瞬態(tài)過(guò)程研究用新型低溫生物顯微成像冷凍臺(tái)研制

張宏彬，黃永華*，韓廈，李錚

（1-上海交通大學(xué)制冷與低溫工程研究所，上海 200240；2-上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院泌尿中心男科，上海 200080）

0 引言

低溫顯微鏡是研究生物切片組織和細(xì)胞在低溫下凍融機(jī)理的重要工具之一，它不僅包括顯微成像系統(tǒng)，還嵌入生物樣本冷凍、保溫和復(fù)溫功能[1-4]，通常以液氮或冷氮?dú)鉃槔湓础＿^(guò)去幾十年中，文獻(xiàn)報(bào)道了多種類型的低溫顯微鏡冷凍平臺(tái)，用于觀察不同條件下的冷凍現(xiàn)象。根據(jù)低溫降溫方式的不同，可分為對(duì)流型和導(dǎo)熱型。DILLER等[5-6]較早研制了用于觀察生物細(xì)胞的對(duì)流型低溫顯微鏡，以恒定氮?dú)饬鳛槔湓矗暂d物片上的透明氧化錫鍍膜為加熱器，所設(shè)計(jì)的自動(dòng)溫度控制系統(tǒng)可調(diào)節(jié)冷凍和解凍過(guò)程中的溫度變化率，降溫速率約100 ℃/min。鄔申義等[7]研制出國(guó)內(nèi)首臺(tái)低溫顯微鏡，采用冷氮?dú)饫鋮s樣品，用水或者熱氮?dú)饧訜針悠?，并通過(guò)調(diào)控電磁閥的啟閉時(shí)間來(lái)實(shí)現(xiàn)溫度變化速率的控制，升降溫速率在0～100 ℃/min內(nèi)可控，控溫精度為0.1 ℃，控溫范圍-196～50 ℃。NAMPERUMAL等[8]設(shè)計(jì)了一種定向固化的冷凍臺(tái)，通過(guò)使樣品橫跨冷熱臺(tái)之間微小間隙達(dá)到超高速的降溫升溫，最高能提供18 000 ℃/min的升降溫速率。張紹志等[9]研制了同樣以冷氮?dú)鉃槔湓吹膶?duì)流型低溫顯微鏡，最低溫度約為-50 ℃，通過(guò)電子膨脹閥控制冷卻介質(zhì)的流量，計(jì)算機(jī)輸出模擬信號(hào)控制鍍膜玻璃的加熱量，采用比例積分微分算法控制升降速率，實(shí)現(xiàn)了50 ℃/min的降溫速率以及100 ℃/min的升溫速率。范菊莉等[10]對(duì)低溫臺(tái)溫度場(chǎng)的分布情況進(jìn)行了數(shù)值模擬和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)對(duì)流型顯微鏡樣品層溫度在水平方向上基本均勻。LEGROS等[11]設(shè)計(jì)了可以通過(guò)旋轉(zhuǎn)低溫臺(tái)一次性觀察多份樣品的低溫顯微鏡，低溫臺(tái)通過(guò)一根浸入液氮的導(dǎo)熱柱進(jìn)行降溫，低溫臺(tái)上有小孔用于存放不同樣品，控溫范圍為-190～27 ℃，降溫速率約30 ℃/min，拍攝的圖片分辨率最高可達(dá)250 nm。因此，以往的低溫生物顯微鏡系統(tǒng)已實(shí)現(xiàn)降溫和觀察兩大基本訴求，且基本以對(duì)流型降溫為主。但是對(duì)于單項(xiàng)設(shè)備，其綜合升降溫速率、極限低溫和成像效果等仍無(wú)法滿足諸如人類配子和切片組織的超快速降溫過(guò)程研究要求。上述設(shè)備對(duì)降復(fù)溫過(guò)程中生物樣品所處的氣體氛圍缺乏相關(guān)的考慮和舉措。

本文設(shè)計(jì)和研制了一種新型低溫生物顯微成像冷凍臺(tái)，通過(guò)控制裝載生物樣本的環(huán)境艙運(yùn)動(dòng)，進(jìn)而與真空絕熱腔體內(nèi)低溫?zé)岢恋慕佑|來(lái)實(shí)現(xiàn)瞬間啟動(dòng)的快速降溫效果。相較于以往的低溫生物顯微鏡，其生物樣本與低溫冷源分離，既可以實(shí)現(xiàn)樣本的環(huán)境氛圍可控，還使生物樣本在實(shí)驗(yàn)前的任意時(shí)刻都處于常溫狀態(tài)，排除降溫初期的干擾和不確定性，并有利于提升降溫速率和提高過(guò)程可控性。

1 實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)設(shè)計(jì)與研制

當(dāng)高速顯微成像需求和深低溫環(huán)境兩個(gè)要素結(jié)合在一起時(shí)，所需要實(shí)現(xiàn)的技術(shù)難度絕不是兩者的線性疊加，其挑戰(zhàn)性成倍增加。在此基礎(chǔ)上，要實(shí)現(xiàn)對(duì)生物組織切片或者細(xì)胞的高速降溫，則又增加了一個(gè)技術(shù)的維度。為了同步滿足上述多方面的技術(shù)要求，設(shè)計(jì)并搭建了如圖1所示的生物樣品低溫冷凍和顯微成像系統(tǒng)，主要由真空腔體、液氮熱沉、環(huán)境艙、氣浮減震平臺(tái)、分子泵機(jī)組、驅(qū)動(dòng)電機(jī)、液氮供排系統(tǒng)和測(cè)量控制系統(tǒng)等組成。

圖1 低溫凍融和顯微成像系統(tǒng)

低溫顯微鏡系統(tǒng)與普通顯微鏡相比，其特點(diǎn)在于低溫的實(shí)現(xiàn)和對(duì)溫度的控制，主要體現(xiàn)在升降溫速率和極限低溫。一方面，為了獲得較高的降溫速率需要樣品與冷源之間具有良好的傳熱能力；另一方面為了達(dá)到并保持足夠低的溫度，以及保持視窗不起霧，則需要較強(qiáng)的保溫性能。新型降復(fù)溫系統(tǒng)使用電機(jī)控制真空環(huán)境中物體間的接觸與分離，能很好實(shí)現(xiàn)以上兩種傳熱要求。如圖2所示，真空腔體為扁平圓腔，上表面中心設(shè)有觀察窗，垂直向下依次設(shè)有環(huán)境艙和液氮熱沉。

圖2 真空腔體內(nèi)部設(shè)計(jì)

環(huán)境艙亦為扁平圓盤(pán)結(jié)構(gòu)，主體為不銹鋼材質(zhì)，上蓋板中心為玻璃觀察窗，底面中心開(kāi)有圓形小孔，內(nèi)嵌低溫下熱導(dǎo)率極大[12]的藍(lán)寶石片并以低溫膠粘接密封形成密閉環(huán)境。藍(lán)寶石片上表面開(kāi)有粗細(xì)兩條樣品槽以及一個(gè)溫度傳感器安裝槽，其結(jié)構(gòu)如圖3所示。環(huán)境艙側(cè)壁面通過(guò)導(dǎo)氣管與外部潔凈氣源連通，其內(nèi)部氣體氛圍可控，通常處于常壓下，但可更換為空氣、氧氣或氮?dú)獾雀鞣N氣體。圖2中液氮熱沉為銅質(zhì)中空?qǐng)A筒，容積為2 L，內(nèi)部充有液氮，頂板焊接三根導(dǎo)熱效率極高的銅柱，向下插入液氮浴中，保持頂面處于液氮溫度。測(cè)量控制系統(tǒng)由計(jì)算機(jī)、溫度傳感器、數(shù)據(jù)采集儀、測(cè)控柜、高速相機(jī)、顯微鏡等組成，其中主要設(shè)備的性能參數(shù)如表1所示。

圖3 藍(lán)寶石玻璃載物臺(tái)結(jié)構(gòu)

表1 測(cè)控系統(tǒng)性能參數(shù)

在真空度為10-3Pa的真空腔體中，環(huán)境艙與液氮熱沉分離時(shí)，兩者之間僅存在極低的輻射換熱，這確保了液氮冷源在待機(jī)期間不會(huì)影響環(huán)境艙。當(dāng)通過(guò)步進(jìn)電機(jī)移動(dòng)環(huán)境艙與液氮熱沉接觸并提供一定預(yù)緊力時(shí)，兩者之間的傳熱瞬間強(qiáng)化。需要說(shuō)明的是，藍(lán)寶石載物臺(tái)的底面相比環(huán)境艙的底面微凸0.1 mm，這使得冷量的傳遞集中在載物臺(tái)區(qū)域，從而實(shí)現(xiàn)了核心區(qū)域的快速降溫。在樣品復(fù)溫時(shí)，則使環(huán)境艙與液氮冷源處于分離狀態(tài)，并啟用加熱絲進(jìn)行加熱。

2 系統(tǒng)傳熱計(jì)算與分析

系統(tǒng)降溫過(guò)程中，為了達(dá)到更高的降溫速率，必須在減小樣品漏熱的同時(shí)，增強(qiáng)從液氮冷源到樣品各個(gè)環(huán)節(jié)間的傳熱。圖4所示為真空腔體傳熱流程。由于藍(lán)寶石在低溫下導(dǎo)熱系數(shù)極高、可忽略其熱阻。載物臺(tái)與液氮熱沉間的接觸熱阻是制約降溫速率的主要因素，同時(shí)載物臺(tái)的厚度及邊界條件也會(huì)對(duì)降溫速率產(chǎn)生一定影響。本文將通過(guò)對(duì)換熱核心區(qū)域進(jìn)行數(shù)值模擬以優(yōu)化設(shè)計(jì)方案。

圖4 真空腔體傳熱流程

2.1 傳熱計(jì)算模型

低溫顯微鏡系統(tǒng)中，關(guān)注的核心區(qū)域是環(huán)境艙內(nèi)部。由于環(huán)境艙為圓盤(pán)狀中心對(duì)稱結(jié)構(gòu)，故建立以A-A'為對(duì)稱軸的二維數(shù)值模型，如圖5所示，其中藍(lán)寶石載物臺(tái)的半徑為r，厚度為δ，溫度傳感器布置點(diǎn)（即監(jiān)測(cè)點(diǎn)）的坐標(biāo)為（r，0.8δ）。

圖5 環(huán)境艙數(shù)值模型

假設(shè)環(huán)境艙外表面為絕熱，環(huán)境艙與冷源的輻射換熱忽略不計(jì)，溫度傳感器及樣品體積極小，不考慮其對(duì)載物片溫度分布的影響?；谝陨霞僭O(shè)，對(duì)所選取區(qū)域進(jìn)行二維非穩(wěn)態(tài)導(dǎo)熱計(jì)算。材料物性參數(shù)隨溫度變化，特別是藍(lán)寶石隨著溫度的降低，其導(dǎo)熱系數(shù)會(huì)明顯增大，將藍(lán)寶石Al2O3的導(dǎo)熱系數(shù)k隨溫度T的變化按k=A+B/T來(lái)擬合[13]，其中A=-2.599 W/(m·K)，B=11 760 W/m。采用有限差分法將空間和時(shí)間離散化，通過(guò)空間步長(zhǎng)及迭代計(jì)算的穩(wěn)定性條件確定時(shí)間步長(zhǎng)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件設(shè)置溫度場(chǎng)初始條件。對(duì)不同邊界條件的每個(gè)單元進(jìn)行能量守恒計(jì)算，依次得到后一時(shí)刻的溫度場(chǎng)[14]。不同計(jì)算區(qū)域的傳熱方程不同。

圖6所示為冷源邊界網(wǎng)格。針對(duì)坐標(biāo)（i,j）所在的單元體建立能量平衡式如式(1)。其中Ti，j為對(duì)應(yīng)坐標(biāo)的單元體溫度，Tc為冷源溫度，hc為冷源與單元體之間的傳熱系數(shù)，τ為時(shí)間，λ1、ρ和cp分別為單元體的導(dǎo)熱系數(shù)、密度和定壓比熱容。

圖6 冷源邊界網(wǎng)格

圖7所示為自然對(duì)流區(qū)域，針對(duì)坐標(biāo)（i,j）所在的單元體建立能量平衡式如式(2)。其中下標(biāo)1和2表示不同材質(zhì)的單元體。

圖7 自然對(duì)流區(qū)域離散處理

采用格拉曉夫數(shù)Gr作為傳熱規(guī)律轉(zhuǎn)變判據(jù)[15]，當(dāng)Gr<104，按導(dǎo)熱計(jì)算傳熱量，對(duì)流換熱表面?zhèn)鳠嵯禂?shù)h的計(jì)算式如下：

當(dāng)Gr>104，按有限空間自然對(duì)流計(jì)算，采用如下所示的Nu經(jīng)驗(yàn)公式[15]：

Pr為普朗特?cái)?shù)，則對(duì)流換熱表面?zhèn)鳠嵯禂?shù)h的計(jì)算式為：

式中，l為自然對(duì)流邊界的幾何尺度?；谏鲜龇椒ǎ捎肕atlab編寫(xiě)計(jì)算程序。

2.2 數(shù)值模擬降溫過(guò)程

在液氮熱沉溫度保持80 K恒定、環(huán)境艙內(nèi)為常壓空氣的條件下，利用上述模型計(jì)算得到的圖5所示測(cè)溫點(diǎn)從室溫開(kāi)始的降溫曲線如圖8所示，同時(shí)給出了利用實(shí)驗(yàn)裝置獲得的實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)。由圖8可知，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明了預(yù)測(cè)模型的準(zhǔn)確性，特別是降溫后期誤差僅在0.5 K以內(nèi)。

圖8 模擬的降溫過(guò)程曲線及實(shí)測(cè)溫度對(duì)比

2.3 載物臺(tái)厚度及接觸熱阻對(duì)降溫效果的影響

基于上述計(jì)算模型，在實(shí)驗(yàn)臺(tái)設(shè)計(jì)初期進(jìn)行了環(huán)境艙溫度場(chǎng)模擬分析，考察載物臺(tái)厚度以及液氮熱沉與藍(lán)寶石載物臺(tái)間不同接觸熱阻對(duì)溫降曲線與溫度分布的影響。不同厚度載物臺(tái)的溫度監(jiān)測(cè)點(diǎn)降溫曲線如圖9所示。隨著載物臺(tái)厚度減薄，樣品的初期降溫速率會(huì)有明顯提升，載物片厚度每減薄1 mm，監(jiān)測(cè)點(diǎn)降溫速率提升20 %左右，但對(duì)于樣品的極限低溫影響不大。原因是低溫下藍(lán)寶石的熱擴(kuò)散系數(shù)明顯高于空氣，隨著藍(lán)寶石厚度的減薄，一方面藍(lán)寶石法向空間范圍內(nèi)溫度梯度增大，載物臺(tái)上表面更容易受到附近熱空氣的影響，另一方面冷量傳遞到參考點(diǎn)的空間距離縮短，在兩者的共同影響下，參考點(diǎn)總體上呈現(xiàn)降溫速率增加的趨勢(shì)。

圖9 不同厚度載物臺(tái)時(shí)樣品降溫曲線

以3 mm和5 mm兩個(gè)載物臺(tái)厚度為例，環(huán)境艙溫度分布如圖10所示。由圖10可知，兩者在降溫初期（τ=5 s）水平方向上均存在明顯溫度梯度，載物臺(tái)四周與中心點(diǎn)的溫差最高可達(dá)8 K左右；將樣品放置在載物片的中心位置可在降溫初期獲得較高的降溫速率。

圖10 載物臺(tái)溫度分布

根據(jù)上述對(duì)載物臺(tái)的數(shù)值模擬結(jié)果，考慮到載物臺(tái)受力、環(huán)境艙密封性能等各方面因素，確定了藍(lán)寶石玻璃材質(zhì)載物臺(tái)的具體結(jié)構(gòu)尺寸，其半徑r為10 mm，厚度δ為5 mm。

載物臺(tái)與液氮熱沉之間的界面接觸熱阻R對(duì)于系統(tǒng)的降溫效果有很大的影響，針對(duì)不同接觸熱阻，監(jiān)測(cè)點(diǎn)的降溫曲線如圖11所示。

圖11 液氮熱沉與環(huán)境艙間不同接觸熱阻下樣品降溫曲線

接觸熱阻的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為減小接觸熱阻提供指導(dǎo)。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，將對(duì)比研究了環(huán)境艙和液氮熱沉間采用不同接觸方式（裸接或填充不同厚度銦箔）時(shí)的實(shí)際降溫效果。

3 低溫顯微冷凍臺(tái)調(diào)試

在數(shù)值模擬優(yōu)化的基礎(chǔ)上完成了載物臺(tái)、環(huán)境艙及真空系統(tǒng)的設(shè)計(jì)，試制了低溫顯微成像冷凍臺(tái)，如圖12所示。

圖12 低溫凍融和顯微成像系統(tǒng)

本文對(duì)該系統(tǒng)進(jìn)行了性能測(cè)試。首先將待測(cè)樣品放置在環(huán)境艙中的藍(lán)寶石載物臺(tái)上，通過(guò)螺絲及氟膠圈將環(huán)境艙上蓋板壓緊密封，隨后對(duì)整個(gè)真空腔體抽真空至10-3Pa量級(jí)。再向液氮熱沉內(nèi)加注液氮，此時(shí)環(huán)境艙與液氮熱沉處于分離狀態(tài)，環(huán)境艙溫度所受影響較小。通過(guò)嵌入液氮熱沉及藍(lán)寶石載物臺(tái)的熱電偶溫度計(jì)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)溫度變化并記錄數(shù)據(jù)，其過(guò)程曲線如圖13所示。

圖13 液氮熱沉加注過(guò)程的溫度曲線

液氮熱沉內(nèi)部存在0.2～0.3 MPa壓力，其對(duì)應(yīng)溫度約86 K，停止注入液氮并調(diào)節(jié)液氮出口閥門(mén)使其逐漸恢復(fù)常壓，一段時(shí)間后液氮熱沉溫度降至80 K左右（圖14的初始段）。待穩(wěn)定后，驅(qū)動(dòng)電機(jī)使環(huán)境艙向下移動(dòng)直至與液氮熱沉上表面接觸，樣品溫度迅速下降，載物臺(tái)及樣品的降溫過(guò)程如圖14中40 s之后所示。當(dāng)載物臺(tái)溫度到達(dá)極限溫度完成降溫和實(shí)驗(yàn)觀測(cè)后，抬起環(huán)境艙同時(shí)啟動(dòng)電加熱進(jìn)行復(fù)溫。

圖14 載物臺(tái)及樣品的降溫過(guò)程溫度曲線

界面接觸熱阻是影響系統(tǒng)降溫效果的決定性因素。界面接觸熱阻是由于固體表面存在粗糙度，界面間不完全接觸形成的[16-17]。特別是處在真空環(huán)境時(shí)，微觀孔隙中不存在氣體對(duì)流，熱阻相比常壓環(huán)境更大[18]。系統(tǒng)中采取了在液氮熱沉與藍(lán)寶石載物臺(tái)之間充墊銦箔來(lái)消除/減小界面接觸熱阻。圖15所示的實(shí)驗(yàn)證明，這一舉措大大改善了系統(tǒng)的降溫效果。

圖15 接觸面裸接和使用銦箔墊片時(shí)的樣品降溫曲線

采用裸接方式時(shí)其降溫速率甚至還不如對(duì)流型生物顯微鏡的水平。當(dāng)采用0.1 mm厚銦箔后，降溫速率顯著提升；當(dāng)采用更厚的0.2 mm銦箔，樣品降溫速率在0～10 s內(nèi)達(dá)到558 K/min，從室溫298 K降至150 K的平均降溫速率為388.9 K/min，樣品的極限低溫也從裸接方式的240 K降至89 K。在采用銦箔的基礎(chǔ)上，通過(guò)增大載物臺(tái)與液氮熱沉的預(yù)緊，可以進(jìn)一步減小界面接觸熱阻，達(dá)到系統(tǒng)最優(yōu)的降溫效果，其各溫區(qū)的降溫?cái)?shù)據(jù)如表2所示。

表2 系統(tǒng)各溫區(qū)降溫速率數(shù)據(jù)

4 成像情況檢驗(yàn)

利用本套低溫顯微鏡系統(tǒng)，拍攝了高降溫速率下人類生精小管細(xì)胞（直徑約100 μm）在水、冷凍保護(hù)劑（10%二甲基亞颯DMSO）中的冷凍復(fù)溫視頻，觀察到了管外水的支狀冰晶形成以及管內(nèi)細(xì)胞液的不同結(jié)晶方式[19-21]，如圖16和圖17所示。拍攝視頻分辨率為1 920×1 200，幀率180 FPS，拍攝過(guò)程中顯微鏡的放大倍率為200倍，通過(guò)氣浮減震平臺(tái)以及軟件后期處理解決了高放大倍率下圖像抖動(dòng)問(wèn)題，上述成像質(zhì)量滿足細(xì)胞及微小生物組織的低溫冷凍顯微。

圖16 生精小管在水溶液中凍結(jié)（降溫速率約為500 K/min）

圖17 生精小管在冷凍保護(hù)劑中凍結(jié)（降溫速率約為500 K/min）

5 結(jié)論

本文提出了一種用于瞬態(tài)過(guò)程研究的新型低溫生物顯微成像冷凍臺(tái)方案，進(jìn)行了傳熱過(guò)程的建模和數(shù)值計(jì)算，優(yōu)化了真空絕熱環(huán)境艙內(nèi)的傳熱設(shè)計(jì)，在此基礎(chǔ)上研制了一套高降溫速率且樣品環(huán)境氛圍可控的低溫顯微成像系統(tǒng)，研究了系統(tǒng)降溫特性和極限低溫等，分析了核心換熱區(qū)域的傳熱特性，得出如下結(jié)論：

1）載物臺(tái)與液氮熱沉之間的接觸熱阻對(duì)系統(tǒng)的降溫速率起決定性作用，優(yōu)化接觸方式后系統(tǒng)的降溫速率最高可達(dá)1 600 K/min（300～250 K）以上；

2）載物臺(tái)厚度以及樣品位置點(diǎn)的選取在降溫初期（300～200 K）對(duì)降溫速率產(chǎn)生很大影響，載物臺(tái)邊緣與中心的溫差最高可達(dá)10 K；

3）樣品極限低溫主要取決于載物臺(tái)與液氮熱沉之間的接觸熱阻以及載物臺(tái)厚度；

4）獲得了生精小管樣品凍融瞬態(tài)過(guò)程中管外支狀冰晶形成以及管內(nèi)細(xì)胞液不同結(jié)晶方式的高速影像，滿足低溫生物損傷機(jī)理研究需求。