鯉Pdcd6ip蛋白真核表達(dá)載體的構(gòu)建及抗病毒功能研究

邵 玲 張明輝 彭軍輝

(上海市水產(chǎn)研究所, 上海市水產(chǎn)技術(shù)推廣站, 上海, 200433)

鯉春病毒血癥病毒 (Spring viraemia of carp virus,SVCV)可以引起多種鯉科魚類, 如鯉(Cyprinus carpioLinnaeus)、錦鯉 (Cyprinus carpio haematopterus)和草魚 (Ctenopharyngodon idellusCuvier et Valenciennes)等發(fā)生急性、暴發(fā)性出血癥—鯉春病毒血癥 (Spring viraemia of carp, SVC)[1,2]。SVC常在春季水溫較低時(shí)暴發(fā), 死亡率可高達(dá)90%以上,被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織列為必須申報(bào)的疫病, 也是《中華人民共和國進(jìn)境動(dòng)物一、二類傳染病、寄生蟲病名錄》中的一類魚類疫病, 該病嚴(yán)重影響了漁業(yè)生產(chǎn)并造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失, 對我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展構(gòu)成了巨大威脅[3]。因此加強(qiáng)SVCV抗病毒機(jī)制的研究, 尋求有效的預(yù)防和治療方法具有重要的理論和實(shí)踐意義。

SVCV隸屬于彈狀病毒科Sprivivirus病毒屬, 病毒基因組為不分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA, 共編碼5個(gè)主要結(jié)構(gòu)蛋白, 分別為核蛋白 (N)、磷蛋白 (P)、基質(zhì)蛋白 (M)、糖蛋白 (G)和RNA聚合酶 (L)。N、P和M蛋白作為SVCV的主要結(jié)構(gòu)蛋白, 在病毒的轉(zhuǎn)錄、復(fù)制及裝配中發(fā)揮了重要作用[1,2]。前期, 我們對SVCV感染的鯉魚上皮瘤細(xì)胞EPC (Epithelioma papulosum cyprinid)進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn), 相較于未感染細(xì)胞, 感染細(xì)胞中程序性細(xì)胞死亡6互作蛋白Pdcd6ip (Programmed cell death 6-interacting protein)的表達(dá)水平顯著上調(diào)。Pdcd6ip也稱為Alix或Aip1, 由pdcd6ip基因編碼。然而, 目前魚類中pdcd6ip基因的確定編碼序列及其在SVCV感染中的功能均還未知。哺乳動(dòng)物中的研究表明,Pdcd6ip是內(nèi)吞體分選轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體Ⅲ (Endosomal sorting complexes required for transport Ⅲ, ESCRT-Ⅲ)的組成部分, 并在調(diào)控細(xì)胞程序性死亡中起到了重要作用[4]。Pdcd6ip可以結(jié)合ESCRT-Ⅲ中的CIN85、endophilins、CHMP4B和Tsg101等蛋白,還可以結(jié)合細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白ALG-2, 并參與ALG-2介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑[5,6]。Pdcd6ip在哺乳動(dòng)物病毒復(fù)制循環(huán)中的作用已有初步研究, 結(jié)果顯示其在多種分子機(jī)制中發(fā)揮了不可或缺的橋梁作用。例如, Pdcd6ip可以結(jié)合病毒的晚期結(jié)構(gòu)域, 如P(S/T)AP、YxxL和PPxY等, 進(jìn)而參與有包膜病毒如人類免疫缺陷病毒 (HIV)和馬傳染性貧血病毒(EIAV)等的出芽及水泡性口炎病毒 (VSV)復(fù)制過程中核衣殼從內(nèi)體到細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)[7]。此外, HIV-1中的研究表明, 在病毒感染宿主細(xì)胞后, 子代病毒粒子需要在宿主Pdcd6ip的幫助下才能完成其出芽和釋放過程[8—10]。登革病毒 (DENV)中的研究表明, Pdcd6ip可以與其NS3蛋白發(fā)生相互作用, 在病毒感染晚期階段及病毒釋放過程中發(fā)揮了重要作用[11]。病毒成分在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)及完整病毒的出芽為病毒正常復(fù)制所必不可少, Pdcd6ip在調(diào)節(jié)病毒感染和復(fù)制中具有重要功能。因此, 其表達(dá)與否及表達(dá)水平的高低將影響病毒的感染和復(fù)制水平。然而, Pdcd6ip在不同病毒中所起的作用不同,例如, EIAV中的研究表明, Pdcd6ip的過表達(dá)抑制了其復(fù)制[12], 而HIV-1中的研究表明, Pdcd6ip的過表達(dá)促進(jìn)了其復(fù)制[6]。目前, 魚類中Pdcd6ip的確定序列鮮有報(bào)道, 對魚類病毒如SVCV等增殖的影響也尚未揭示。

為了探討Pdcd6ip在SVCV感染中的功能, 本研究通過構(gòu)建Pdcd6ip真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染EPC細(xì)胞,檢測其過表達(dá)對病毒復(fù)制的影響。本研究將為SVCV抗病毒藥物的研發(fā)奠定科學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑及實(shí)驗(yàn)儀器

主要材料和試劑: 鯉上皮瘤細(xì)胞系EPC購于中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院, 用含10% FBS (胎牛血清)、1%雙抗 (100 μg/mL青霉素-鏈霉素)的M199培養(yǎng)基置于25℃恒溫培養(yǎng)。SVCV-265毒株由本實(shí)驗(yàn)分離和保存[13], 采用50%組織培養(yǎng)感染劑量法(TCID50)和Reed-Müench法[14]進(jìn)行病毒滴度的測定和計(jì)算。M199細(xì)胞培養(yǎng)基、0.25% Trypsin-EDTA、FBS和青霉素-鏈霉素溶液購自Gibco公司;甲基纖維素 (4000 cP)購自Sigma-Aldrich公司; 病毒RNA提取試劑盒購自Qiagen公司; cDNA合成試劑盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit購自Thermo公司; LATaq、DNA marker、T4 DNA連接酶、TB Green Premix ExTaqⅡ等均購自TaKaRa公司; pCI-neo載體購自Promega公司; 限制性內(nèi)切酶購自NEB公司; 質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒、ProBond Purification System蛋白純化試劑盒、轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體Lipofectamine 2000、Alexa flour 488標(biāo)記的羊抗兔IgG均購自Invitrogen公司; 細(xì)胞增殖/毒性檢測試劑CCK-8購自Dojindo公司。

實(shí)驗(yàn)儀器: 臺式冷凍離心機(jī) (Eppendorf)、恒溫水浴鍋及恒溫?fù)u床 (上海一恒)、-80℃立式超低溫冰箱 (Thermo)、核酸電泳儀、蛋白電泳儀及半干轉(zhuǎn)膜儀 (Bio-Rad)、凝膠成像儀(上海復(fù)日)、恒溫培養(yǎng)箱 (SANYO)、PCR儀及實(shí)時(shí)熒光定量熒光PCR儀 (Applied Biosystems)、化學(xué)發(fā)光儀 (Bio-Rad)、熒光倒置顯微鏡 (Olympus-IX73)、酶標(biāo)儀(BioTek)。

1.2 鯉pdcd6ip基因cDNA的擴(kuò)增

提取鯉組織總RNA, 并立即進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。根據(jù)NCBI中斑馬魚 (Danio rerio)pdcd6ip基因序列及鯉、鯽、黑頭軟口鰷 (Pimephales promelas)、金線鲃 (Sinocyclocheilus anshuiensisFang)等預(yù)測的pdcd6ip基因序列保守區(qū)設(shè)計(jì)引物pMD18-pdcd6ip-F和pMD18-pdcd6ip-R (表 1), PCR擴(kuò)增鯉pdcd6ip基因cDNA, 將PCR產(chǎn)物純化回收后克隆至pMD18-T載體并進(jìn)行序列測定。

表1 本研究所用引物Tab. 1 Primers used in this study

1.3 序列分析

用Bioedit 7.0、ContigExpress軟件進(jìn)行序列拼接、多重比對和氨基酸同源性分析。利用MEGA 5.0軟件進(jìn)行進(jìn)化分析, 采用鄰接法 (Neighbor-joining, NJ)基于Pdcd6ip氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.4 Pdcd6ip蛋白真核表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)pdcd6ip基因序列設(shè)計(jì)ORF區(qū)引物: pCI-pdcd6ip-F和pCI-pdcd6ip-R,以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。分別將回收的PCR片段和pCI-neo空載體在37℃用NheI和EcoR I雙酶切3h。將酶切片段和載體進(jìn)行膠回收, 回收產(chǎn)物在T4連接酶的作用下進(jìn)行連接反應(yīng), 16℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞, 挑取單克隆并通過菌液PCR進(jìn)行鑒定。陽性克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng), 提取質(zhì)粒并進(jìn)行測序驗(yàn)證, 將序列正確的重組質(zhì)粒命名為pCI-pdcd6ip。

1.5 Pdcd6ip蛋白多克隆抗體的制備

設(shè)計(jì)正向引物pRSET-pdcd6ip-F和反向引物pRSET-pdcd6ip-R, 擴(kuò)增pdcd6ip基因ORF區(qū)并將其插入pRSET-A載體中, 菌液PCR篩選陽性克隆, 并進(jìn)行測序驗(yàn)證。提取重組質(zhì)粒pRSET-pdcd6ip轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)pLysS。陽性克隆在37℃條件下, 加入1 mmol/L IPTG (異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)表達(dá), 誘導(dǎo)后不同時(shí)間收取菌體, 破碎后進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。表達(dá)蛋白進(jìn)一步利用純化試劑盒進(jìn)行純化, 純化后的蛋白免疫新西蘭白兔獲得特異性的抗血清, 抗血清進(jìn)一步純化獲得特異性抗體, 抗體效價(jià)用ELISA方法進(jìn)行測定。

1.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將EPC細(xì)胞接于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中, 第2天待形成單層細(xì)胞后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。以24孔板1孔為例: 將800 ng 質(zhì)粒加入到50 μL Opti-MEM培養(yǎng)基中; 同時(shí)將2 μL脂質(zhì)體Lipofectamine 2000加入到50 μL Opti-MEM中, 室溫靜置5min; 然后將兩者充分混勻, 室溫靜置20min; 用Opti-MEM輕輕洗細(xì)胞兩次, 將混合物加入對應(yīng)孔中, 培養(yǎng)4—6h后換成含10%FBS的M199培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后24h, 收取細(xì)胞樣品或進(jìn)行感染實(shí)驗(yàn)。對于感染實(shí)驗(yàn), 吸除細(xì)胞上清, 細(xì)胞用無血清M199輕輕洗一次, 加入MOI=0.5的SVCV病毒液, 20℃孵育1h后, 換成含2%FBS的M199培養(yǎng)基,分別收取感染后12h、24h和36h樣品進(jìn)行病毒滴度測定、RT-qPCR檢測及蛋白免疫印跡。

1.7 Pdcd6ip蛋白過表達(dá)對細(xì)胞活性的影響測定

利用細(xì)胞增殖/毒性檢測試劑CCK-8 (cell counting kit-8)檢測Pdcd6ip過表達(dá)對細(xì)胞活性影響,具體操作步驟如下: 轉(zhuǎn)染前一天, 鋪104個(gè)EPC細(xì)胞至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中, 第2天待形成單層細(xì)胞時(shí)轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pCI-pdcd6ip和空載體pCI-neo, 每組3個(gè)復(fù)孔, 重復(fù)3次; 在轉(zhuǎn)染后24h、48h和72h分別向每孔加入10 μL的CCK-8試劑, 孵育1h時(shí)后利用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度。

1.8 蛋白免疫印跡 (Western blot)

細(xì)胞用PBS洗2次, 每次3min, 加入RIPA細(xì)胞裂解液, 用槍吹打數(shù)下, 使裂解液和細(xì)胞充分接觸, 冰上孵育10min, 將裂解液轉(zhuǎn)移到1.5 mL EP管中,12000×g, 離心5min, 收集離心上清進(jìn)行SDS-PAGE,并轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。用5% PBST-BSA封閉液37℃封閉2h后加入對應(yīng)的一抗 (1∶1000稀釋), 37℃孵育2h; PBST洗3次, 每次5min; 加入辣根過氧化物酶 (HRP)標(biāo)記的二抗 (1∶5000稀釋), 37℃孵育1h;PBST洗3次, 每次5min; 使用ECL發(fā)光底物進(jìn)行化學(xué)發(fā)光。

1.9 間接免疫熒光 (IF)

細(xì)胞用PBS洗2次, 然后加入4%的多聚甲醛室溫固定30min; 吸除固定液, 用PBS洗細(xì)胞3次, 加入含0.2% Triton X-100的PBS透化15min; PBS洗3次,加入含4% BSA的封閉液37℃孵育2h; 吸除封閉液,加入用封閉液稀釋的一抗 (兔抗SVCV M蛋白抗體,本實(shí)驗(yàn)室制備[15], 以體積比1∶1000稀釋), 37℃孵育2h; PBS洗3次, 加入Alexa Fluor 488熒光標(biāo)記的驢抗兔二抗 (體積比1∶2000稀釋), 37℃孵育1h; PBS洗3次, 每次3min, 加入PBS稀釋的染核液DAPI(1∶2000)染色液, 室溫染色10min, PBS洗3次, 每次3min; 最后置于Olympus-IX73熒光倒置顯微鏡下觀察和拍照。

1.10 熒光定量PCR (RT-qPCR)

重組質(zhì)粒pCI-pdcd6ip和空載體pCI-neo轉(zhuǎn)染EPC細(xì)胞24h后, 用無血清M199洗細(xì)胞兩次, 以MOI=0.5接種SVCV, 20℃吸附1h, 換成含2%FBS的M199培養(yǎng)基; 于感染后12h、24h和36h分別收取實(shí)驗(yàn)組和對照組樣品, 提取RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA; 利用熒光定量PCR方法進(jìn)行病毒拷貝數(shù)測定[16]。在200 μL熒光PCR反應(yīng)管中依次加入10 μL TB Green Premix ExTaqII, 濃度10 μmol/L正向引物、反向引物各0.4 μL, 0.4 μL ROX reference dye II和待測樣品cDNA 2 μL, 補(bǔ)充雙蒸水至20 μL, 置于7500Fast熒光定量PCR儀中進(jìn)行反應(yīng), 反應(yīng)條件為95℃ 30s; 之后95℃ 3s、60℃ 30s、72℃ 30s 40個(gè)循環(huán), 在結(jié)束后, 立即由儀器進(jìn)行熔解曲線分析, 最后通過ABI 7500 2.0.6軟件計(jì)算擴(kuò)增產(chǎn)物Tm值[17]; 將轉(zhuǎn)染空載體pCI-neo的細(xì)胞12h M基因拷貝數(shù)設(shè)為1進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.11 空斑實(shí)驗(yàn)

將EPC細(xì)胞接于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中, 第2天形成細(xì)胞單層后用無血清的M199洗2次, 將病毒加入各孔 (500 μL每孔), 每種做3個(gè)重復(fù)。20℃吸附1h后, 吸除病毒液, 用含5%FBS和1.5%甲基纖維素的M199培養(yǎng)基輕輕覆蓋。培養(yǎng)72h后, 棄去培養(yǎng)基,細(xì)胞用4%多聚甲醛固定30min, 并用0.5%結(jié)晶紫染液室溫靜置染色30min, 吸除染液沖洗干凈, 待晾干后觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 鯉pdcd6ip基因的克隆

目前, 公共數(shù)據(jù)庫中尚無確定的鯉pdcd6ip基因序列, 僅有斑馬魚pdcd6ip基因序列和其他魚類該基因的預(yù)測序列。本研究根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中斑馬魚pdcd6ip基因序列以及鯉、鯽、金線鲃、黑頭軟口鰷等預(yù)測的pdcd6ip基因序列的保守區(qū)設(shè)計(jì)了pdcd6ip基因特異性引物, 以鯉組織cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 擴(kuò)增出了與目的條帶大小一致的約2610 bp的特異性基因片段。將該基因片段進(jìn)行克隆、測序和序列比對, 結(jié)果顯示該片段確屬于鯉pdcd6ip基因。進(jìn)一步序列比對顯示鯉pdcd6ip基因與預(yù)測的黑頭軟口鰷基因相似性最高, 為99.05%,其ORF區(qū)編碼869個(gè)氨基酸。蛋白質(zhì)同源分析(圖 1)顯示, Pdcd6ip在魚類和哺乳動(dòng)物中各自聚為一支,但相對保守, 具有較高的同源性。鯉Pdcd6ip與人和小鼠Pdcd6ip氨基酸序列相似性分別為71.07%和69.82%。

圖1 基于Pdcd6ip氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 1 The phylogenetic tree based on Pdcd6ip amino acid sequences

2.2 真核表達(dá)載體pCI-pdcd6ip的構(gòu)建

將pdcd6ip基因ORF區(qū)克隆至真核表達(dá)載體pCI-neo, 構(gòu)建pCI-pdcd6ip重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒進(jìn)行NheI和EcoR I雙酶切鑒定, 凝膠電泳結(jié)果顯示,重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后獲得約5460和2610 bp的兩條特異性條帶, 與預(yù)期大小相符。進(jìn)一步, 雙向測序結(jié)果表明構(gòu)建的重組質(zhì)粒序列正確無誤。

2.3 Pdcd6ip蛋白多克隆抗體的制備及其過表達(dá)的western blot驗(yàn)證

目前, 針對魚類Pdcd6ip蛋白尚無特異性的商業(yè)化抗體, 因此, 本研究首先通過PCR擴(kuò)增了pdcd6ip基因的ORF區(qū), 并將其克隆至pRSET-A原核表達(dá)載體中, 構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pRSET-pdcd6ip, 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)pLysS感受態(tài)細(xì)胞, 并在37℃, 1 mmol/L IPTG條件下進(jìn)行Pdcd6ip蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)(圖 2a), 純化蛋白并免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物, 獲得了Pdcd6ip蛋白的多克隆抗體。如圖 2b所示, western blot檢測顯示在分子量約95 kD處出現(xiàn)特異性條帶, 與pdcd6ip基因編碼蛋白預(yù)測分子量大小一致, 說明制備的抗體能特異性的識別Pdcd6ip蛋白。接下來, 利用western blot檢測pCI-pdcd6ip質(zhì)粒轉(zhuǎn)染EPC細(xì)胞后24h Pdcd6ip蛋白的表達(dá)情況(圖 2c), EPC細(xì)胞中存在較低水平的Pdcd6ip蛋白本底表達(dá), 與轉(zhuǎn)染空載體pCI-neo的對照組相比, pCI-pdcd6ip轉(zhuǎn)染細(xì)胞中Pdcd6ip表達(dá)水平顯著上調(diào), 表明該質(zhì)粒能夠在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中正確表達(dá)。

圖2 Pdcd6ip蛋白過表達(dá)的western blot驗(yàn)證Fig. 2 Verification of the expression of Pdcd6ip in transfected EPC cells

2.4 Pdcd6ip蛋白過表達(dá)對細(xì)胞活性影響的測定

已有的研究報(bào)道表明, Pdcd6ip蛋白在調(diào)控細(xì)胞程序化死亡中起重要作用[4]。為明確其過表達(dá)對細(xì)胞活性的影響, 本研究首先利用RT-qPCR方法測定了過表達(dá)載體pCI-pdcd6ip在EPC細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率, 結(jié)果表明, 轉(zhuǎn)染后24h, EPC細(xì)胞中pdcd6ipmRNA相對表達(dá)水平提高了約326倍 (圖 3a)。此外,在轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間, 我們還利用CCK-8試劑測定了Pdcd6ip過表達(dá)對EPC細(xì)胞活性的影響。結(jié)果顯示, 與對照組相比, 在轉(zhuǎn)染后24h、48h和72h Pdcd6ip過表達(dá)組細(xì)胞活性均與對照組無顯著差異(圖 3b)。

圖3 轉(zhuǎn)染EPC細(xì)胞中pdcd6ip mRNA相對表達(dá)水平及Pdcd6ip過表達(dá)對EPC細(xì)胞活性影響的測定Fig. 3 The mRNA expression of pdcd6ip in EPC transfected cells and the effect of its overexpression on the viability of EPC cells

2.5 Pdcd6ip過表達(dá)對SVCV增殖的影響

為進(jìn)一步研究Pdcd6ip蛋白對SVCV感染的影響, 我們利用本實(shí)驗(yàn)室已制備的針對SVCV M蛋白的抗體[15], 對轉(zhuǎn)染后感染EPC細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光檢測。結(jié)果表明, 與對照組相比, Pdcd6ip過表達(dá)后SVCV感染細(xì)胞 (綠色)的數(shù)量顯著減少 (圖 4a)。我們對轉(zhuǎn)染后感染的細(xì)胞進(jìn)行western blot檢測(圖 4b),pCI-pdcd6ip轉(zhuǎn)染細(xì)胞中Pdcd6ip蛋白表達(dá)水平升高,但M蛋白的表達(dá)水平明顯降低。我們還利用RT-qPCR檢測了M基因拷貝數(shù), Pdcd6ip過表達(dá)后, M基因的拷貝數(shù)下降約70% (圖 4c)。此外, 我們還用空斑實(shí)驗(yàn)檢測了轉(zhuǎn)染后SVCV感染12h、24h和36h病毒增殖滴度, 結(jié)果同樣表明, Pdcd6ip的過表達(dá)對病毒滴度有明顯抑制作用 (圖 4d)。綜合以上結(jié)果表明, Pdcd6ip過表達(dá)顯著抑制了SVCV的增殖。

圖4 Pdcd6ip過表達(dá)抑制SVCV的增殖Fig. 4 Pdcd6ip overexpression inhibited SVCV infection

3 討論

SVCV宿主范圍十分廣泛, 可以感染多種淡水魚類并引起暴發(fā)性鯉春病毒血癥, 是淡水魚養(yǎng)殖場重點(diǎn)防控的疫病病原。自首次分離報(bào)道以來[18], 其流行范圍不斷擴(kuò)展, 目前全世界幾十個(gè)國家和地區(qū)都有SVCV的分離報(bào)道[19]。自1998年英國從我國進(jìn)口的觀賞魚中檢測到SVCV以來, 其在我國多個(gè)省市均有檢出[20—23]。根據(jù)農(nóng)業(yè)部《2019年我國水生動(dòng)物重要疫病狀況分析》的數(shù)據(jù), 我國2004、2016和2017—2018年都發(fā)生過SVC疫情[24], 造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。然而, 目前, 針對SVC尚無有效的疫苗或藥物, 唯一有效的措施即開展病原的密切監(jiān)測,并對陽性樣品進(jìn)行隔離或撲殺。因此, 對宿主抵抗SVCV感染機(jī)制的研究并開發(fā)出特異的抗病毒藥物對于SVCV的防治具有十分重要的意義。

Pdcd6ip蛋白是細(xì)胞內(nèi)多泡體轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的重要因子, 在細(xì)胞膜受體內(nèi)吞和再循環(huán)中起到了關(guān)鍵作用[25]。然而, 迄今為止, 尚未見其在水生病毒感染中功能的研究報(bào)道。我們首次克隆了魚類pdcd6ip基因, 制備了其特異性的多克隆抗體, 并進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Pdcd6ip過表達(dá)能顯著抑制SVCV的復(fù)制, 但其作用機(jī)制還尚不明確。利用生物信息學(xué)手段, 我們預(yù)測發(fā)現(xiàn)SVCV M蛋白含有可以與Pdcd6ip直接互作的PPxY結(jié)構(gòu)域, 推測Pdcd6ip 也可以與M蛋白直接互作, 進(jìn)而影響病毒的出芽過程。多種有包膜病毒中的研究表明病毒粒子的裝配及釋放需要特定ESCRT體系的參與, ESCRT體系包括5種復(fù)合體(ESCRT-0、 -Ⅰ、 -Ⅱ、 -Ⅲ 和 Vps4 復(fù)合體)及多種附屬蛋白。病毒蛋白通過晚期結(jié)構(gòu)域PT/SAP、PPXY或LYPXnL與Pdcd6ip直接結(jié)合, 招募ESCRT蛋白, 進(jìn)而轉(zhuǎn)運(yùn)入多囊泡體(Multivesicular bodies, MVB)。然而, 病毒復(fù)制過程本身并不需要Pdcd6ip的參與[11]。我們研究發(fā)現(xiàn)Pdcd6ip抑制SVCV的復(fù)制, 這與多數(shù)有包膜病毒中研究發(fā)現(xiàn)并不一致, 提示Pdcd6ip在SVCV復(fù)制循環(huán)中的作用機(jī)制與HIV、DENV等病毒中的機(jī)制并不相同。最新研究表明Pdcd6ip為多功能蛋白, 除可以與ESCRT-Ⅰ和ESCRT-Ⅲ成員互作參與病毒出芽及MVB分選外, 還參與了一系列重要細(xì)胞過程, 包括MVB的分裂和融合、細(xì)胞內(nèi)吞、細(xì)胞表面信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)、內(nèi)吞復(fù)合體的重分布、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和細(xì)胞黏附、細(xì)胞凋亡和JNK信號通路的調(diào)控等[9]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)SVCV復(fù)制受到細(xì)胞骨架和酪氨酸激酶的調(diào)控[26], 而Pdcd6ip能夠顯著影響這些生物過程[9]。因此, 我們推測Pdcd6ip可能通過影響細(xì)胞骨架的時(shí)空分布或酪氨酸激酶的活性從而抑制SVCV的復(fù)制。此前, EIAV中同樣觀察到Pdcd6ip的過表達(dá)抑制其復(fù)制, 且EIAV晚期蛋白可以與Pdcd6ip及AP-2(早期內(nèi)吞體關(guān)鍵蛋白)互作[12]。因此, 不排除Pdcd6ip過表達(dá)競爭性抑制了SVCV晚期蛋白與其他關(guān)鍵宿主蛋白的互作, 從而抑制了病毒的復(fù)制。

目前, 通過養(yǎng)殖魚類機(jī)體自身來防控病毒病的方法主要有以下兩種方式: 針對性的疫苗和生物制劑。水產(chǎn)疫苗是防治水生動(dòng)物病毒性疾病比較有效的方法, 但目前僅開發(fā)了少數(shù)魚類病毒性疾病的疫苗。我國魚用疫苗研究更加相對滯后, 僅2011年草魚出血病活疫苗 [獸藥生字(2011)190986021]等投入了生產(chǎn)和使用。目前尚無商業(yè)化SVCV疫苗,且SVCV基因變異較為迅速、毒株間序列差異較大, 大大限制了SVCV疫苗在生產(chǎn)實(shí)踐中的應(yīng)用前景。多肽類生物制劑具有較高的特異性, 且容易降解無殘留、不會(huì)產(chǎn)生耐藥性, 在綠色農(nóng)業(yè)發(fā)展中具有良好的技術(shù)優(yōu)勢, 但已有的產(chǎn)品比較局限, 實(shí)際水產(chǎn)生產(chǎn)中應(yīng)用還較少。我們發(fā)現(xiàn)Pdcd6ip并不顯著影響細(xì)胞的增殖活性, 提示其可以作為功能性生物制劑開發(fā)的作用靶點(diǎn)。當(dāng)然, 相關(guān)制品的開發(fā)有待進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

總之, Pdcd6ip在多種病毒的感染復(fù)制過程中發(fā)揮了重要的作用, 本研究構(gòu)建了鯉Pdcd6ip真核表達(dá)載體并在EPC細(xì)胞中獲得了高水平表達(dá), 并且發(fā)現(xiàn)其過表達(dá)對SVCV的感染具有顯著的抑制作用, 同時(shí)不影響細(xì)胞的正?；钚浴１狙芯拷Y(jié)果為深入研究鯉Pdcd6ip蛋白的抗病毒機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù), 并為水生病毒性疾病的預(yù)防和治療提供了新的研究思路。