大黃魚ATG10基因的分子特征及其在抗病毒免疫中的功能

魏祖運 盧利霞 任秋磊 何天良 陳新華

(福建農(nóng)林大學海洋研究院, 福建省海洋生物技術重點實驗室, 福州 350002)

自噬(Autophagy)是一種依賴溶酶體對細胞內(nèi)容物進行降解的過程, 在細胞分化、發(fā)育和免疫等多種生理過程中具有重要作用[1—3]。研究表明, 自噬作為細胞適應環(huán)境壓力的自我保護機制, 參與機體的抗病毒先天免疫和特異性免疫反應[4]。自噬不僅可以直接清除病毒, 還參與調(diào)控天然和適應性抗病毒免疫應答的多個過程, 包括天然免疫細胞的分化發(fā)育、天然免疫信號通路的活化、淋巴細胞的穩(wěn)態(tài)維持、抗原的加工提呈及抗體應答等[4,5]。自噬相關基因(Autophagy-related genes,ATG)在自噬過程中發(fā)揮重要作用[6], 參與自噬的起始、自噬體膜的延伸、自噬體的成熟與融合及自噬體降解的全過程。目前在酵母(Saccharomyces cerevisiae)中已鑒定了30多個ATG基因, 其中15個(ATG1-10、ATG12-14、ATG16和ATG18)在哺乳動物中高度保守[7,8]。

ATG10是招募其他自噬相關因子進行復雜共軛的重要接頭分子, 在自噬體膜延伸的過程中起關鍵作用[9]。作為E2樣泛素結合酶(E2-like ubiquitin conjugating enzyme), ATG10在E1樣泛素活性酶(E1-like ubiquitin activating enzyme)ATG7的協(xié)助下, 招募ATG12形成ATG12-ATG10硫酯中間體, 進一步與ATG5結合形成ATG12-ATG5復合體[10]。在自噬發(fā)生時, ATG12-ATG5復合體與ATG16L1形成共軛蛋白復合體, 并定位于自噬小體形成過程中的隔離膜上, 具有E3樣泛素連接酶(E3-like ubiquitinprotein ligase)活性, 參與微管相關蛋白LC3的脂化,促進自噬體的形成[11—13]。研究表明, ATG10在動物抗病毒免疫過程中也具有重要作用[14]。在人肝癌細胞系Huh 7.5中過表達ATG10可促進自噬體與溶酶體的結合, 從而抑制丙肝病毒(Hepatitis C virus,HCV)的復制[15]。在太平洋牡蠣(Crassostrea gigas)中, 牡蠣外套膜中的CgATG10的轉錄水平在受到病毒類似物poly (I:C)刺激后顯著上調(diào), 表明CgATG10可能參與抗病毒免疫反應[9]。然而, 目前有關魚類ATG10的研究還未見報道, 其在魚類抗病毒免疫中的功能尚不清楚。

大黃魚(Larimichthys crocea)在我國沿海地區(qū)養(yǎng)殖規(guī)模大, 經(jīng)濟價值高, 但近年來病害頻發(fā), 造成了重大的經(jīng)濟損失[16,17]。由于自噬在動物抗病毒免疫中發(fā)揮重要作用, 因此解析大黃魚自噬的分子基礎及機制, 對于認識自噬在大黃魚抗病毒免疫中的功能, 及大黃魚病毒病的防治具有重要意義。為此, 我們研究了大黃魚ATG10基因(LcATG10)在正常大黃魚組織和免疫相關細胞中的表達水平及該基因對魚類病毒復制的影響, 這些結果將為闡明ATG10在魚類抗病毒免疫中的功能及其機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用大黃魚均購自寧德富發(fā)水產(chǎn)有限公司, 將大黃魚在流動的海水中適應性養(yǎng)殖10d, 水溫為25℃。在暫養(yǎng)結束后, 將正常狀態(tài)大黃魚分為實驗組和對照組, 每組30尾。實驗組以2.5 μg/g大黃魚的劑量腹腔注射poly (I:C), 對照組注射等體積的無菌磷酸鹽緩沖液(PBS, pH=7.4), 分別于注射后3h、6h、12h和24h采集大黃魚頭腎和脾臟樣品, 每個時間點各采集3尾。采集正常大黃魚的心臟、肝臟、脾臟、頭腎、胃、腸、血液、鰓、腦、皮膚和肌肉組織, 放入液氮中速凍, 再轉入-80℃超低溫冰箱保存。

1.2 大黃魚免疫相關細胞分離與培養(yǎng)

取正常大黃魚頭腎組織, 放在70 μm細胞濾網(wǎng)上輕輕研磨, 制成細胞懸液, 將細胞懸液添加到新制備的34%和51% Percoll溶液上, 4℃, 650×g離心30min。離心后, 吸取中間層的細胞, 使用L-15培養(yǎng)基洗滌3次, 再接種到6孔板中, 每孔2.0×106個細胞,28℃培養(yǎng)2h, 分別收集懸浮的原代淋巴細胞和貼壁的原代巨噬細胞。將研磨后的細胞懸液用移液槍加入到51%Percoll上, 4℃, 650×g離心30min, 收集離心管底部的原代粒細胞。

大黃魚頭腎細胞系(LYCK), 是本實驗室建立并長期保存的細胞系[18], 使用L-15培養(yǎng)基(15% FBS)進行培養(yǎng), 培養(yǎng)溫度為28℃。

1.3 RNA提取和cDNA合成

采用Eastep?Super Total RNA Extraction Kit(Promega)分別提取大黃魚各組織和免疫相關細胞的總RNA, 用Eastep?RT Master Mix Kit(Promega)合成cDNA, 具體方法參考試劑盒的說明書進行。

1.4 LcATG10基因克隆與序列分析

從NCBI上查找出大黃魚ATG10基因序列(Gen-Bank登錄號: XM_019277201.2), 設計特異引物LcATG10-F和LcATG10-R(表 1), 以大黃魚脾臟的cDNA為模板, PCR擴增ATG10基因的開放閱讀框(Open reading frame, ORF)全長序列, 并測序驗證。蛋白質(zhì)結構域采用SMART軟件進行預測, 其他物種ATG10序列來自GenBank數(shù)據(jù)庫, 通過DNAMAN進行序列比對; 使用MEGA7.0 軟件, 采用最大似然法構建進化樹。

1.5 LcATG10在大黃魚組織和免疫相關細胞中的表達分析

將采集的3尾大黃魚的組織進行RNA提取, 利用特異性引物RT-LcATG10-F和RT-LcATG10-R(表 1)進行熒光定量PCR反應, 檢測LcATG10在正常大黃魚各組織中的表達水平。

表1 引物序列Tab. 1 Primers information

分別收集4種大黃魚免疫相關細胞, 用細胞計數(shù)儀(美國ORFLO公司)計數(shù)2.0 ×106個細胞進行總RNA提取和cDNA合成, 采用上述方法檢測LcATG10在正常大黃魚4種免疫相關細胞中的表達水平。

熒光定量PCR反應體系如下: 2×SYBR GreenⅠ 10 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各0.1 μL, cDNA模板0.2 μL, 無菌水9.6 μL。反應條件: 95℃預變性2min, 95℃變性15s, 57℃退火20s, 72℃延伸20s, 共40個循環(huán)。LcATG10的相對表達水平采用2-ΔΔCt方法計算, 并用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計學分析,P＜0.05表示差異顯著, 用“*”表示,P＜0.01表示差異極顯著, 用“**”表示。

1.6 poly (I:C)刺激后LcATG10在大黃魚免疫組織和免疫相關細胞中的表達分析

將采集的大黃魚頭腎和脾臟組織分別進行總RNA提取和cDNA合成, 采用熒光定量PCR檢測poly (I:C)刺激的大黃魚各組織中LcATG10基因相對于對照組大黃魚各組織的表達變化。熒光定量PCR和數(shù)據(jù)分析方法如1.5。

將大黃魚LYCK細胞和原代粒細胞接種于6孔板中, 每種細胞各接種6個孔(實驗組和對照組各3孔), 每孔2.0 ×106個細胞, 用L-15培養(yǎng)基于28℃進行培養(yǎng)。LYCK細胞培養(yǎng)12h后使用終濃度為50 μg/mL的poly (I:C)刺激, 原代粒細胞接種后立即進行poly (I:C)刺激, 同時用無菌PBS溶液處理的細胞作為對照。收集細胞后提取RNA并反轉錄為cDNA。以大黃魚β-actin作為內(nèi)參基因進行熒光定量PCR反應, 檢測poly (I:C)刺激的LYCK和原代粒細胞中LcATG10基因相對于對照組細胞的表達變化。熒光定量PCR和數(shù)據(jù)分析方法如1.5。

1.7 免疫印跡

選擇生長狀態(tài)良好的鯉上皮瘤細胞系(EPC)接種于6孔板中, 每孔約1×106個細胞, 加入2 mL含10% FBS的L-15培養(yǎng)基, 28℃培養(yǎng)12h。利用轉染試劑FuGENE?HD(Promega)將2 μg pcDNA3.1-LcATG10重組質(zhì)粒轉入EPC細胞, 以空載體pcDNA3.1作為對照。轉染48h后, 加入裂解液使細胞裂解完全。離心取上清, SDS-PAGE電泳后轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜(Millipore)上。取出膜放入洗膜盒中, 加入5 mL TBST緩沖液[5%(w/v)脫脂奶粉], 放在搖床搖動1h, 然后與鼠抗人c-myc單克隆抗體(Thermo Fisher, 1∶2000)室溫孵育1h, TBST洗滌3次,然后與辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG(H+L)多克隆抗體(Thermo Fisher, 1∶4000)室溫孵育1h, 再用TBST 洗滌3次, 每次5min, 最后用凝膠成像儀檢測結果。

1.8 LcATG10抗病毒實驗

借助鯉EPC細胞和鯉春病毒血癥病毒(SVCV)感染模型分析LcATG10在病毒感染過程中的功能。生長狀態(tài)良好的EPC細胞用胰酶消化下來, 加入L-15培養(yǎng)基并離心, 計數(shù)后接種于6孔板中, 每孔約1×106個細胞, 加入2 mL含10% FBS的L-15培養(yǎng)基, 放入28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12h。將2 μg pcDNA3.1-LcATG10重組質(zhì)粒轉入EPC細胞作為實驗組, 以空載體pcDNA3.1作為對照組。在轉染24h后, 使用感染復數(shù)(Multiplicity of infection, MOI)為1.4的SVCV感染實驗組和對照組EPC細胞。在感染24h和48h后, 使用顯微鏡觀察細胞病變程度并拍照,同時對感染48h的細胞用結晶紫染料進行染色觀察。分別收集感染48h的細胞培養(yǎng)上清和細胞。培養(yǎng)上清用于測定病毒滴度, 收集的細胞提取總RNA,并合成cDNA, 以大黃魚β-actin作為內(nèi)參基因, 采用熒光定量PCR檢測病毒基因SVCV-G、SVCV-M和SVCV-P的相對表達水平。病毒基因SVCV-G、SVCV-M和SVCV-P的熒光定量PCR引物見表 1, 熒光定量PCR和數(shù)據(jù)分析方法如1.5。

2 結果

2.1 大黃魚LcATG10分子特征

克隆的LcATG10基因ORF長747個核苷酸(Gen-Bank登錄號: XP_027143515.1), 該蛋白由248個氨基酸殘基組成, 序列分析發(fā)現(xiàn),LcATG10與哺乳動物ATG10蛋白序列特征相似, 不具有信號肽和跨膜區(qū), 含有1個保守的Autophagy_act_C結構域(124—191位氨基酸), 該結構域含有與ATG12和ATG5結合的關鍵氨基酸位點, 包括亮氨酸(Leu135、Leu147、Leu149、Leu164、Leu180)、脯氨酸(Pro178、Pro189)、色氨酸(Trp153)和半胱氨酸(Cys190)。氨基酸序列同源性比對顯示,LcATG10與金頭鯛(Sparus aurata)ATG10的序列一致性最高(76.3%)其次為石斑魚(Epinephelus lanceolatus)(74.2%)。系統(tǒng)進化分析顯示, 所有物種的ATG10與釀酒酵母ATG8分為兩大支, 其中LcATG10與其他魚類的ATG10形成1個分支, 哺乳類、兩棲類和禽類的ATG10聚為另外一支(圖 1)。

2.2 LcATG10在正常大黃魚不同組織或器官及免疫相關細胞中表達分析

采用熒光定量PCR技術檢測了正常大黃魚心臟、肝臟、脾臟、頭腎、胃、腸、血液、鰓、腦、皮膚和肌肉組織中LcATG10的表達水平。結果顯示,LcATG10在所有檢測的組織中呈組成型表達, 表達量最高的為腸道, 在頭腎中最低(圖 2A)。

此外, 我們還檢測了LcATG10在大黃魚原代頭腎淋巴細胞、巨噬細胞和粒細胞及頭腎細胞系LYCK中的相對表達水平, 結果表明LcATG10能夠在這些細胞中表達, 表達量最高的是原代粒細胞, 最低的是原代巨噬細胞(圖 2B)。

2.3 poly(I:C)刺激對LcATG10表達的影響

為了進一步了解LcATG10是否參與大黃魚抗病毒免疫反應, 使用病毒類似物poly (I:C)刺激大黃魚, 檢測大黃魚頭腎和脾臟中LcATG10的轉錄水平變化。結果顯示, poly (I:C)刺激后, 大黃魚頭腎中LcATG10的轉錄水平從3h開始上調(diào), 在12h達到最高值, 是對照組的5.9倍, 而在24h表達量顯著下降(圖 3A); 在脾臟中,LcATG10的轉錄水平在刺激后3h開始上調(diào), 6h 達到峰值, 為對照組的9.4倍, 隨后下調(diào)(圖 3B)。

此外, 我們還分析了poly (I:C)刺激大黃魚頭腎細胞系LYCK和原代粒細胞中LcATG10的轉錄變化。結果顯示, 在poly (I:C)刺激后,LcATG10的轉錄水平在LYCK細胞中先上升, 在12h達到最大值,是對照組的3.6倍, 隨后有所下降(圖 3C); 在原代粒細胞中LcATG10的表達水平快速上調(diào), 但在24h和48h顯著下調(diào)(圖 3D)。

圖3 大黃魚組織和免疫相關細胞受poly(Ⅰ∶C)刺激后LcATG10表達變化Fig. 3 Expression levels of LcATG10 in tissues and immunerelated cells of large yellow croaker after poly (I∶C) stimulation

2.4 LcATG10保護細胞免受病毒感染

為了確定LcATG10在抗病毒免疫中的功能, 利用EPC細胞過表達LcATG10, 再分析LcATG10過表達對SVCV復制的影響。結果顯示LcATG10在EPC細胞中得到了表達(圖 4A), 在SVCV感染24h和48h后, 過表達LcATG10的EPC細胞中CPEs明顯少于轉染空載體的EPC細胞(圖 4B和4C)。在感染48h后, 過表達LcATG10的EPC細胞上清中病毒滴度為103.55TCID50/mL, 顯著低于對照組的病毒滴度(109.36TCID50/mL; 圖 4D)。此外, 在過表達LcATG10的EPC細胞中, 感染48h后SVCV標志基因SVCV-G、SVCV-M和SVCV-P的表達量顯著低于對照組, 分別是對照組的0.022、0.015和0.022倍(圖 4E)。這些數(shù)據(jù)表明LcATG10具有抑制SVCV復制的功能。

圖4 LcATG10 過表達對病毒復制的影響Fig. 4 Effects of LcATG10 overexpression on virus replication

3 討論

ATG10作為自噬小體形成的核心因子之一, 介導了ATG12-ATG5復合體形成的最后一步反應[19,20]。目前,ATG10基因在酵母[12]、人(Homo sapiens)[21]、小鼠(Mus musculus)[22]、牡蠣(Crassostrea gigas)[9]、擬南芥(Arabidopsis thaliana)[11]和小麥(Triticum aestivum)[23]等真核生物中得到了鑒定及功能研究,但在魚類中的研究尚未見報道。因此, 解析大黃魚ATG10的分子特征及其在抗病毒免疫中功能, 有助于闡明魚類ATG10在抗病毒免疫中的作用機制。

在系統(tǒng)進化樹中,LcATG10和其他物種的ATG10與釀酒酵母ATG8分為兩大支, 其中LcATG10與石斑魚和金頭鯛ATG10聚在一起, 處于硬骨魚類分支中, 表明本研究獲得的LcATG10基因確為ATG10的同源基因。大黃魚ATG10蛋白含有一個Autophagy_act_c結構域, 該結構域是ATG10的一個重要功能域, 包含多個高度保守的氨基酸位點。在太平洋牡蠣中亮氨酸(Leu107和Leu159)、脯氨酸(Pro105和Pro161)、色氨酸(Trp125和Trp141)和半胱氨酸(Cys162)被認為是參與ATG12-ATG5結合的關鍵位點[19], 而大黃魚Autophagy_act_c結構域同樣包含這些保守氨基酸位點。此外, 在這些保守氨基酸殘基中半胱氨酸Cys是ATG10和ATG12之間硫酯鍵的結構基礎[10], 在人和小鼠ATG10中半胱氨酸Cys133殘基周圍序列高度保守, 被認為是活性位點[12], 同樣在大黃魚ATG10中半胱氨酸Cys190殘基周圍序列也高度保守, 提示大黃魚ATG10蛋白可能也參與ATG12-ATG5結合過程。

為了研究LcATG10的功能特征, 本研究首先對LcATG10基因在大黃魚組織中的表達譜進行分析。據(jù)報道, 目前對動物ATG10基因組織表達譜的分析較少, 僅在太平洋牡蠣中有類似的報道。在本研究中,LcATG10在所有被檢測的大黃魚組織中均有表達, 這種組成型表達模式不僅與太平洋牡蠣中CgATG10的表達模式相似[9], 而且與黃顙魚ATG4和LC3(酵母ATG8同源基因)、太平洋鱈ATG5、草魚Beclin1(酵母ATG6同源基因)等魚類自噬相關基因組織表達譜類似[24—26], 推測自噬可能在大黃魚多種生理功能中發(fā)揮作用。此外,LcATG10基因在LYCK細胞以及原代巨噬細胞、淋巴細胞和粒細胞中均有表達, 表明LcATG10可能參與大黃魚免疫功能。

研究表明, 病原感染能夠誘導宿主ATG10基因的上調(diào)表達, 進而激活細胞自噬發(fā)揮抗病原感染的功能, 其中ATG10在自噬小體的形成中具有重要作用, 在受到病毒感染時可以促進自噬小體的形成,進而抑制病毒的復制[9,14]。在人肝癌細胞系Huh7.5中, 過表達ATG10可以抑制人丙型肝炎病毒HCV的復制[15]。在本研究中, 病毒類似物poly (I:C)刺激后大黃魚脾臟、頭腎組織及LYCK細胞和原代粒細胞中LcATG10基因的轉錄水平均顯著上升, 與poly(I:C)刺激后太平洋牡蠣中ATG10的表達上調(diào)相一致, 表明LcATG10可能參與抗病毒免疫反應。進一步在EPC細胞中過表達LcATG10可顯著減少SVCV感染引起的CPEs現(xiàn)象, 同時還顯著降低了感染細胞培養(yǎng)上清中SVCV滴度和SVCV標志基因的轉錄水平,表明LcATG10具有抑制SVCV病毒在EPC細胞中復制的功能。Zhao等[15]在人肝癌細胞系HepG2中發(fā)現(xiàn), 過表達ATG10可以促進自噬小體的形成, 并導致HCV亞基因組復制子的降解。因此, 我們推測LcATG10可能通過促進自噬小體形成來實現(xiàn)對病毒的抑制作用, 但這一推測還有待于進一步的證實。

綜上所述, 本研究從大黃魚中鑒定了一個具有保守Autophagy_act_c結構域的ATG10基因(LcATG10)。檢測了LcATG10在大黃魚組織和免疫相關細胞中的表達水平, 結果顯示其均呈組成型表達。poly (I:C)刺激后LcATG10表達在大黃魚免疫相關組織和免疫細胞中均顯著上調(diào)。在EPC細胞中過表達LcATG10可抑制SVCV的復制, 提示LcATG10可能通過促進自噬小體的形成參與其抗病毒免疫反應, 然而具體機制有待闡明。這些研究結果將為進一步研究自噬在大黃魚抗病毒免疫中的分子機制奠定了基礎。