HPLC測(cè)定蒲公英中4種有機(jī)酸含量并優(yōu)化提取純化工藝

＊王倩楠 石錦峰 鄭家勤 王晗毓 董自波,2*

（1.江蘇海洋大學(xué)藥學(xué)院 江蘇 222005 2.海洋藥用資源開(kāi)發(fā)工程研究中心 江蘇 222005）

引言

蒲公英（Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz.）屬多年生草本植物，廣泛分布于我國(guó)西南和西北等地區(qū)，是一種藥食同源的中藥材資源[1]?，F(xiàn)代研究表明，蒲公英富含有機(jī)酸、黃酮、多糖、甾醇、三萜等有效成分[2-3]。蒲公英有機(jī)酸包括綠原酸、咖啡酸、菊苣酸、單咖啡酰酒石酸、阿魏酸等，具有抗炎、抗菌、抗氧化等作用[4]。此外，菊苣酸還能降脂、降糖、提高人體免疫力[5]。蒲公英臨床可用于胃潰瘍和上呼吸道感染等疾病治療[6]。作為產(chǎn)量大、價(jià)廉易得的中藥，優(yōu)化提取純化工藝，可加大利用率，提高經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。

1.儀器與材料

(1)材料

蒲公英購(gòu)自安徽井泉中藥股份有限公司；單咖啡酰酒石酸、綠原酸、菊苣酸、咖啡酸（純度≥98%）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；NKA-2、NKA-9、HPD-450、DA201、AB-8大孔樹(shù)脂購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；Agileant-XDA-8 C18柱購(gòu)自安捷倫科技有限公司；超純水、蒸餾水自制；甲醇、乙腈為色譜級(jí)；其余試劑為分析純。

(2)主要儀器

島津DGU-20A3R高效液相色譜儀；UV-1800PC型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)；ES1035A型電子分析天平；FRQ-1010HT型數(shù)控超聲波清洗機(jī)；KMD型加熱套；Spring-R30型超純水儀。

2.方法與結(jié)果

(1)綠原酸、咖啡酸、菊苣酸和單咖啡酰酒石酸的含量測(cè)定

①色譜條件

色譜條件：流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0.1%磷酸-0.04%三乙胺-0.02%二正丁胺溶液，梯度洗脫（0～4min 5%～10%A；4～12min 10%～20%A；12～21min 20%～40%A；21～23min 40%～50%A；23～24min 50%～5%A；24～29min 5%A），流速1.0mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)為328nm，柱溫35℃，進(jìn)樣量10μL。

②對(duì)照品與供試品的制備

精密稱(chēng)取菊苣酸、咖啡酸、綠原酸與單咖啡酰酒石酸對(duì)照品于容量瓶中，70%甲醇超聲后定容至刻度；另精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液置于同一量瓶后定容，制成含菊苣酸、咖啡酸、綠原酸與單咖啡酰酒石酸83.62μg/mL，20.36μg/mL，9.46μg/mL和101.8μg/mL的混合對(duì)照品。取蒲公英提取物于容量瓶中，加入70%甲醇超聲15min后定容，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

③系統(tǒng)適用性研究

精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品與供試品溶液，于“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)樣并記錄色譜圖1。

圖1 HPLC對(duì)照品

④線(xiàn)性關(guān)系考察

精密量取混合對(duì)照品1mL、2mL、4mL、6mL、8mL、10mL置20mL容量瓶后定容，進(jìn)樣1次。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），峰面積為縱坐標(biāo)（y）繪制。單咖啡酰酒石酸、綠原酸、咖啡酸和菊苣酸的回歸方程分別為：y1=14700x-11272（R1=0.9997）、y2=80568x-3794.9（R2=0.9992）、y3=58958x+12381（R3=0.9996）和y4=24413x-14939（R4=0.9998）。結(jié)果表明，單咖啡酰酒石酸、綠原酸、咖啡酸和菊苣酸質(zhì)量濃度分別5.09～50.9μg，0.47～4.73μg，1.02～10.18μg和4.18～41.81μg的范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

⑤精密度試驗(yàn)

取同一份對(duì)照品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算單咖啡酰酒石酸、綠原酸、咖啡酸、菊苣酸峰面積的RSD分別為0.27%，0.86%，0.21%，1.65%（n=6），RSD＜2%，符合規(guī)定，表明儀器精密度良好。

⑥穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份供試品溶液，室溫下放置0h、2h、4h、8h、12h、16h、20h、24h后分別進(jìn)樣，單咖啡酰酒石酸、綠原酸、咖啡酸、菊苣酸RSD分別為1.72%，0.46%，0.07%，0.16%（n=8），RSD＜2，符合規(guī)定，說(shuō)明24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

⑦重復(fù)性試驗(yàn)

取同一份供試品溶液平行制備6份，分別進(jìn)樣1次，計(jì)算單咖啡酰酒石酸、綠原酸、咖啡酸和菊苣酸的含量和RSD為1.57%，1.48%，1.03%，1.80%，RSD＜2%，表明該方法重復(fù)性良好。

⑧回收率試驗(yàn)

精密稱(chēng)取1mL蒲公英純化物，共6份，并加入單咖啡酰酒石酸、綠原酸、咖啡酸和菊苣酸對(duì)照品儲(chǔ)備液，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備加樣供試液，進(jìn)樣1次，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果得單咖啡酰酒石酸、綠原酸、咖啡酸和菊苣酸的平均回收率為100.97%，97.46%，101.54%，99.62%，RSD分別為0.85%，1.76%，0.93%，0.32%，該方法準(zhǔn)確度好。

(2)純化工藝研究

①樹(shù)脂的預(yù)處理與上柱液的制備

將NKA-2、NKA-9、HPD-450、DA201、AB-8樹(shù)脂用95%乙醇浸泡24h，充分溶脹后濕法裝柱，用95%乙醇洗脫直至流出液無(wú)白色渾濁后，水洗至無(wú)醇味。取40g蒲公英熱水提取，第一次加水15倍，提取1.5h，第二次加水12倍，提取1h，合并濾液，即得。

②大孔吸附樹(shù)脂篩選

錐形瓶中加入20mL大孔樹(shù)脂與40mL上柱液，室溫震蕩24h，測(cè)定續(xù)濾液、乙醇洗脫液中單咖啡酰酒石酸、綠原酸、咖啡酸和菊苣酸的量，計(jì)算吸附率、解吸率、吸附量，以菊苣酸和單咖啡酰酒石酸為主比較，結(jié)果如表1、表2所示，優(yōu)選DA201樹(shù)脂。

表1 5種大孔樹(shù)脂的吸附率（%）與吸附量（μg/mL）

表2 5種大孔樹(shù)脂的解吸率（%）

③最大吸附量考察

取樹(shù)脂25mL，上柱液150mL，以2.0BV·h-1流速進(jìn)行吸附，分段收集流出液，每5mL測(cè)定蒲公英總有機(jī)酸的峰面積，以編號(hào)為橫坐標(biāo)，計(jì)算質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，繪制泄露曲線(xiàn)。結(jié)果如圖2所示，在第22份出現(xiàn)明顯的泄露行為，除去殘留水體積14mL，總上柱量為96mL，即1mL DA201樹(shù)脂可以吸附3.8mL的蒲公英提取液。

④吸附流速考察

取DA201樹(shù)脂25mL，上柱液100mL，分別以0.5BV·h-1、1.0BV·h-1、1.5BV·h-1、2.0BV·h-1、3.0BV·h-1流速進(jìn)行吸附。收集流出液后，檢測(cè)4種有機(jī)酸的峰面積，計(jì)算有機(jī)酸含量與吸附率。結(jié)果如表3所示顯示，隨著流速加快，吸附率越小，表明樹(shù)脂交換率下降，流速過(guò)慢則時(shí)間成本增加，不利于工廠(chǎng)生產(chǎn)，故選1.5BV·h-1為最佳流速，即保障有機(jī)酸富集量最大又提高效率。

表3 不同吸附流速下的吸附率（%）比較

⑤洗脫流速的考察

取上樣液按照最佳條件吸附后，用3BV 50%乙醇以1.0BV·h-1、2.0BV·h-1、3.0BV·h-1、4.0BV·h-1、5.0BV·h-1流速進(jìn)行洗脫，收集解吸液，按照“2.1.2”項(xiàng)目下進(jìn)行制樣，測(cè)定蒲公英4種有機(jī)酸含量，計(jì)算解析率。結(jié)果顯示，4種有機(jī)酸含量先增加后降低，解析率隨洗脫流速的加大而下降，結(jié)合提取效率與結(jié)果綜合分析，2.0BV·h-1為最優(yōu)洗脫流速。

⑥洗脫溶劑濃度考察

取大孔樹(shù)脂并按上述條件吸附后，將30%、50%、80%、95%乙醇以2.0BV·h-1流速進(jìn)行洗脫，用量為3BV，測(cè)定洗脫液里各有機(jī)酸含量。如表4所示，乙醇濃度為80%時(shí)，洗脫物中總有機(jī)酸含量最高。

表4 5種大孔樹(shù)脂解吸液的濃度（mg/g）

⑦洗脫溶劑體積考察

取DA201樹(shù)脂吸附后，用10BV 80%的乙醇進(jìn)行洗脫，流速2.0BV·h-1，每1BV分段收集，測(cè)定菊苣酸的含量并計(jì)算累計(jì)解析率，以流份為橫坐標(biāo)，累積解吸率為縱坐標(biāo)作解吸曲線(xiàn)。由圖2可知，5BV的乙醇可將有機(jī)酸基本解吸完全，確定洗脫液體積5BV。

圖2 總有機(jī)酸的泄露曲線(xiàn)

圖3 菊苣酸的泄露曲線(xiàn)

⑧驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

取25mL DA201樹(shù)脂和125mL提取液，以1.5BV·h-1流速進(jìn)行吸附和4BV水洗后，最后用5BV 80%乙醇以2BV·h-1的流速洗脫，平行3次。菊苣酸、單咖啡酰酒石酸、咖啡酸、綠原酸平均質(zhì)量濃度分別為2.8752mg/g、0.8167mg/g、0.3407mg/g、0.1469mg/g，有效成份大幅提高，吸附與洗脫良好。

3.討論

我國(guó)蒲公英分布廣泛、產(chǎn)量大、價(jià)廉易得，對(duì)其提取分離純化工藝進(jìn)行優(yōu)化，加大其利用率，可以提高其經(jīng)濟(jì)效益。本實(shí)驗(yàn)以蒲公英4種有機(jī)酸為指標(biāo)，優(yōu)選DA201大孔樹(shù)脂，上樣體積為4BV，吸附流速為1.5BV·h-1，4BV洗滌用水量，5BV 80%乙醇以2.0BV·h-1的流速洗脫，純化后，4種有機(jī)酸含量大幅提升，效果良好。