氨氮和鎘脅迫對芙蓉鯉鯽抗氧化系統(tǒng)和免疫機(jī)能的影響

高金偉 吳 浩 李紹明 謝 敏 李文祥 宋 銳

(1. 湖南省水產(chǎn)科學(xué)研究所, 長沙 410153; 2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水養(yǎng)殖病害防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 434072)

魚類作為低等水生脊椎動物, 其呼吸、排泄和生長發(fā)育等生命過程均在水環(huán)境中進(jìn)行, 并對水體環(huán)境產(chǎn)生一定的影響。同樣的, 水體中的各種環(huán)境因子(如氨氮、重金屬和溶解氧)也會影響魚體的生命活動。氨氮作為水體中常見的環(huán)境污染因子之一, 主要來源于農(nóng)業(yè)徑流、水中殘餌及排泄物的氨化作用, 可通過鰓等器官進(jìn)入魚體, 對魚類有很強(qiáng)的毒性作用[1,2], 可顯著影響魚類的生長速率[3]、抗氧化能力[2]、免疫力[4]和組織器官結(jié)構(gòu)[1]等, 擾亂魚體正常的生理活動和新陳代謝, 嚴(yán)重的可導(dǎo)致死亡。近年來, 隨著有色金屬的開采和冶煉、印染、農(nóng)藥、飼料等行業(yè)的迅猛發(fā)展, 大量重金屬污染物通過多種途徑進(jìn)入水生生態(tài)系統(tǒng), 嚴(yán)重威脅水生生物的生存, 并通過食物鏈間接影響人類健康和食品安全[5]。重金屬鎘作為生物體內(nèi)非必需的微量金屬元素, 對動物有較強(qiáng)的致畸、致癌和致突變作用,是生物毒性最強(qiáng)的重金屬元素, 已被聯(lián)合國環(huán)境規(guī)劃署(UNEP)列為十二種全球性環(huán)境污染物之首[6]。水體中的鎘經(jīng)過溶解、沉淀等一系列反應(yīng)后, 在水體和沉積物中遷移、轉(zhuǎn)化, 并隨著灌溉用水和養(yǎng)殖池塘換水向農(nóng)田和養(yǎng)殖水域擴(kuò)散。此外, 部分鎘污染農(nóng)田經(jīng)工程化改造后用于稻田綜合種養(yǎng)和池塘工程化養(yǎng)殖, 因此, 水體中的魚類等水生動物均遭受著不同程度的鎘脅迫。鎘在生物體內(nèi)難以降解,具有蓄積毒性, 可通過食物鏈和食物網(wǎng)產(chǎn)生生物富集和生物放大效應(yīng), 嚴(yán)重危害水生動物的健康和水產(chǎn)品質(zhì)量安全, 可引起魚類等水生動物發(fā)育畸形[7]、生殖內(nèi)分泌紊亂[8]、氧化代謝酶活性降低[9]、免疫功能抑制[10]和組織器官損傷[11]等生理副作用。

魚類作為水域生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分, 其生理活動極易受到水源性化學(xué)污染物(氨氮、鎘)的影響。為抵御環(huán)境污染物的氧化脅迫, 魚類已進(jìn)化出一套由超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)等抗氧化酶及谷胱甘肽(GSH)和維生素C (Vc)等抗氧化劑組成的氧化防御系統(tǒng)[12]。但當(dāng)脅迫因子的強(qiáng)度和持續(xù)時間超過魚體自我防御的能力時, 魚體中過量產(chǎn)生的活性氧(Reactive oxygen species, ROS)會攻擊蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等生物大分子, 產(chǎn)生大量的脂質(zhì)過氧化物, 誘導(dǎo)氧化應(yīng)激, 進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體非特異性免疫能力下降[13]。芙蓉鯉鯽(Cyprinus capiofurong.♀×Carassius auratusred var.♂)為湖南省水產(chǎn)科學(xué)研究所自主培育的新型雜交品種, 目前已通過池塘養(yǎng)殖、網(wǎng)箱養(yǎng)殖和稻田養(yǎng)殖等養(yǎng)殖模式在湖南、湖北、甘肅和天津等24個省(市)示范推廣[14]。芙蓉鯉鯽食性雜, 極易受到環(huán)境重金屬的污染, 同時其抗逆性強(qiáng), 養(yǎng)殖密度大, 養(yǎng)殖水體中氨氮濃度較高, 因此芙蓉鯉鯽是研究鎘和氨氮脅迫的良好材料。目前, 國內(nèi)外關(guān)于氨氮和鎘單獨(dú)脅迫對魚類抗氧化系統(tǒng)及免疫力影響的研究報(bào)道較多[2—4,10,11], 但關(guān)于氨氮和鎘聯(lián)合脅迫對芙蓉鯉鯽抗氧化功能和免疫機(jī)能影響的研究尚未見報(bào)道。研究表明, 水體中高濃度的氨氮常與高濃度的重金屬和有機(jī)污染物共同存在[15], 因此魚類可能同時面臨多種污染物的脅迫。目前, 越來越多的學(xué)者關(guān)注環(huán)境污染物聯(lián)合脅迫對魚類生理機(jī)能和抗氧化狀態(tài)的影響, 但大部分為兩種重金屬及重金屬與有機(jī)污染物的聯(lián)合脅迫[16,17],有關(guān)鎘和氨氮聯(lián)合脅迫的研究卻鮮見報(bào)道。

本研究以芙蓉鯉鯽為實(shí)驗(yàn)對象, 以鎘和氨氮為脅迫源, 采用靜水生物試驗(yàn)法研究氨氮和鎘單一脅迫和聯(lián)合脅迫下芙蓉鯉鯽肝臟抗氧化能力和免疫力的變化規(guī)律, 探討不同脅迫條件下芙蓉鯉鯽的抗逆機(jī)制和免疫調(diào)節(jié)機(jī)制, 以期為芙蓉鯉鯽的健康養(yǎng)殖及環(huán)境污染物的風(fēng)險(xiǎn)評價提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

芙蓉鯉鯽取自湖南省水產(chǎn)科學(xué)研究所長沙基地, 魚體健壯, 活力強(qiáng), 體表無損傷, 體質(zhì)量(32.75±3.53) g, 體長(10.13±0.89) cm。實(shí)驗(yàn)開始前在規(guī)格為95 cm×60 cm×50 cm的玻璃缸中暫養(yǎng)7d, 試驗(yàn)用水為經(jīng)充分曝氣72h的地下井水, 水溫(27±1)℃, pH(7.8±0.2), 溶解氧(4.5±0.5) mg/L, 24h連續(xù)增氧, 每天定時投喂顆粒飼料和換水排污。

氯化銨(NH4Cl, 純度≥99.5%)和氯化鎘(CdCl2·2.5H2O, 純度≥99.0%)購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司; 總蛋白(TP)測定試劑盒(帶標(biāo)準(zhǔn): 考馬斯亮藍(lán)法, A045-2-2), 總超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒(WST-1法, A001-3-2), 過氧化氫酶(CAT)測定試劑盒(可見光法, A007-1-1), 谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)測定試劑盒(比色法, A005-1-2), 還原型谷胱甘肽(GSH)測定試劑盒(微板法, A006-2-1), 堿性磷酸酶(AKP)測定試劑盒(微板法, A059-2-2), 酸性磷酸酶(ACP)測定試劑盒(微板法, A060-2-2)和髓過氧化物酶(MPO)測試盒(比色法, A044-1-1)均購自南京建成生物工程研究所有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

采用靜水染毒法, 分別以分析純氯化銨和氯化鎘為氨氮源和鎘源, 按照NH4+離子濃度和Cd2+離子濃度分別配制成濃度為5和1 g/L的母液, 根據(jù)試驗(yàn)需求稀釋至所需濃度。 通過預(yù)實(shí)驗(yàn)得出芙蓉鯉鯽96h氨氮和鎘半致死濃度(96hLC50)分別為25.64和112.81 mg/L, 以96hLC50的10%為安全濃度, 則氨氮和鎘對芙蓉鯉鯽的安全濃度分別為2.56和11.28 mg/L。在此基礎(chǔ)上, 本研究設(shè)置4個處理組, 分別為空白對照組(Control)、氨氮脅迫組(NH3-N, 2.56 mg/L)、鎘脅迫組(Cd, 11.28 mg/L)及氨氮和鎘聯(lián)合脅迫組(NH3-N+Cd)。每個處理組設(shè)置3個平行, 每個平行15尾魚, 每天換水50%, 并用相應(yīng)母液調(diào)整至設(shè)定濃度。實(shí)驗(yàn)期間, 水溫(27±1)℃, pH (8.2±0.2),光暗比為14h∶10h, 水中溶解氧保持在5 mg/L以上,每天飽食投喂兩次(8:00和16:00), 每次投喂1h后撈出殘余飼料, 每天定時用電動虹吸泵清除糞便。分別于第0、第2、第4、第6和第8天隨機(jī)取6尾魚, 經(jīng)40 mg/L苯唑卡因麻醉后, 于冰上取肝臟組織若干,-20°C凍存。

1.3 肝臟抗氧化指標(biāo)和免疫指標(biāo)的測定

肝臟組織按照1∶9 (w/v)的比例用預(yù)冷的0.85%生理鹽水研磨勻漿, 3000 r/min離心后取上清液, 按照試劑盒說明書的要求, 分別測定肝臟TP、MDA和GSH的含量及SOD、CAT、GSH-PX、AKP、ACP和MPO的活性。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)呈現(xiàn),采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析, 并選用單因素方差分析(One-way ANOVA)和Duncan法進(jìn)行多重比較分析,P＜0.05為顯著性差異水平。

2 結(jié)果

2.1 肝臟抗氧化指標(biāo)

芙蓉鯉鯽亞急性脅迫2d后, NH3-N組和Cd組中肝臟MDA含量顯著高于對照組(P＜0.05), 分別為對照組的5.68和2.84倍, 而NH3-N+Cd組中肝臟MDA含量略高于對照組, 但差異未達(dá)到既定的顯著性水平(P＞0.05)。在脅迫4d后, 僅NH3-N+Cd組肝臟MDA含量相較于對照組顯著增加(P＜0.05), 為對照組的1.73倍, 其余兩個處理組肝臟MDA含量相較于對照組有所增加, 但未達(dá)到顯著水平(P＞0.05)。在脅迫6d后, Cd組MDA含量相較于對照組顯著增加(P＜0.05)。在脅迫8d后, NH3-N組、Cd組和NH3-N+Cd組肝臟MDA含量均顯著高于對照組, 分別為對照組的2.24、3.85和3.61倍(P＜0.05)。在整個實(shí)驗(yàn)期間, 3個處理組肝臟MDA含量在不同時間點(diǎn)整體呈現(xiàn)“升-降-升”的變化規(guī)律(圖 1), NH3-N組、Cd組和NH3-N+Cd組肝臟MDA含量分別在第2、第8和第8天達(dá)到峰值。對照組MDA含量在不同時間點(diǎn)均無顯著變化。

圖1 氨氮和鎘脅迫對芙蓉鯉鯽肝臟丙二醛含量的影響Fig. 1 The effect of ammonia nitrogen and cadmium (Cd) on malondialdehyde (MDA) content in liver of Furong crucian carp

與對照組相比, NH3-N組在2d時肝臟SOD活性達(dá)到峰值(圖 2), 為對照組的2.29倍(P＜0.05), 隨后顯著下降, 至4d時SOD活性仍顯著高于對照組(P＜0.05), 在6d時SOD活性處于最低值(P＜0.05), 在4d和6d時SOD活性分別為對照組的1.35和0.55倍, 在0和8d時SOD活性與對照組之間差異無顯著性。Cd組在0、2d、4d和8d時SOD活性與對照組之間均無顯著性差異, 在6d時SOD活性顯著高于對照組(P＜0.05), 為對照組的1.39倍。與對照組相比, NH3-N+Cd組肝臟SOD活性在6d和8d時顯著增強(qiáng)(P＜0.05), 分別為對照組的1.44和1.81倍, 在其余時間點(diǎn)均無顯著性差異(P＞0.05)。

圖2 氨氮和鎘脅迫對芙蓉鯉鯽肝臟超氧化物歧化酶活性的影響Fig. 2 The effect of ammonia nitrogen and cadmium (Cd) on superoxide dismutase (SOD) activity in liver of Furong crucian carp

芙蓉鯉鯽經(jīng)不同的脅迫后, 肝臟CAT活性整體呈現(xiàn)先下降后上升的變化趨勢(圖 3)。NH3-N組、Cd組和NH3-N+Cd組肝臟CAT活性均在2d時開始下降, 但與對照組無顯著性差異(P＞0.05), 分別在6d、4d和4d時活性最低, 顯著低于對照組(P＜0.05), 在8d時NH3-N組和Cd組CAT活性恢復(fù)至正常水平, 而NH3-N+Cd組CAT活性卻顯著高于對照組(P＜0.05)。在對照組中, 肝臟CAT活性在2d時顯著高于其他采樣點(diǎn), 表明樣品采集過程中的操作差異可能導(dǎo)致CAT在不同采樣點(diǎn)的活性差異。

圖3 氨氮和鎘脅迫對芙蓉鯉鯽肝臟過氧化氫酶活性的影響Fig. 3 The effect of ammonia nitrogen and cadmium (Cd) on catalase (CAT) activity in liver of Furong crucian carp

氨氮和鎘單一及聯(lián)合脅迫后, 芙蓉鯉鯽肝臟GSH-PX活性的變化如圖 4所示。在氨氮脅迫2d內(nèi),GSH-PX活性顯著增加(P＜0.05), 隨后顯著下降; 在氨氮脅迫8d后, GSH-PX活性恢復(fù)至對照組水平。在氨氮脅迫8d內(nèi), GSH-PX活性呈現(xiàn)波動變化的趨勢, 最大值和最小值分別出現(xiàn)在脅迫后的第2和第6天, 分別為對照組的2.52和0.69倍。在鎘脅迫6d后,肝臟GSH-PX活性相較于對照組顯著升高, 隨后在8d時降至對照組水平。氨氮和鎘聯(lián)合脅迫0—4d,肝臟GSH-PX活性保持基本穩(wěn)定, 隨后在6d和8d時GSH-PX活性持續(xù)升高, 均顯著高于對照組(P＜0.05)。

圖4 氨氮和鎘脅迫對芙蓉鯉鯽肝臟谷胱甘肽過氧化物酶活性的影響Fig. 4 The effect of ammonia nitrogen and cadmium (Cd) on glutathione peroxidase (GSH-PX) activity in liver of Furong crucian carp

如圖 5所示, 氨氮脅迫后芙蓉鯉鯽肝臟GSH含量在2d時顯著增加(P＜0.05), 為對照組的1.98倍, 在4d、6d和8d時肝臟組織中的GSH維持著較低的含量, 均顯著低于對照組(P＜0.05), 分別為對照組的0.27、0.19和0.57倍, 其中在6d時有最小值。在鎘脅迫后, 肝臟GSH含量在4d時顯著低于對照組(P＜0.05), 在其他時間點(diǎn)相較于對照組無顯著差異(P＞0.05)。在氨氮和鎘聯(lián)合脅迫后, 肝臟GSH含量在2d內(nèi)無顯著變化, 在4d時GSH含量急劇下降, 隨后在6d時快速升高, 至8d時仍保持較高的水平, GSH含量在4d、6d和8d時均與對照組有顯著差異(P＜0.05),分別為對照組的0.26、1.37和1.66倍。

圖5 氨氮和鎘脅迫對芙蓉鯉鯽肝臟谷胱甘肽含量的影響Fig. 5 The effect of ammonia nitrogen and cadmium (Cd) on glutathione (GSH) content in liver of Furong crucian carp

2.2 肝臟免疫指標(biāo)

與對照組相比, NH3-N組在2d和4d時肝臟ACP活性顯著高于對照組(P＜0.05), 分別為對照組的1.48和1.39倍, 而在0和6d時肝臟ACP活性與對照組相比無顯著性差異, 在8d時肝臟ACP活性顯著低于對照組(0.68倍)。NH3-N組肝臟ACP活性整體呈先升后降的變化趨勢(圖 6)。Cd組肝臟ACP活性在0、2d、4d和6d時略有變化, 但相較于對照組均無顯著變化(P＞0.05), 至8d時ACP活性急劇升高(P＜0.05), 為對照組的1.70倍。NH3-N+Cd組ACP活性在0、2d和4d時與對照組基本持平, 在6d和8d時ACP活性持續(xù)增強(qiáng), 分別為對照組的1.39和1.84倍(P＜0.05)。

圖6 氨氮和鎘脅迫對芙蓉鯉鯽肝臟酸性磷酸酶活性的影響Fig. 6 The effect of ammonia nitrogen and cadmium (Cd) on acid phosphatase (ACP) activity in liver of Furong crucian carp

與對照組相比, 氨氮脅迫2d后AKP活性急劇升高, 在4d時AKP活性顯著降低, 至8d時仍維持著較低的活性水平(圖 7)。NH3-N組肝臟AKP活性在2d、4d、6d和8d時相較于對照組均存在顯著性差異(P＜0.05), 分別為對照組的6.58、0.39、0.51和0.57倍, 其中2d時達(dá)到峰值, 4d時有最小值。Cd組肝臟AKP活性在0—4d內(nèi)緩慢降低, 但與對照組差異不顯著(P＞0.05), 在6d時AKP活性顯著降低(P＜0.05), 有最小值, 至8d時AKP活性顯著升高, 為對照組的1.27倍。在0—8d內(nèi), Cd組肝臟AKP活性呈現(xiàn)先下降后升高的變化趨勢。與對照組相比,NH3-N+Cd組芙蓉鯉鯽肝臟AKP活性在8d時顯著增強(qiáng)(1.81倍), 0—6d內(nèi)AKP活性無明顯變化。

圖7 氨氮和鎘脅迫對芙蓉鯉鯽肝臟堿性磷酸酶活力的影響Fig. 7 The effect of ammonia nitrogen and cadmium (Cd) on alkaline phosphatase activity (AKP) in liver of Furong crucian carp

與對照組相比, 3個處理組芙蓉鯉鯽肝臟MPO活性均大致呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢, 脅迫2d時均達(dá)到最大值(圖 8)。NH3-N組MPO活性在2d、4d和6d時顯著高于對照組(P＜0.05), 分別為對照組的7.35、4.58和3.16倍, 至8d時恢復(fù)至對照組水平。Cd組MPO活性在2d和4d時顯著高于對照組(P＜0.05), 分別為對照組的7.54和6.98倍, 在6d和8d時MPO活性略低于對照組, 但未達(dá)到顯著性水平(P＞0.05)。NH3-N+Cd組MPO活性在2d和8d時顯著高于對照組(P＜0.05), 分別為對照組的10.11和6.83倍, 在4d和6d時MPO活性略高于對照組, 均未達(dá)到顯著性水平(P＞0.05)。

圖8 氨氮和鎘脅迫對芙蓉鯉鯽肝臟髓過氧化物酶活性的影響Fig. 8 The effect of ammonia nitrogen and cadmium (Cd) on myeloperoxidase (MPO) activity in liver of Furong crucian carp

3 討論

3.1 氨氮和鎘脅迫對芙蓉鯉鯽氧化應(yīng)激狀態(tài)的影響

魚體在遭受不利環(huán)境因子(氨氮、重金屬等)時機(jī)體會產(chǎn)生大量的活性氧(Reactive oxygen species,ROS), 當(dāng)超出生物體清除能力時, 過多的ROS會誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化, 進(jìn)而引發(fā)氧化應(yīng)激, 最終導(dǎo)致DNA氧化損傷、蛋白質(zhì)失活和線粒體功能失調(diào), 嚴(yán)重的導(dǎo)致死亡。丙二醛(MDA)作為ROS引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用的終產(chǎn)物, 其含量的變化可反映出機(jī)體脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的程度, 是動物體氧化應(yīng)激和細(xì)胞氧化損傷靈敏的生物標(biāo)志物[18]。研究發(fā)現(xiàn), 亞硝酸鹽[19]、低氧[20]、運(yùn)輸[21]及擁擠脅迫[3]均可導(dǎo)致魚體內(nèi)MDA含量的升高, 使動物處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。在本研究中, 氨氮和鎘單一及聯(lián)合脅迫后, 在2d、4d、6d和8d時芙蓉鯉鯽肝臟MDA含量均不同程度的增加, 并維持著較高的水平, 這表明采用水源性亞急性脅迫的方法適宜于建立芙蓉鯉鯽氧化應(yīng)激模型。余秋果[16]指出, 稀有鮈鯽(Gobiocypris rarus)在銅、鎘及其聯(lián)合暴露后, 肝臟MDA含量顯著升高, 魚體產(chǎn)生了氧化應(yīng)激, 這與本研究結(jié)果一致。

3.2 氨氮和鎘脅迫對芙蓉鯉鯽氧化防御系統(tǒng)的影響

魚類在長期的進(jìn)化過程中已演化出一套完整的抗氧化系統(tǒng)以抵御外界的不利刺激。超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)構(gòu)筑了魚類抵御氧化應(yīng)激的第一道防線, 是魚體維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要酶類。SOD能夠高效催化魚體內(nèi)的ROS, 并通過歧化反應(yīng)將其轉(zhuǎn)化為過氧化氫(H2O2)和氧氣(O2)。H2O2仍具有一定的氧化性, 可被CAT和GSH-PX進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為無毒無害的水(H2O)和O2, 以維持魚體內(nèi)氧化平衡狀態(tài)的穩(wěn)定[22]。在本實(shí)驗(yàn)中, 芙蓉鯉鯽肝臟SOD活性在氨氮脅迫2d和4d時顯著升高, 在鎘脅迫6d時顯著高于對照組(P＜0.05), 在氨氮和鎘聯(lián)合脅迫6d和8d時顯著升高。研究發(fā)現(xiàn), 安全濃度下的鎘、氨氮單一脅迫能夠誘導(dǎo)肝臟SOD活性的升高[23—25], 這與本研究結(jié)果基本一致。CAT和GSHPX是魚體內(nèi)以H2O2為底物的解毒酶, 是機(jī)體解毒防御機(jī)制、抗逆性及抗氧化功能調(diào)節(jié)的重要組成部分。在本研究中, 肝臟GSH-PX活性在氨氮脅迫2d和4d時顯著增強(qiáng), 在6d時顯著降低, 在鎘脅迫6d時顯著升高, 在氨氮和鎘聯(lián)合脅迫6d和8d時顯著升高, 這與韓春艷等[4]報(bào)道的結(jié)果相符。CAT活性在所有處理組中均呈現(xiàn)出先降低后升高的變化趨勢, 這與前期研究結(jié)果基本一致, 如中華鱘(Acipenser sinensis)[26]、大鱗副泥鰍(Paramisgurnus dabryanus)[2]、黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)[11]等。本研究結(jié)果表明, 氨氮和鎘及其聯(lián)合脅迫條件下, 芙蓉鯉鯽肝臟CAT和GSH-PX均被成功激活, 參與了機(jī)體對外源性毒性物質(zhì)的解毒過程。安全濃度的氨氮脅迫下肝臟GSH-PX活性呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢, 而CAT表現(xiàn)出相反的變化規(guī)律, 這可能與酶促反應(yīng)的底物親和性有關(guān)。研究表明, GSH-PX對反應(yīng)底物H2O2的親和力高于CAT, 其在H2O2濃度非常低時也能與之反應(yīng)[27]。谷胱甘肽(GSH)是一種含有巰基的三肽蛋白, 是生物體內(nèi)清除ROS非常重要的非酶抗氧化劑, 在清除自由基,緩解氧化應(yīng)激, 保護(hù)細(xì)胞完整性, 維持細(xì)胞代謝及解毒等生理過程中發(fā)揮著重要作用[24,28,29]。在本實(shí)驗(yàn)中, 氨氮脅迫后肝臟GSH含量在2d時顯著升高,在2d、6d和8d時明顯降低, 這說明短時間的氨氮刺激誘使機(jī)體表現(xiàn)出一定的毒物興奮效應(yīng), 但隨著暴露時間的延長, 機(jī)體內(nèi)積聚的氨氮大量消耗抗氧化物質(zhì)GSH以緩解氨氮毒性, 從而導(dǎo)致GSH缺乏或耗竭。Hao等[30]報(bào)道了氨氮脅迫后紅鯽(Carassius auratusred var.)肝臟GSH含量呈先急劇升高后顯著降低的變化趨勢, 這與本研究結(jié)果相符。研究表明,重金屬鎘能與GSH直接結(jié)合形成Cd(GS)2復(fù)合物而流出細(xì)胞, 在緩解鎘毒性的同時降低了細(xì)胞內(nèi)自由基清除劑GSH的含量[31,32]。在本研究中, 肝臟GSH含量在鎘脅迫及氨氮和鎘聯(lián)合脅迫4d時顯著減少,這表明GSH含量的減少是機(jī)體解毒過程中的一種適應(yīng)性保護(hù)機(jī)制。

3.3 氨氮和鎘脅迫對芙蓉鯉鯽免疫能力的影響

酸性磷酸酶(ACP)和堿性磷酸酶(AKP)是存在于魚類等水生動物溶酶體和內(nèi)膜系統(tǒng)內(nèi)的磷酸酶,是水生動物體內(nèi)重要的免疫標(biāo)志酶和解毒酶類, 廣泛參與動物體內(nèi)細(xì)胞吞噬、免疫反應(yīng)、能量代謝調(diào)節(jié)、細(xì)胞損傷與修復(fù)等生命過程, 既是動物體內(nèi)解毒體系的重要組成部分, 也是動物體免疫機(jī)能和健康狀況的重要參照指標(biāo)[33—35]。在本研究中, 氨氮和鎘單一及聯(lián)合脅迫后ACP活性出現(xiàn)不同程度的增強(qiáng), 而且鎘單一脅迫及氨氮和鎘聯(lián)合脅迫在8d時誘導(dǎo)AKP活性的增強(qiáng), 這表明化學(xué)性環(huán)境污染物激活了磷酸酶介導(dǎo)的芙蓉鯉鯽的非特異性免疫系統(tǒng)。研究指出, AKP的活性由最適pH決定, 機(jī)體組織損傷時AKP活性升高, 當(dāng)組織嚴(yán)重?fù)p傷時, 其活性降低[36]。本研究發(fā)現(xiàn), 氨氮脅迫后AKP活性在2d時顯著升高, 在4d、6d和8d時顯著降低, 這表明水源性氨氮脅迫改變了芙蓉鯉鯽體內(nèi)的酸堿度, 對組織器官的結(jié)構(gòu)可能造成嚴(yán)重?fù)p傷。此外, 生物體應(yīng)對外界不利刺激時需要消耗更多的能量, 以滿足生物體應(yīng)激代謝的能量需求。因此, AKP活性的升高是芙蓉鯉鯽應(yīng)對外界不利因素的一種能量代償效應(yīng), 也是芙蓉鯉鯽耐受氨氮脅迫的一種適應(yīng)機(jī)制,這與封琦等[37]的研究結(jié)果基本一致。髓過氧化物酶(MPO)主要存在于人和動物體內(nèi)的中性粒細(xì)胞中, 具有維持機(jī)體免疫自穩(wěn)態(tài)的平衡、清除氧自由基、殺滅病原微生物等多種生物活性, 是機(jī)體先天免疫和氧化應(yīng)激保護(hù)的重要免疫因子[38,39]。在本研究中, 氨氮和鎘單一及聯(lián)合脅迫均導(dǎo)致肝臟MPO活性顯著增強(qiáng), 這表明外源性化學(xué)物質(zhì)激活了芙蓉鯉鯽的非特異性免疫系統(tǒng), 提高了機(jī)體抵御外界物質(zhì)干擾和氧化損傷的能力, 有利于維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。

3.4 芙蓉鯉鯽對氨氮和鎘的差異性生理響應(yīng)

肝臟是魚類重要的解毒器官和重金屬蓄積靶器官, 外源性化學(xué)物質(zhì)如氨氮、鎘等可以通過鰓、皮膚、腸道等多種途徑進(jìn)入魚體, 并隨著循環(huán)系統(tǒng)擴(kuò)散、轉(zhuǎn)運(yùn), 進(jìn)而影響靶器官的生理功能和物質(zhì)代謝。本研究發(fā)現(xiàn), NH3-N組ACP、SOD、GSH-PX和GSH的含量變化早于Cd組, 表明氨氮相較于鎘更易擴(kuò)散進(jìn)入魚體, 更早地誘導(dǎo)化學(xué)脅迫, 這可能是由氨氮和鎘的理化性質(zhì)所決定的。相較于氨氮脅迫, 芙蓉鯉鯽肝臟AKP、SOD、GSH-PX和GSH含量在鎘脅迫4d或6d后才出現(xiàn)顯著變化, 這從側(cè)面反映出氨氮對芙蓉鯉鯽更多地表現(xiàn)出滲透毒性, 鎘對芙蓉鯉鯽更多地表現(xiàn)出蓄積毒性。研究發(fā)現(xiàn), 當(dāng)兩種化學(xué)性污染物同時作用于機(jī)體時, 其往往通過生物體不同的作用機(jī)制和代謝調(diào)節(jié)等多個途徑表現(xiàn)出較為復(fù)雜的毒性效應(yīng)[40]。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出, 在脅迫初期, 氨氮脅迫對芙蓉鯉鯽的抗氧化指標(biāo)和免疫指標(biāo)產(chǎn)生了不同程度的影響, 而隨著脅迫時間的延長, 氨氮脅迫對芙蓉鯉鯽的抗氧化指標(biāo)和免疫指標(biāo)的影響有所減弱, 相反鎘脅迫及氨氮和鎘聯(lián)合脅迫對芙蓉鯉鯽某些抗氧化指標(biāo)(如SOD、GSH)和免疫指標(biāo)(如ACP、AKP)的擾動效應(yīng)強(qiáng)于氨氮脅迫, 這表明鎘脅迫及氨氮和鎘聯(lián)合脅迫可能在芙蓉鯉鯽體內(nèi)呈現(xiàn)出時間累積效應(yīng)。因此, 抗氧化酶和免疫酶活性的變化是生物體對外界不利刺激的主動適應(yīng), 既表現(xiàn)出魚體的抗逆能力, 也反映了環(huán)境因素引發(fā)的魚體脅迫生理的變化規(guī)律。

綜上所述, 本研究運(yùn)用靜態(tài)毒理學(xué)試驗(yàn)法成功構(gòu)建了芙蓉鯉鯽氧化應(yīng)激模型。研究結(jié)果表明, 氨氮和鎘單一及聯(lián)合脅迫均使芙蓉鯉鯽處于氧化脅迫狀態(tài), 改變了魚體內(nèi)的氧化平衡狀態(tài), 激活了芙蓉鯉鯽的抗氧化防御系統(tǒng), 活化了AKP、MPO等免疫酶介導(dǎo)的先天免疫反應(yīng)以增強(qiáng)魚體的耐逆能力。本研究是對實(shí)際復(fù)合環(huán)境條件下水生動物的生理響應(yīng)機(jī)制和解毒機(jī)制的初步探索, 至于復(fù)合條件下(脅迫種類、時間)對生物體聯(lián)合作用效應(yīng)的分子機(jī)制有待進(jìn)一步探究。