發(fā)酵豆粕替代魚(yú)粉對(duì)大口黑鱸幼魚(yú)生長(zhǎng)、脂質(zhì)代謝、血清非特異性免疫及腸道菌群的影響

黃 河 田鑫鑫 黃旭雄, 陳乃松, 鐘國(guó)防,

(1. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心, 上海 201306; 2. 上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部魚(yú)類(lèi)營(yíng)養(yǎng)與環(huán)境生態(tài)研究中心, 上海 201306; 3. 上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 201306)

大口黑鱸(Micropterus salmoides), 俗稱(chēng)加州鱸,屬鱸形目(Perciformes)、太陽(yáng)魚(yú)科(Cehtrachidae),為淡水肉食性魚(yú)類(lèi), 原產(chǎn)于北美洲。20世紀(jì)80年代人工繁殖成功后引入我國(guó)廣東省, 經(jīng)過(guò)多年養(yǎng)殖發(fā)展, 目前已經(jīng)成為我國(guó)淡水養(yǎng)殖的重要品種之一。但國(guó)內(nèi)養(yǎng)殖加州鱸主要是以投喂冰鮮魚(yú)與配合飼料相結(jié)合的方式為主, 這種方式不僅容易污染水環(huán)境, 而且還容易暴發(fā)疾病, 故全程使用配合飼料是大口黑鱸產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的必然趨勢(shì)。然而, 全球魚(yú)粉缺乏, 其資源已經(jīng)無(wú)法滿足現(xiàn)代水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)持續(xù)增長(zhǎng)的需要[1], 對(duì)大口黑鱸等高魚(yú)粉飼料的影響最為顯著。因此, 尋求魚(yú)粉替代物已然成為當(dāng)今水產(chǎn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究的熱點(diǎn)問(wèn)題[1,2]。

豆粕的蛋白質(zhì)含量較高, 供應(yīng)穩(wěn)定且低廉[3], 被認(rèn)為是較好的魚(yú)粉替代物。然而, 由于它含有許多抗?fàn)I養(yǎng)因子, 包括蛋白酶抑制劑、凝集素、植酸、皂角苷、植物雌激素、抗維生素和致敏原[4,5], 在一定程度上會(huì)對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收產(chǎn)生抑制作用[6,7]。此外, 研究表明, 豆粕替代魚(yú)粉會(huì)誘導(dǎo)魚(yú)類(lèi)的腸道微生物群失調(diào)[8], 過(guò)度替代還會(huì)誘發(fā)魚(yú)的腸炎、氧化應(yīng)激和免疫功能障礙[9]等不良反應(yīng)。而豆粕經(jīng)微生物發(fā)酵后可以減少大多數(shù)抗?fàn)I養(yǎng)因子, 降解大分子蛋白為小肽和水溶性化合物, 從而提高其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值并增強(qiáng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化率[10,11]。同時(shí)也可以為動(dòng)物提供益生菌、益生元[12], 且能增加具備抗氧化性能的游離氨基酸含量, 如組氨酸、賴氨酸、纈氨酸和絲氨酸[13], 及酚類(lèi)化合物的濃度[14]。

菌種及發(fā)酵工藝是影響發(fā)酵豆粕質(zhì)量的關(guān)鍵因素, 不同菌種或發(fā)酵工藝對(duì)豆粕營(yíng)養(yǎng)成分的改善作用不同[15]。楊慧等[16]研究表明, 枯草芽孢桿菌在固態(tài)發(fā)酵時(shí)降解豆粕抗原蛋白和降低豆粕抗原性的效果優(yōu)于植物乳桿菌、干酪乳桿菌、地衣芽孢桿菌和米曲霉。而葉耀輝等[17]分別以芽孢菌類(lèi)、酵母菌類(lèi)和乳酸菌類(lèi)對(duì)豆粕進(jìn)行不同類(lèi)型的發(fā)酵,結(jié)果表明, 接種芽孢類(lèi)微生物的發(fā)酵豆粕小分子蛋白質(zhì)含量最高, 發(fā)酵程度最好。本試驗(yàn)所用的發(fā)酵豆粕是以枯草芽孢桿菌為菌種, 將豆粕在有氧條件下充分發(fā)酵后的產(chǎn)品, 對(duì)大分子蛋白的去除率高于常見(jiàn)的乳酸菌厭氧發(fā)酵豆粕, 且保留了大量有益的芽孢桿菌[18], 其營(yíng)養(yǎng)組成及抗?fàn)I養(yǎng)因子含量如表 1,氨基酸組成如表 2。關(guān)于枯草芽孢桿菌有氧發(fā)酵豆粕的研究目前主要集中在對(duì)豆類(lèi)蛋白質(zhì)水解及提高抗氧化活性方面[19,20], 對(duì)飼喂效果方面的研究較少, 僅見(jiàn)虹鱒(Oncorhynchus mykiss)[21]、巖魚(yú)(Sebastes schlegeli)[22]和日本尖吻鱸(Lateolabrax japonicus)[9]等幾個(gè)品種, 而在大口黑鱸中的研究甚少, 且對(duì)腸道菌群影響的研究鮮有報(bào)道。本文旨在探討枯草芽孢桿菌有氧發(fā)酵豆粕對(duì)大口黑鱸幼魚(yú)生長(zhǎng)、脂質(zhì)代謝、血清非特異性免疫及腸道菌群的影響, 以期為大口黑鱸配合飼料的研發(fā)優(yōu)化和大口黑鱸人工養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展提供理論依據(jù)。

表1 豆粕和發(fā)酵豆粕營(yíng)養(yǎng)組成及抗?fàn)I養(yǎng)因子含量Tab. 1 Nutritional composition and anti-nutritional factor content of soybean meal and fermented soybean meal (%)

表2 豆粕和發(fā)酵豆粕氨基酸組成Tab. 2 Amino acid composition of soybean meal and fermented soybean meal (%)

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)魚(yú)

試驗(yàn)用魚(yú)購(gòu)自于上海秦皇山漁業(yè)有限公司, 試驗(yàn)正式開(kāi)始之前進(jìn)行1個(gè)月的馴養(yǎng), 馴養(yǎng)期間投喂加州鱸魚(yú)1號(hào)料。

1.2 試驗(yàn)飼料

以魚(yú)粉為主要蛋白源, 以魚(yú)油、豆油及大豆磷脂油為主要脂肪源配制基礎(chǔ)飼料。在基礎(chǔ)飼料中用發(fā)酵豆粕替代0、10%、20%、30%和40%魚(yú)粉,另外補(bǔ)充晶體蛋氨酸與賴氨酸使之達(dá)到與基礎(chǔ)組同等水平(相比于其他必需氨基酸, 蛋氨酸與賴氨酸是大口黑鱸的限制性氨基酸, 因此配方在滿足其營(yíng)養(yǎng)需求的同時(shí)保證各組蛋氨酸與賴氨酸水平一致), 將粉碎后過(guò)60目篩的所有原料按照配方的比例混合均勻, 配制成5種等氮等能(CP47%, GE19 MJ/kg)的試驗(yàn)飼料, 分別為FM、FSM10、FSM20、FSM30和FSM40?；旌系脑辖?jīng)飼料機(jī)制成直徑2 mm的顆粒, 60℃烘至水分低于10%, 密封于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｔ囼?yàn)飼料配方及營(yíng)養(yǎng)組成如表 3。

表3 飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平(%干飼料)Tab. 3 Composition and nutrient levels of diets (% dry diet)

1.3 試驗(yàn)分組與管理

在試驗(yàn)開(kāi)始時(shí), 先對(duì)大口黑鱸進(jìn)行24h的饑餓處理, 然后挑選體格健壯、規(guī)格均勻的魚(yú)進(jìn)行分組。5組, 每組3個(gè)重復(fù), 隨機(jī)放置初始體重為(22.05±0.09) g的魚(yú)30尾于15個(gè)大小一致的網(wǎng)箱中。試驗(yàn)養(yǎng)殖周期為58d, 采取表觀飽食方式進(jìn)行投喂, 每日兩次(8: 00和17: 00)。定期檢測(cè)水質(zhì), 水溫在26—32℃, 氨氮低于0.5 mg/L, pH為7.5—8.5,不間斷充氣, 每隔兩天換一次水, 換水量在1/3左右。

1.4 樣品采集與指標(biāo)測(cè)定

在養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后, 大口黑鱸禁食24h, 然后統(tǒng)計(jì)每組魚(yú)的存活數(shù)、攝食量并稱(chēng)重, 用于計(jì)算生長(zhǎng)指標(biāo)。每網(wǎng)箱隨機(jī)取12尾魚(yú), 其中6尾分別測(cè)體長(zhǎng),稱(chēng)體重、肝臟重和內(nèi)臟重, 用于計(jì)算形體指標(biāo)。其中3尾魚(yú)于-80℃保存, 用于全魚(yú)組分分析。另外3尾魚(yú), 尾靜脈采血1 mL, 取血清于-80℃保存, 用于免疫等指標(biāo)分析; 取腸道, 用75%酒精擦拭腸道外壁, 用生理鹽水沖洗數(shù)次, 混合成一個(gè)樣本收集于滅菌的EP管中, -80℃保存, 用于腸道微生物的檢測(cè)。

飼料、全魚(yú)水分含量采用105℃烘箱干燥恒重法(GB/T 6435-2014)測(cè)定, 粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和粗灰分含量依次采用凱氏定氮法(GB/T 6432-2018)、索氏抽提法(GB/T 6433-2006)和550℃灼燒法(GB/T 6438-2007)測(cè)定。

血清脂質(zhì)代謝及免疫指標(biāo)均采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行測(cè)定。其中血清甘油三酯(TG)含量采用GPO-PAP酶法測(cè)定; 血清總膽固醇(T-CHO)含量采用COD-PAP法測(cè)定; 血清低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)含量均采用直接法測(cè)定; 血清總蛋白(TP)含量采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定; 堿性磷酸酶(AKP)和酸性磷酸酶(ACP)活性均采用磷酸苯二鈉法測(cè)定; 超氧化物歧化酶(SOD)、溶菌酶(LZM)活性依次采用WST-1法、比濁法測(cè)定。

使用E.Z.N.A.?soil DNA kit(Omega 美國(guó))從每組每個(gè)平行3尾魚(yú)腸道混樣中提取微生物群落總DNA。DNA的完整性由1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè), DNA濃度和純度由超微量分光光度計(jì)(Nano-Drop2000)測(cè)定。以338F(5′-ACTCCTACGGGAG GCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGT WTCTAAT-3′)為引物, 擴(kuò)增16S rRNA基因的V3—V4區(qū)。擴(kuò)增程序?yàn)? 95℃預(yù)變性3min, 27個(gè)循環(huán)(95℃變性30s, 55℃退火30s, 72℃延伸30s), 72℃延伸10min (PCR儀: ABI GeneAmp?9700型)。使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物, 再利用AxyPrep DNAGel Extraction Kit (Axygen Biosciences, 美國(guó))純化,2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè), 并用Quantus? Fluorometer (Promega, 美國(guó))進(jìn)行檢測(cè)定量。使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit進(jìn)行建庫(kù)。利用Illumina公司的Miseq PE300平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司)。

1.5 數(shù)據(jù)處理及分析

生長(zhǎng)數(shù)據(jù)處理:

增重率(Weight gain rate,WGR, %)=100%×(試驗(yàn)魚(yú)終末體重-試驗(yàn)魚(yú)初始體重)/試驗(yàn)魚(yú)初始體重;

特定生長(zhǎng)率(Specific growth rate,SGR, %/d)=100%×(ln試驗(yàn)魚(yú)終末體重-ln試驗(yàn)魚(yú)初始體重)/試驗(yàn)天數(shù);

成活率(Survival rate,SR, %)=100%×試驗(yàn)終末魚(yú)尾數(shù)/試驗(yàn)初始魚(yú)尾數(shù);

飼料系數(shù)(Feed coefficient ratio,FCR)=攝食飼料質(zhì)量/(試驗(yàn)魚(yú)終末體重-試驗(yàn)魚(yú)初始體重);

肥滿度(Condition factor,CF, g/cm3)=100×體重/體長(zhǎng)3;

肝體比(Hepatosomatic index,HSI)=100×肝臟重/體重;

臟體比(Viscerosomatic index,VSI)=100×內(nèi)臟團(tuán)重/體重;

飼料干物質(zhì)表觀消化率(Apparent digestibility of dry matter,ADDM, %)=100%×(1-飼料中三氧化二釔的含量/糞便中三氧化二釔的含量)。

Illumina Mi seq 測(cè)序數(shù)據(jù)處理:

使用Trimmomatic軟件原始測(cè)序序列進(jìn)行質(zhì)控,使用Flash軟件進(jìn)行拼接。使用Uparse軟件, 根據(jù)97%的相似度對(duì)序列進(jìn)行OTU聚類(lèi)并剔除嵌合體。利用RDP Classifier對(duì)每條序列進(jìn)行物種分類(lèi)注釋, 比對(duì)Silva數(shù)據(jù)庫(kù)(SSU 128), 設(shè)置比對(duì)閾值為70%。對(duì)原始的OTU數(shù)據(jù)進(jìn)行抽平處理。利用Mothur軟件對(duì)腸道菌群組成進(jìn)行Alpha多樣性指數(shù)分析。使用R語(yǔ)言工具作Venn圖、群落柱狀圖?；跇颖局腥郝湄S度數(shù)據(jù), 做多物種差異檢驗(yàn)柱形圖。

使用SPSS 25.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析,差異顯著則用Duncan氏法進(jìn)行多重性比較, 結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)表示, 顯著水平為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 發(fā)酵豆粕替代魚(yú)粉對(duì)大口黑鱸幼魚(yú)生長(zhǎng)的影響

由表 4可知, 各試驗(yàn)組間WGR、SGR均無(wú)顯著差異(P＞0.05); FM、FSM10、FSM20和FSM30等4組的SR無(wú)顯著差異(P＞0.05), 但均顯著高于FSM40組(P＜0.05); FSM10、FSM20、FSM30和FSM40等4組的FCR均無(wú)顯著差異(P＞0.05), 但均顯著高于FM組(P＜0.05)。

表4 發(fā)酵豆粕替代魚(yú)粉對(duì)大口黑鱸幼魚(yú)生長(zhǎng)指標(biāo)的影響Tab. 4 Effects of replacing fish meal with fermented soybean meal on growth indices of juvenile largemouth bass (n=3)

由表 5可知, 各試驗(yàn)組間CF、HSI和VSI均無(wú)顯著差異(P＞0.05); FSM40組ADDM顯著低于其余各組(P＜0.05), FSM10、FSM20和FSM30三組與FM組無(wú)顯著差異(P＞0.05)。

表5 發(fā)酵豆粕替代魚(yú)粉對(duì)大口黑鱸幼魚(yú)形體指標(biāo)(n=18)及干物質(zhì)表觀消化率(n=3)的影響Tab. 5 Effects of replacing fish meal with fermented soybean meal on body shape (n=18) and ADDM (n=3) of juvenile largemouth bass

2.2 發(fā)酵豆粕替代魚(yú)粉對(duì)大口黑鱸幼魚(yú)體成分的影響

由表 6可知, 各組間大口黑鱸的體成分中粗蛋白、粗脂肪和粗灰分差異不顯著(P＞0.05); 全魚(yú)的水分出現(xiàn)了差異, FSM10和FSM20組水分顯著低于FM組(P＜0.05)。

表6 發(fā)酵豆粕替代魚(yú)粉對(duì)大口黑鱸幼魚(yú)體成分的影響Tab. 6 Effects of replacing fish meal with fermented soybean meal on body composition of juvenile largemouth bass (%, n=3)

2.3 發(fā)酵豆粕替代魚(yú)粉對(duì)大口黑鱸幼魚(yú)脂質(zhì)代謝的影響

由表 7可知, FSM40組血清TG含量和FSM30和FSM40組血清T-CHO含量顯著低于FM組(P＜0.05), 各組間LDL-C和HDL-C含量均無(wú)顯著差異(P＞0.05)。

表7 發(fā)酵豆粕替代魚(yú)粉對(duì)大口黑鱸幼魚(yú)脂質(zhì)代謝的影響Tab. 7 Effects of replacing fish meal with fermented soybean meal on lipid metabolism of juvenile largemouth bass (mmol/L,n=9)

2.4 發(fā)酵豆粕替代魚(yú)粉對(duì)大口黑鱸幼魚(yú)血清非特異性免疫的影響

由表 8可知, 隨著發(fā)酵豆粕替代魚(yú)粉比例的增加, 大口黑鱸血清中TP含量、AKP和ACP活性均無(wú)顯著變化(P＞0.05), 但FSM40組血清中LZM和SOD活性均顯著高于FM、FSM10、FSM20和FSM30組(P＜0.05)。

表8 發(fā)酵豆粕替代魚(yú)粉對(duì)大口黑鱸幼魚(yú)血清非特異性免疫的影響Tab. 8 Effects of replacing fish meal with fermented soybean meal on serum nonspecific immunity of juvenile largemouth bass (n=9)

2.5 發(fā)酵豆粕替代魚(yú)粉對(duì)大口黑鱸幼魚(yú)腸道菌群多樣性和OTU數(shù)量的影響

根據(jù)各組樣本OTU數(shù)量, 采用Sobs指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Ace指數(shù)和Chao指數(shù)對(duì)腸道菌群進(jìn)行Alpha多樣性分析(表 9)。五組覆蓋度在99.86%—99.93%, 表示測(cè)序量充足, 可以反映大口黑鱸腸道菌群的真實(shí)情況。另外, 各組之間Sobs指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Ace指數(shù)和Chao指數(shù)雖有差異, 但差異均不顯著(P＞0.05)。

表9 樣品的Alpha多樣性指數(shù)Tab. 9 Alpha-diversity of samples

進(jìn)一步分析各組樣品中細(xì)菌多樣性的相互關(guān)系, 并構(gòu)建Venn圖(圖 1)。由圖 1可知, 五組腸道樣品一共有647個(gè)OTUs, 其中32個(gè)共同OTUs, 占五組OTU總數(shù)的4.95%; FM組和FSM10組共有73個(gè)OTU, 占FM組OTU數(shù)的70.87%, 占FSM10組OTU數(shù)的28.52%; FM組和FSM20組共有73個(gè)OTU, 占FM組OTU數(shù)的70.87%, 占FSM20組OTU數(shù)的33.64%; FM組和FSM30組共有66個(gè)OTU, 占FM組OTU數(shù)的64.08%, 占FSM30組OTU數(shù)的16.84%;FM組和FSM40組共有65個(gè)OTU, 占FM組OTU數(shù)的63.11%, 占FSM40組OTU數(shù)的21.59%。

圖1 OTU數(shù)量對(duì)比維恩圖Fig. 1 Venn diagram representing shared OTUs

2.6 發(fā)酵豆粕替代魚(yú)粉對(duì)大口黑鱸幼魚(yú)腸道菌群組成的影響

如圖 2所示，從腸道中共檢測(cè)出軟壁菌門(mén)(Tenericutes)、變形菌門(mén)(Proteobacteria)、梭桿菌門(mén)(Fusobacteria)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)五個(gè)門(mén)及其他未被分類(lèi)的細(xì)菌。其中, 梭桿菌門(mén)(63.87%)、變形菌門(mén)(22.18%)和軟壁菌門(mén)(13.53%)為FM組的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)。FSM10、FSM30和FSM40組的優(yōu)勢(shì)門(mén)相同, 為變形菌門(mén)(71.98%、36.51%和62.38%)、軟壁菌門(mén)(18.84%、55.61%和34.63%)。而FSM20組的優(yōu)勢(shì)門(mén)為軟壁菌門(mén)(83.09%)、梭桿菌門(mén)(11.82%), 變形菌門(mén)(3.97%)為劣勢(shì)門(mén), 其相對(duì)豐度低于其余各組。

圖2 腸道菌群組成(門(mén)水平)Fig. 2 Composition of intestinal flora (phylum level)

如圖 3所示，從腸道中共檢測(cè)出支原菌屬(Mycoplama)、鄰單胞菌屬(Plesiomonas)、鯨桿菌屬(Cetobacterium)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、羅姆布茨菌屬(Romboutsia)、紫單胞菌科中某一屬(Dysgonomonas)6個(gè)屬及其他未被分類(lèi)的細(xì)菌。其中,鯨桿菌屬(63.87%)、鄰單胞菌屬(21.82%)和支原菌屬(13.53%)為FM組的優(yōu)勢(shì)屬。FSM10、FSM30和FSM40組的優(yōu)勢(shì)屬相同, 為鄰單胞菌屬(61.51%、34.51%和60.32%)和支原菌屬(18.83%、55.61%和34.63%)。而FSM20組的優(yōu)勢(shì)屬為支原菌屬(83.09%)和鯨桿菌屬(11.82%), 鄰單胞菌屬(3.39%)為劣勢(shì)屬,其相對(duì)豐度低于其余各組。

圖3 腸道菌群組成(屬水平)Fig. 3 Composition of intestinal flora (genus level)

2.7 微生物群落差異分析

基于樣本中群落豐度數(shù)據(jù), 進(jìn)行組間差異顯著性檢驗(yàn)。腸道菌群門(mén)水平上的單因素方差分析圖如圖 4所示, 各組間軟壁菌門(mén)、變形菌門(mén)差異顯著(P＜0.05)。腸道菌群屬水平上的單因素方差分析圖如圖 5所示, 各組間支原菌屬、鄰單胞菌屬同樣也具有顯著差異(P＜0.05)。

圖4 單因素方差分析條形圖(門(mén)水平)Fig. 4 One-way ANOVA bar plots (phylum level)

圖5 單因素方差分析條形圖(屬水平)Fig. 5 One-way ANOVA bar plots (genus level)

3 討論

3.1 發(fā)酵豆粕替代魚(yú)粉對(duì)大口黑鱸幼魚(yú)生長(zhǎng)的影響

本研究結(jié)果表明, 發(fā)酵豆粕替代20%—30%的魚(yú)粉不會(huì)對(duì)大口黑鱸生長(zhǎng)產(chǎn)生負(fù)面影響。已有的研究中也出現(xiàn)了類(lèi)似結(jié)果。Choi等[23]研究發(fā)現(xiàn), 發(fā)酵豆粕替代40%的魚(yú)粉, 不會(huì)對(duì)虹鱒的WGR產(chǎn)生影響。Luo等[24]發(fā)現(xiàn)發(fā)酵豆粕替代斜帶石斑魚(yú)(Epinephelus coioides)飼料中10%的魚(yú)粉, 魚(yú)的生長(zhǎng)和魚(yú)體組成沒(méi)有顯著變化。He等[25]研究表明, 在保持限制性氨基酸水平一致的條件下, 發(fā)酵豆粕替代不超過(guò)30%的魚(yú)粉, 大口黑鱸的SGR、SR和CF與對(duì)照組相比均無(wú)顯著差異。在飼料中大豆蛋白產(chǎn)品的含量超過(guò)一定水平, 會(huì)導(dǎo)致生長(zhǎng)性能受損和飼料利用效率低下, 這與幾個(gè)因素有關(guān), 包括飼料中可消化碳水化合物水平的增加[26], 抗?fàn)I養(yǎng)因子的存在和飼料適口性降低[4], 及氨基酸濃度不平衡[27]。在本研究中, 低于40%替代比例的組別其生長(zhǎng)性能均未和FM對(duì)照組產(chǎn)生顯著差異, 這可能是因?yàn)榘l(fā)酵消除了豆粕中大量的抗?fàn)I養(yǎng)因子, 降解了多數(shù)大分子蛋白, 從而提高了魚(yú)類(lèi)對(duì)發(fā)酵豆粕的消化吸收能力[28]。另外, 也可能是因?yàn)樵陲暳现刑砑恿诉m量的晶體氨基酸(賴氨酸和蛋氨酸)從而消除了限制性氨基酸的不良影響[29]。此外, 本研究結(jié)果還顯示, 隨著發(fā)酵豆粕替代比例的上升, 試驗(yàn)魚(yú)HSI和VSI呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì), 這表示在一定程度上發(fā)酵豆粕可以促進(jìn)脂肪的吸收, 但效果并不顯著。這與He等[25]在大口黑鱸飼料中用發(fā)酵豆粕替代45%及以上比例的魚(yú)粉可以顯著降低試驗(yàn)魚(yú)HSI的研究結(jié)果有所不同,可能是由于發(fā)酵豆粕和飼料配方不同所致。

魚(yú)類(lèi)的消化率除了受到飼料中抗?fàn)I養(yǎng)因子的影響還和其腸道消化酶活性有關(guān)。有研究表明, 用豆粕代替飼料中60%的魚(yú)粉顯著降低了烏鱧(Channa argus)的腸道消化酶活性[30], 發(fā)酵可以通過(guò)降解飼料中的大分子蛋白及提高石斑魚(yú)(Epinephelus coioides)的腸道消化酶活性來(lái)提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化率[31]。在本研究中, 發(fā)酵豆粕中胰蛋白酶抑制因子、水蘇糖和棉籽糖含量大大降低, 因此即使替代水平達(dá)到30%時(shí), 試驗(yàn)魚(yú)的ADDM也并未和對(duì)照組產(chǎn)生顯著差異。而FSM40組ADDM的顯著下降則可能和魚(yú)類(lèi)腸道消化酶活性降低有關(guān), 有待進(jìn)一步研究。

3.2 發(fā)酵豆粕替代魚(yú)粉對(duì)大口黑鱸幼魚(yú)體成分的影響

植物蛋白替代魚(yú)粉對(duì)魚(yú)體成分的影響與魚(yú)的種類(lèi)、大小和替代水平等因素相關(guān)。據(jù)報(bào)道, 植物蛋白替代魚(yú)粉不會(huì)對(duì)虹鱒[21]、佛羅里達(dá)鯧鲹(Trachinotus carolinus)[32]、巖魚(yú)[22]等的體組成造成顯著影響, 但也有研究認(rèn)為高水平(80%和75%)替代會(huì)顯著增加石斑魚(yú)(Epinephelus lanceolatus)[33]和日本尖吻鱸[34]的水分, 降低其粗蛋白和粗脂肪含量。本研究結(jié)果表明, 低水平替代組(10%和20%)與對(duì)照組相比顯著降低了水分含量, 而粗蛋白和粗脂肪含量卻有升高。而Daniela等[35]用豆制品替代魚(yú)粉飼養(yǎng)鋸蓋魚(yú)(Centropomus viridis)的研究中也得到了類(lèi)似的結(jié)果。

3.3 發(fā)酵豆粕替代魚(yú)粉對(duì)大口黑鱸幼魚(yú)脂質(zhì)代謝的影響

血清TG和T-CHO是魚(yú)類(lèi)肝臟脂質(zhì)代謝的重要指標(biāo)[36], 而且兩者在動(dòng)物機(jī)體的變化趨勢(shì)也基本一致。在本研究中, 隨著發(fā)酵豆粕替代比例的增加,血清TG和T-CHO含量先增后減, FSM40組的TG含量顯著低于FM對(duì)照組, FSM30和FSM40組的TCHO含量顯著低于FM對(duì)照組。這種情況說(shuō)明適量的發(fā)酵豆粕替代魚(yú)粉后可以改善大口黑鱸肝臟脂質(zhì)代謝狀況, 而LDL-C水平的變化趨勢(shì)也與之相互印證。另外高水平替代組血清TG和T-CHO含量的減少可能是大豆中的異黃酮[37]或者植物固醇[38]起的作用, 至于脂質(zhì)代謝的其他分子機(jī)制還待進(jìn)一步研究。

3.4 發(fā)酵豆粕替代魚(yú)粉對(duì)大口黑鱸幼魚(yú)血清非特異性免疫的影響

血清TP含量是衡量機(jī)體蛋白質(zhì)和氨基酸的利用率的重要指標(biāo)之一[39]。在本研究中, 隨著發(fā)酵豆粕替代魚(yú)粉水平的增加, 血清TP水平逐漸升高但并無(wú)顯著變化。這表明在飼料中添加發(fā)酵豆粕在一定程度上可以促進(jìn)血清蛋白質(zhì)的合成, 從而提高機(jī)體免疫力。非特異性免疫系統(tǒng)作為防御系統(tǒng)的第一道防線, 對(duì)魚(yú)類(lèi)的抗病性尤為重要[40]。而LZM是其重要組成部分, 可以通過(guò)裂解細(xì)菌細(xì)胞壁而殺滅細(xì)菌[41]。在本研究中, 血清LZM活性隨著發(fā)酵豆粕替代魚(yú)粉比例的增加而逐漸上升并且在替代比例達(dá)到40%時(shí)與對(duì)照組產(chǎn)生顯著差異, 這說(shuō)明在本試驗(yàn)條件下發(fā)酵豆粕可以增強(qiáng)大口黑鱸的非特異性免疫力。益生菌在宿主胃腸道中既能作為免疫興奮劑、改變酶活又能調(diào)節(jié)微生物群落結(jié)構(gòu), 有益于宿主健康[42]。推測(cè)原因可能是發(fā)酵豆粕中益生菌芽孢桿菌起到的免疫刺激作用。類(lèi)似的結(jié)果, 在羅非魚(yú)(Oreochromis niloticus)[43]、卵形鯧鲹(Trachinotus ovatus)[44]、異育銀鯽(Carassius auratus gibeliovar.CAS Ⅲ)[45]中均有發(fā)現(xiàn)。SOD是抗氧化酶防御系統(tǒng)的第一道防線[46]。Zhang等[45]用發(fā)酵辣木葉替代魚(yú)粉飼喂異育銀鯽, 結(jié)果表明替代組血清SOD活性均顯著升高。Choi等[23]用枯草芽孢桿菌、乳酸菌和酵母菌混合發(fā)酵的豆粕替代魚(yú)粉, 研究發(fā)現(xiàn)虹鱒血清SOD活性隨著發(fā)酵豆粕替代水平上升而上升。本研究結(jié)果顯示, 發(fā)酵豆粕替代魚(yú)粉可提高血清SOD活性, 替代水平為40%時(shí)與對(duì)照組產(chǎn)生顯著差異。芽孢桿菌可以刺激抗氧化酶和抗氧化劑的產(chǎn)生, 從而起到清除機(jī)體自由基、維持穩(wěn)態(tài)、提高抗氧化能力的作用[46,47]。推測(cè)本研究結(jié)果可能和發(fā)酵豆粕中的枯草芽孢桿菌有關(guān), 也可能和發(fā)酵豆粕中某些具有提高機(jī)體抗氧化能力的游離氨基酸有關(guān)[13]。

3.5 發(fā)酵豆粕替代魚(yú)粉對(duì)大口黑鱸幼魚(yú)腸道菌群多樣性及組成的影響

魚(yú)類(lèi)腸道內(nèi)的菌群種類(lèi)豐富、數(shù)量龐大[48]。穩(wěn)定且有益的腸道菌群對(duì)宿主的生長(zhǎng)、健康起重要作用[49]。一旦腸道菌群失調(diào), 宿主的免疫系統(tǒng)就有可能受到影響, 條件性致病菌還可能轉(zhuǎn)移或危害宿主的其他組織器官, 導(dǎo)致細(xì)菌性疾病的爆發(fā)[50]。近幾年, 研究人員廣泛報(bào)道了富含營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(包括益生元、益生菌、小肽、游離氨基酸)的發(fā)酵豆粕是如何改善魚(yú)類(lèi)腸道微生物的[51,52]。和Wang等[52]研究結(jié)果類(lèi)似, 在本研究中, 發(fā)酵豆粕替代魚(yú)粉并未顯著改變大口黑鱸腸道菌群的多樣性。這樣看來(lái)腸道菌群的多樣性并非是決定魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)性能的關(guān)鍵因素。而魚(yú)類(lèi)腸道菌群組成, 在門(mén)的分類(lèi)水平上, 軟壁菌門(mén)、變形菌門(mén)和梭桿菌門(mén)占絕對(duì)優(yōu)勢(shì),在屬的分類(lèi)水平上, 支原菌屬、鄰單胞菌屬和鯨桿菌屬占絕對(duì)優(yōu)勢(shì), 推測(cè)這些菌群可能是在魚(yú)類(lèi)苗種時(shí)期定值下來(lái)的[53], 大口黑鱸腸道存在一個(gè)以支原菌屬、鄰單胞菌屬和鯨桿菌屬為主的本土微生物群落。這與Larsen等[54]在大口黑鱸上的研究結(jié)果類(lèi)似。而門(mén)和屬水平上細(xì)菌相對(duì)豐度的差異可能與養(yǎng)殖環(huán)境、魚(yú)類(lèi)大小和飼料營(yíng)養(yǎng)組成有關(guān)。

在通常情況下, 條件性致病菌是動(dòng)物腸道菌群的正常組成部分, 只有在某些特定情況下, 才會(huì)引起疾病[50]。支原體隸屬支原體科、柔膜菌綱, 是一類(lèi)廣泛存在于人和動(dòng)物體內(nèi), 呈革蘭氏陰性的原核細(xì)胞型微生物[55]。支原體屬中的某些物種還是哺乳動(dòng)物腸道中的潛在致病菌[56], 但已有研究證實(shí)支原體是魚(yú)類(lèi)腸道中正常菌群的一部分, 且其在健康和生理上可能發(fā)揮著某種未知的作用[57]。支原體的生長(zhǎng)及繁殖需要葡萄糖和果糖, 而豆粕發(fā)酵會(huì)產(chǎn)生葡萄糖和果糖[58], 所以本研究替代組魚(yú)類(lèi)腸道中支原體屬相對(duì)豐度均高于對(duì)照組。鄰單胞菌屬是養(yǎng)殖水體和淡水魚(yú)體中常見(jiàn)的細(xì)菌, 其中的志賀氏鄰單胞菌(Plesiomonas shigelloides)則不僅是人類(lèi)腸道疾病的病原菌[59], 同時(shí)也是草魚(yú)(Ctenopharyngodon idellus)[60]、銀鯉(Hypophthalmichthys molitrix)[61]和羅非魚(yú)[62]等魚(yú)類(lèi)的致病菌。有研究表明,高水平發(fā)酵豆粕替代組受某些抗?fàn)I養(yǎng)因子(如大豆球蛋白等)的影響, 會(huì)打破腸道菌群的穩(wěn)態(tài), 阻礙益生菌的生長(zhǎng), 使得變形菌門(mén)物種豐度增加[63]。而本研究, 飼料中大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白并未被降解完全, 因此組間變形菌門(mén)及該門(mén)內(nèi)鄰單胞菌屬的相對(duì)豐度的變化(20%替代組顯著低于40%替代組)可能是由于飼料中殘留的大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白引起的。這與何嬌嬌等[64]在大黃魚(yú)上的研究結(jié)果類(lèi)似, 與高水平(75%)發(fā)酵豆粕替代組相比, 中水平(45%)添加組幼魚(yú)腸道內(nèi)水棲菌屬(Enhyd-robacter)和對(duì)照組副球菌屬(Paracoccus)物種豐度均顯著降低。

4 結(jié)論

發(fā)酵豆粕與豆粕相比, 抗?fàn)I養(yǎng)因子含量顯著降低, 氨基酸含量有所提升, 其替代魚(yú)粉水平較低時(shí)不會(huì)對(duì)大口黑鱸幼魚(yú)的生長(zhǎng)、脂質(zhì)代謝、血清非特異性免疫及腸道菌群產(chǎn)生負(fù)面影響, 且在一定程度上可以促進(jìn)魚(yú)類(lèi)對(duì)脂肪的吸收, 降低肝體比和臟體比。而替代水平過(guò)高則會(huì)顯著降低試驗(yàn)魚(yú)成活率、干物質(zhì)表觀消化率、血清甘油三酯和總膽固醇含量, 引起魚(yú)類(lèi)免疫應(yīng)激, 腸道菌群失衡。因此綜合各方面的結(jié)果, 在此試驗(yàn)條件下, 魚(yú)粉含量為54.95%的飼料中發(fā)酵豆粕替代魚(yú)粉的適宜比例為20%。