株的碳水化合物發(fā)酵模式進(jìn)行初步鑒定[4]。采用27F和1492R引物通過(guò)16SrRNA基因序列分析對(duì)該細(xì)菌菌株進(jìn)行基因型鑒定[7]。然后將序列提交給NCBI使用BLAST進(jìn)行分析，來(lái)比較相似性。

(2)菌株SLG1生產(chǎn)細(xì)菌素的研究

將細(xì)菌素產(chǎn)生菌接種于MRS培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)，每隔4h測(cè)定一次抗菌活性和pH值。

(3)細(xì)菌素的提純

①納米磁性脂質(zhì)體的制備

鐵磁性Fe3O4納米顆粒是用水熱方法制備的[8]。將蛋黃磷脂酰膽堿（EYPC，最低98%純度）和1,2-dimyristoylsn-glycerophosphatidylglycerol（鈉鹽，最低97%純度）（2:1，w/w）溶解在氯仿/甲醇（2:1，v/v）中，用薄膜分散法制備納米磁性脂質(zhì)體顆粒[9]。

②細(xì)菌素的篩選與純化

將細(xì)菌素產(chǎn)生菌的胞外發(fā)酵液與磁性脂質(zhì)體在30℃下混合24h，將細(xì)菌素吸附到磁性脂質(zhì)體中，以含50mM NaCl的PBS（pH7.2，10mm）為等度流動(dòng)相，在25℃下分離磁性脂質(zhì)體中的細(xì)菌素，在215nm處測(cè)定吸光度。收集具有吸收峰的洗脫組分，并用牛津杯法分析其抗菌活性[6]。蛋白質(zhì)濃度用Brodf定量[5]進(jìn)行測(cè)試。收集活性最高的洗脫液。采用高效液相色譜法（Waters Symmetry C18柱，250±4.6mm，5mm，愛爾蘭都柏林）梯度分離（流動(dòng)相B：5e 100%），流速0.5mL/min，25℃，流動(dòng)相（A）0.05%（v/v）三氟乙酸（TFA）和流動(dòng)相（B）100%乙腈。

(4)結(jié)構(gòu)特征

對(duì)純化的細(xì)菌素進(jìn)行氨基酸序列測(cè)定（Procise491，ABI，USA）。使用NCBI BLAST算法進(jìn)行同源性搜索。用HyperChem7.5軟件預(yù)測(cè)細(xì)菌素的三維結(jié)構(gòu)。

(5)細(xì)菌素的抗菌活性及其特性研究

針對(duì)表1中列出的指示菌株測(cè)試了細(xì)菌素活性。MIC為最小抑菌濃度，即最低抑菌濃度，在微生物鑒定的稀釋法中以在試管內(nèi)或小孔內(nèi)完全抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度為最低抑菌濃度。MBC為最小殺菌濃度，即殺死99.9%（降低3個(gè)數(shù)量級(jí)）的供試微生物所需的最低藥物濃度。并采用掃描電鏡對(duì)比觀察經(jīng)細(xì)菌素處理和未經(jīng)細(xì)菌素處理的金黃葡萄球菌的形態(tài)，研究細(xì)菌素的抗菌活性及抗菌機(jī)理。

表1 細(xì)菌素的抗菌活性

續(xù)表

2.結(jié)果與分析

(1)SLG1菌株的分離與鑒定

從青海牦牛干酪中分離到17株潛在的實(shí)驗(yàn)室菌株。通過(guò)調(diào)節(jié)上清液的pH至6.5并檢測(cè)其抑菌活性，排除了有機(jī)酸對(duì)實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌生長(zhǎng)抑制活性的可能性。從中篩選出9株細(xì)菌素產(chǎn)生菌。由于SLG1菌株能同時(shí)抑制革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌（金黃色葡萄球菌CICC10384的生長(zhǎng)），本研究選擇該菌株進(jìn)行進(jìn)一步研究。根據(jù)API 50CHL系統(tǒng)和16SrDNA鑒定表明，SLG1菌株為植物乳桿菌，命名為植物乳桿菌SLG1。

乳酸菌產(chǎn)生的細(xì)菌素由于其安全的性質(zhì)和高的抑菌活性，近年來(lái)引起了人們的極大關(guān)注。此外，牦牛奶制成的奶酪被認(rèn)為可以治療胃炎疾病，還含有各種各樣的微生物群落[10]。因此，它可能是分離細(xì)菌素產(chǎn)生菌的一個(gè)潛在來(lái)源。

(2)細(xì)菌素的產(chǎn)生

植物乳桿菌SLG1是在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期產(chǎn)生的，最高產(chǎn)量出現(xiàn)在穩(wěn)定期中期（從27h到36h）。這表明植物素SLG1的產(chǎn)生依賴于細(xì)胞數(shù)量，它可能是一種次生代謝物。在一些實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌素中也觀察到了類似的結(jié)果，如植物乳桿菌2a產(chǎn)生的細(xì)菌素2a，由乳酸鏈球菌產(chǎn)生的細(xì)菌素R1333。

(3)細(xì)菌素的純化

從磁性脂質(zhì)體中洗脫出三個(gè)組分，洗脫液#3顯示最高的抗菌活性，然后使用RP-HPLC從洗脫液#3中純化獲得細(xì)菌素SLG1。乳酸菌細(xì)菌素的傳統(tǒng)方法通常涉及復(fù)雜的色譜過(guò)程[11-12]，雖然有效，但過(guò)于復(fù)雜，通常涉及三個(gè)以上的凈化步驟。例如，細(xì)菌素R1333是從乳酸菌的上清液中提純出來(lái)的，經(jīng)硫酸銨沉淀、凝膠過(guò)濾、反相高效液相色譜（RPHPLC）分離。人們認(rèn)為，所有細(xì)菌素，無(wú)論其作用機(jī)制如何，都需要與目標(biāo)細(xì)菌細(xì)胞膜交換才能發(fā)揮活性[13]?；谶@一觀點(diǎn)，本研究旨在利用磁性脂質(zhì)體吸附和反相高效液相色譜（RP-HPLC）兩步法快速篩選能夠與菌膜結(jié)合的抗菌肽，作為一種簡(jiǎn)便有效的純化方法。

(4)植物乳桿菌素的結(jié)構(gòu)特征

細(xì)菌素SLG 1的10個(gè)氨基酸序列被成功鑒定為Tyr-GlyAsn-Gly-Val-Phe-Ser-Val-Ile-Lys。當(dāng)嘗試進(jìn)行NCBI BLAST同源性分析時(shí)，未檢測(cè)到與任何已知肽的相似性。因此，該細(xì)菌素被確定為一種新的多肽，命名為植物乳桿菌素SLG1。用生物信息學(xué)工具預(yù)測(cè)其結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖1所示，成無(wú)規(guī)則卷曲狀態(tài)。據(jù)報(bào)道，許多細(xì)菌素在水溶液中具有隨機(jī)卷曲狀態(tài)[9]，這種結(jié)果可能使其更容易插入細(xì)菌細(xì)胞膜。

圖1 用HyperChem7.0軟件計(jì)算得到的植物乳桿菌素SLG1的三維結(jié)構(gòu)

(5)植物乳桿菌素SLG1的抗菌活性及其特性研究

植物乳桿菌素SLG1對(duì)枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、黃色微球菌、嗜熱梭狀芽孢桿菌、酪酸梭菌、金黃色葡萄球菌、無(wú)毒李斯特菌和白紋伊氏菌均具有良好的抗菌活性（表1）。掃描電鏡觀察結(jié)果顯示，經(jīng)細(xì)菌素SLG1處理后的金黃葡萄球菌細(xì)胞皺縮、破裂，細(xì)胞內(nèi)容物流失從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。說(shuō)明SLG1可通過(guò)作用敏感菌細(xì)胞膜，造成胞膜通透性增加，細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞的方式發(fā)揮其抗菌機(jī)制。

圖2 植物乳桿菌SLG1(2MIC)對(duì)敏感微生物細(xì)胞形態(tài)的影響

3.結(jié)論

本研究從牦牛奶干酪中分離篩選獲得細(xì)菌素產(chǎn)生菌植物乳桿菌SLG1。建立磁性脂質(zhì)體吸附結(jié)合反相高效液相色譜（RP-HPLC）的有效純化細(xì)菌素的新方法，并純化獲得一種新型細(xì)菌素，命名為植物乳桿菌素SLG1。其氨基酸序列為YGNGVFSVIK。該細(xì)菌素對(duì)枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、黃色微球菌、嗜熱梭狀芽孢桿菌、酪酸梭菌、金黃色葡萄球菌、無(wú)毒李斯特菌和白紋伊氏菌具有良好的抗菌活性。此外，植物乳桿菌素SLG1可以增加細(xì)胞膜的通透性，導(dǎo)致孔洞形成和最終細(xì)胞死亡。最后，這種細(xì)菌素具有作為一種有前途的抗菌劑的潛力，可用于進(jìn)一步的食品或醫(yī)療應(yīng)用。