不同運(yùn)動(dòng)方式對(duì)小鼠心臟重塑過(guò)程中基因表達(dá)的生物信息學(xué)分析

饒志堅(jiān) 鄭莉芳 于濤 史仍飛

1 上海師范大學(xué)體育學(xué)院（上海 200234）

2 國(guó)家體育總局體育科學(xué)研究所（北京 100061）

3 上海大學(xué)體育學(xué)院（上海 200444）

4 上海體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)科學(xué)學(xué)院（上海 200438）

運(yùn)動(dòng)是降低心血管疾病的發(fā)病率和死亡率的重要途徑，此外，運(yùn)動(dòng)也是心臟康復(fù)中的重要內(nèi)容[1-3]。除了這些效果外，運(yùn)動(dòng)還可直接促進(jìn)心臟發(fā)生生理性重塑。這種為了匹配增加的工作負(fù)荷，由長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的心臟體積變大的現(xiàn)象通常稱(chēng)為“運(yùn)動(dòng)員心臟”，其特征為心肌細(xì)胞變大、新生血管增多、心功能增強(qiáng)或不變[4]。運(yùn)動(dòng)員心臟是為了適應(yīng)運(yùn)動(dòng)而產(chǎn)生的一種生理性變化，它與一些疾?。ㄈ绺哐獕?、心肌梗死等）導(dǎo)致的病理性心肌肥大是截然不同的，病理性的心肌肥大通常伴隨著心功能下降[5，6]。盡管在結(jié)構(gòu)上生理性心肌肥大和病理性心肌肥大有相似的心肌細(xì)胞體積變大，然而在細(xì)胞分子層面上兩者在上游信號(hào)通路的激活和下游轉(zhuǎn)錄反應(yīng)是不同的[5，6]。為了揭示兩者不同的發(fā)生機(jī)制，諸多學(xué)者通過(guò)測(cè)序、微陣列等手段探究了生理性心肌肥大和病理性心肌肥大發(fā)生過(guò)程中心肌基因表達(dá)的差異[7，8]，以尋找潛在的干預(yù)靶點(diǎn)來(lái)促進(jìn)心臟健康。運(yùn)動(dòng)雖然可以誘導(dǎo)生理性心肌重塑，但是不同的運(yùn)動(dòng)方式對(duì)心肌重塑的影響有所不同。類(lèi)似地，我們也可以通過(guò)對(duì)比分析不同運(yùn)動(dòng)方式對(duì)心臟重塑過(guò)程中基因表達(dá)的差異，來(lái)揭示不同運(yùn)動(dòng)方式對(duì)心肌重塑具有不同效果的潛在機(jī)制。

在實(shí)驗(yàn)研究過(guò)程中，主要采用三種運(yùn)動(dòng)方式來(lái)誘導(dǎo)生理性心肌肥大：游泳運(yùn)動(dòng)、跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)和自由轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)。跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)的優(yōu)勢(shì)在于可以調(diào)節(jié)運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度、坡度和運(yùn)動(dòng)時(shí)間來(lái)形成多種運(yùn)動(dòng)方案，研究報(bào)道依據(jù)運(yùn)動(dòng)方案的不同，跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)可使大鼠和小鼠的心肌質(zhì)量增加5%～24%[9-11]。此外，至少需要經(jīng)過(guò)3～4周的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)才可使心肌質(zhì)量顯著增加。游泳運(yùn)動(dòng)是將小鼠或大鼠放在泳池中，通過(guò)調(diào)節(jié)游泳時(shí)間和負(fù)重來(lái)調(diào)節(jié)運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度。現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道，游泳運(yùn)動(dòng)可使心臟質(zhì)量增加30%～50%[12-14]，總體上效果要優(yōu)于跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)。跑臺(tái)和游泳運(yùn)動(dòng)是一種強(qiáng)迫性運(yùn)動(dòng)，因此，這兩種運(yùn)動(dòng)可能并不是單純的生理因素導(dǎo)致心肌生長(zhǎng)，還有可能存在部分的應(yīng)激因素導(dǎo)致心肌生長(zhǎng)。故而有些學(xué)者會(huì)采用自由轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)來(lái)誘導(dǎo)生理性心肌肥大，文獻(xiàn)報(bào)道經(jīng)過(guò)3～4周以上的轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)后，小鼠和大鼠的心肌質(zhì)量可增加5%～20%（依據(jù)飲食、性別、年齡等因素的不同）[15，16]。值得注意的是，研究報(bào)道自由轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)并不會(huì)因增加運(yùn)動(dòng)時(shí)間和負(fù)荷而進(jìn)一步增加心肌質(zhì)量[17]?？梢?jiàn)，三種運(yùn)動(dòng)方式在誘導(dǎo)生理性心肌肥大的效果上是有所不同的。

鑒于上述，為了進(jìn)一步揭示不同運(yùn)動(dòng)方式導(dǎo)致不同的運(yùn)動(dòng)心臟重塑的因素，本研究對(duì)不同運(yùn)動(dòng)方式誘導(dǎo)的心臟重塑過(guò)程中基因表達(dá)的情況進(jìn)行分析，以期更加深入地了解運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)生理性心肌重塑的發(fā)生機(jī)制，為實(shí)踐運(yùn)動(dòng)促進(jìn)心臟健康提供理論依據(jù)。

1 研究方法

1.1 數(shù)據(jù)下載與處理

在基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)（gene expression omnibus，GEO）中檢索運(yùn)動(dòng)心臟重塑相關(guān)數(shù)據(jù)集，篩選條件為運(yùn)動(dòng)干預(yù)時(shí)間一樣、研究對(duì)象的種屬及性別相同，整理發(fā)現(xiàn)僅有雄性小鼠游泳運(yùn)動(dòng)（swimming，SW）和雄性小鼠自由轉(zhuǎn)輪（wheel running，WR）兩種運(yùn)動(dòng)方式干預(yù)的數(shù)據(jù)集符合條件。因此，下載兩組數(shù)據(jù)GSE77（游泳運(yùn)動(dòng)）和GSE36330（自由轉(zhuǎn)輪）后，從兩組數(shù)據(jù)中分別提取小鼠游泳3 周組及其對(duì)照組，以及小鼠自由轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)3 周組及其對(duì)照組，然后對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。如果有多個(gè)探針映射到同一個(gè)基因中，則用平均表達(dá)值來(lái)表示該基因的表達(dá)值。

1.2 篩選差異表達(dá)基因

在Rstudio中使用limma包分別處理兩組數(shù)據(jù)得到游泳運(yùn)動(dòng)和自由轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)后差異表達(dá)的基因，采用t檢驗(yàn)篩選差異表達(dá)的基因，篩選標(biāo)準(zhǔn)為P＜0.05，且log2 fold change＞ Mean（log2 fold change）+ 2SD（log2 fold change）。然后根據(jù)log2 fold change 的值進(jìn)行排序，分別選取最大的100個(gè)上調(diào)基因和100個(gè)下調(diào)基因繪制熱圖。同時(shí)，將所有差異表達(dá)的基因用火山圖進(jìn)行可視化。

1.3 GO和KEGG功能富集分析

采用R studio 中的enrichplot 包和ggplot2 包分別對(duì)兩種運(yùn)動(dòng)后小鼠心肌中差異表達(dá)的基因進(jìn)行GO（gene ontology）和KEGG（kyotoencyclopedia of genes and genomes）富集分析。P＜0.05 代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)游泳后小鼠心肌差異基因的GO 富集結(jié)果用條形圖可視化，并展示差異基因與富集結(jié)果的關(guān)系圖；對(duì)自由轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)后小鼠心肌差異基因的GO 富集結(jié)果用氣泡圖可視化，并展示差異基因與富集結(jié)果的關(guān)系圖。

1.4 對(duì)比兩種運(yùn)動(dòng)后心肌差異基因

對(duì)比游泳運(yùn)動(dòng)后小鼠心肌中上調(diào)及下調(diào)基因與自由轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)后小鼠心肌中上調(diào)及下調(diào)基因是否有交集，在R studio 中采用VennDiagram 包繪制韋恩圖，并展示所有有交集的基因名稱(chēng)。

1.5 基因互作分析

采用R studio 中的STRINGdb 包對(duì)不同運(yùn)動(dòng)方式后小鼠心肌中的差異基因進(jìn)行互作分析，并用環(huán)形圖展示網(wǎng)絡(luò)互作關(guān)系，互作得分閾值設(shè)為400，連接點(diǎn)數(shù)大于5 則在圖中顯示基因名。

1.6 基于差異基因分析轉(zhuǎn)錄因子

本研究在Rstudio 中采用RcisTarget 包分別對(duì)游泳和自由轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)后小鼠心肌中差異基因的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行富集分析。

2 結(jié)果

2.1 游泳運(yùn)動(dòng)后小鼠心肌中差異表達(dá)的基因

游泳運(yùn)動(dòng)的數(shù)據(jù)通過(guò)limma 包分析后，根據(jù)log2 fold change值展示基因表達(dá)熱圖（圖1a）。隨后按實(shí)驗(yàn)方法所述篩選差異基因，經(jīng)計(jì)算得出cutoff log2 fold change=1.3，因此，游泳組差異表達(dá)基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)是P＜0.05 且log2 fold change＞1.3。根據(jù)這一篩選標(biāo)準(zhǔn)，本研究共發(fā)現(xiàn)游泳運(yùn)動(dòng)后心肌中差異表達(dá)的基因有275個(gè)，其中129個(gè)基因上調(diào)，146個(gè)基因下調(diào)（圖1b）。

2.2 自由轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)后小鼠心肌中差異表達(dá)的基因

自由轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)的數(shù)據(jù)通過(guò)limma 包分析后，根據(jù)log2 fold change值展示基因表達(dá)熱圖（圖1c）。隨后按實(shí)驗(yàn)方法所述篩選差異基因，經(jīng)計(jì)算得出cutoff log2 fold change=0.36，因此，自由轉(zhuǎn)輪組差異表達(dá)基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)是P＜0.05 且log2 fold change＞0.36。根據(jù)這一篩選標(biāo)準(zhǔn)，本研究共發(fā)現(xiàn)自由轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)后小鼠心肌中差異表達(dá)的基因有856個(gè)，其中559個(gè)基因上調(diào)，297個(gè)基因下調(diào)（圖1d）。

圖1 運(yùn)動(dòng)后心肌中的差異基因

2.3 游泳運(yùn)動(dòng)后小鼠心肌差異基因的GO和KEGG 功能富集分析

隨后本研究對(duì)游泳運(yùn)動(dòng)后小鼠心肌中275 個(gè)差異基因進(jìn)行了GO 功能富集分析，其中細(xì)胞組分（cellular component，CC）富集結(jié)果主要是受體復(fù)合物、磷脂酰肌醇3 激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）復(fù)合物、突觸部分、海馬CA3區(qū)苔蘚纖維突觸和遠(yuǎn)端突觸等（如圖2a所示），差異基因與CC富集結(jié)果的關(guān)系圖如圖2b所示。生物過(guò)程（biological process，BP）富集結(jié)果主要涉及：血管生成的調(diào)節(jié)及其負(fù)向調(diào)節(jié)、血管形態(tài)發(fā)生的負(fù)向調(diào)節(jié)和血管發(fā)育的調(diào)節(jié)及其負(fù)向調(diào)節(jié)（如圖2c所示），差異基因與BP 富集結(jié)果的關(guān)系如圖2d 所示。分子功能（molecular function，MF）富集結(jié)果主要涉及：受體配體活性、離子受體活性、蛋白磷酸化氨基酸結(jié)合、磷酸蛋白結(jié)合和糖磷酸酶活性等（如圖2e所示），差異基因與MF富集結(jié)果的關(guān)系圖如圖2f所示。

圖2 游泳運(yùn)動(dòng)后心肌中差異基因的GO功能富集分析

圖2 游泳運(yùn)動(dòng)后心肌中差異基因的GO功能富集分析（續(xù)）

此外，KEGG富集結(jié)果分析主要富集在鞘糖脂合成-神經(jīng)節(jié)系、AMP 活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）信號(hào)通路、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號(hào)通路和癌癥相關(guān)microRNAs 等（如圖3a 所示），差異基因與KEGG富集結(jié)果的關(guān)系圖如圖3b所示。

圖3 游泳運(yùn)動(dòng)后心肌中差異基因的KEGG通路富集分析

2.4 自由轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)后小鼠心肌差異基因的GO 和KEGG功能富集分析

本研究對(duì)自由轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)后小鼠心肌中856 個(gè)差異基因進(jìn)行了GO 功能富集分析，其中CC 富集結(jié)果主要是：細(xì)胞前緣、核斑點(diǎn)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶復(fù)合物、細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性蛋白激酶全酶復(fù)合物和MCM復(fù)合物等（如圖4a所示），差異基因與CC富集結(jié)果的關(guān)系如圖4b 所示。BP 富集結(jié)果主要涉及：病毒反應(yīng)、病毒防御反應(yīng)、干擾素g反應(yīng)、干擾素b反應(yīng)和干擾素b細(xì)胞反應(yīng)等（如圖4c所示），差異基因與BP富集結(jié)果的關(guān)系如圖4d 所示。MF 富集結(jié)果主要涉及：GTP 酶活性、多肽調(diào)節(jié)因子活性、增強(qiáng)子結(jié)合、金屬蛋白酶抑制因子活性和死亡結(jié)構(gòu)域結(jié)合等（如圖4e所示），差異基因與MF富集結(jié)果的關(guān)系如圖4f所示。

圖4 自由轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)后小鼠心肌中差異基因的GO功能富集分析

圖4 自由轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)后小鼠心肌中差異基因的GO功能富集分析（續(xù)）

圖4 自由轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)后小鼠心肌中差異基因的GO功能富集分析（續(xù)）

此外，KEGG 富集結(jié)果分析主要富集在細(xì)胞周期、補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)、百日咳、p53信號(hào)通路和DNA復(fù)制等（如圖5a 所示），差異基因與KEGG 富集結(jié)果的關(guān)系圖如圖5b所示。

2.5 游泳和自由轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)后小鼠心肌中差異基因的對(duì)比

為了觀察游泳和自由轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)后小鼠心肌中差異表達(dá)基因的異同，本研究將游泳后上調(diào)基因（SM_Up）、游泳后下調(diào)基因（SM_Down）、自由轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)后上調(diào)基因（WR_Up）、自由轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)后下調(diào)基因（SM_Down）進(jìn)行交互分析，分析結(jié)果如圖6所示。結(jié)果顯示，兩種運(yùn)動(dòng)后小鼠心肌中共同上調(diào)的基因有8 個(gè)，分別是：Tmem176a、Snca、Zik1、Lgals3、C1qb、Atf6b、Cxcl10、Rom1；兩種運(yùn)動(dòng)后小鼠心肌中共同下調(diào)的基因有10個(gè)，分 別 是：Pcf11、C77405、C78344、Klf9、Kdm5a、Crnkl1、Rock1、Dnajc3、Lgals4、Sp4；游泳后下調(diào)而自由轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)后小鼠心肌中上調(diào)的基因有7 個(gè)，分別是：Lst1、Slc39a6、Emr1、Ncs1、Psmb9、Inmt、Mx1。

圖6 差異基因韋恩圖

2.6 差異基因網(wǎng)絡(luò)互作分析

本研究分別對(duì)游泳和自由轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)后小鼠心肌中的差異基因進(jìn)行了網(wǎng)絡(luò)互作分析，并在R studio 中將結(jié)果可視化，如圖7a 和7b 所示。在圖中連線越多則節(jié)點(diǎn)越大，而連線越粗則互作得分越高，僅顯示節(jié)點(diǎn)數(shù)大于5 的基因的名稱(chēng)。此外，在可視化過(guò)程中我們?nèi)コ藛我换プ麝P(guān)系和游離的互作關(guān)系。結(jié)果顯示，游泳運(yùn)動(dòng)后有2 個(gè)節(jié)點(diǎn)數(shù)大于5 的基因，它們分別是：Agt和Pi3kr2；自由轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)后有7 個(gè)節(jié)點(diǎn)數(shù)大于5 的基因，它們分別是：Mad2l1、Spc25、Cdk1、Mcm6、Tipin、Cks2和Cd68。

圖7 差異基因網(wǎng)絡(luò)互作圖

2.7 差異基因的轉(zhuǎn)錄因子富集分析

最后本研究分別對(duì)游泳和自由轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)后小鼠心肌中的差異基因進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄因子富集分析，結(jié)果顯示，游泳運(yùn)動(dòng)后小鼠心肌中的差異表達(dá)基因富集到的前3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子分別是 predrem_nrMotif2039、predrem_nrMotif1919 和 dbcorrdb_TBP_ENOSR000EHA_1_m2，如圖8a 所示；自由轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)后小鼠心肌中的差異表達(dá)基因富集到的前3 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子分別是：jaspar_MA0050.2、homer_GAAAGTGAAAGT_IRF1 和taipale_cty_melth_IRF7_NNGAAANYGAAANYN_eDBD_m elth_repr，如圖8b所示。

圖8 轉(zhuǎn)錄因子富集分析

3 分析與討論

本研究通過(guò)檢索GEO 發(fā)現(xiàn)3 周游泳運(yùn)動(dòng)（GSE77）和3周自由轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)（GSE36330）的微陣列數(shù)據(jù)檢測(cè)了成年雄性小鼠心肌中的基因表達(dá)情況，未發(fā)現(xiàn)3 周跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)后關(guān)于成年雄性小鼠心肌的微陣列數(shù)據(jù)。因此，本文對(duì)比了游泳和自由轉(zhuǎn)輪這兩種運(yùn)動(dòng)方式對(duì)運(yùn)動(dòng)心臟重塑過(guò)程中基因表達(dá)的影響。

通過(guò)對(duì)兩個(gè)數(shù)據(jù)集的分析，本研究發(fā)現(xiàn)游泳運(yùn)動(dòng)后小鼠心肌中有275個(gè)差異表達(dá)基因，其中129個(gè)基因上調(diào)，146 個(gè)基因下調(diào)；而自由轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)后小鼠心肌中差異表達(dá)的基因有856個(gè)，其中559個(gè)基因上調(diào)、297個(gè)基因下調(diào)。從數(shù)量上來(lái)看，自由轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)后心肌中差異表達(dá)的基因多于游泳運(yùn)動(dòng)。隨后本研究分別對(duì)這些差異基因進(jìn)行了功能富集，從生物過(guò)程的富集情況來(lái)看，兩者截然不同，游泳運(yùn)動(dòng)后小鼠心肌中的差異基因主要富集在血管生成和發(fā)育，而自由轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)后小鼠心肌中的差異基因主要富集在病毒反應(yīng)。大量文獻(xiàn)報(bào)道運(yùn)動(dòng)可促進(jìn)心肌血管生成，本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)后心臟重塑過(guò)程中心肌毛細(xì)血管數(shù)量及毛細(xì)血管腔體積密度和表面積密度均出現(xiàn)了顯著性增加[18]。本研究表明游泳運(yùn)動(dòng)后小鼠心肌中的差異表達(dá)基因可能參與了運(yùn)動(dòng)心臟重塑過(guò)程中血管生成和發(fā)育。然而，令人意外的是，自由轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)后心肌中差異表達(dá)基因的功能富集在了病毒反應(yīng)，包括干擾素-b 和-g 反應(yīng)，且本研究結(jié)果顯示參與病毒反應(yīng)的大部分基因的表達(dá)水平在自由轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)后升高，如圖4d所示。盡管前期也有報(bào)道長(zhǎng)期中強(qiáng)度有氧運(yùn)動(dòng)可增強(qiáng)機(jī)體免疫力，Zamani 等[19]也報(bào)道中強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)會(huì)刺激外周血中的單核細(xì)胞生成更多的干擾素-g 和白介素-12（interleukin-12，IL-12），但目前沒(méi)有文獻(xiàn)報(bào)道運(yùn)動(dòng)心臟重塑過(guò)程中會(huì)伴隨著病毒反應(yīng)增強(qiáng)。因此，目前尚不清楚自由轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的心臟重塑過(guò)程中上調(diào)的這些病毒反應(yīng)相關(guān)的基因及其調(diào)節(jié)的下游因子是否會(huì)釋放到外周并隨著循環(huán)作用于全身。此外，轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)心肌病毒反應(yīng)的機(jī)制也尚不清楚。

為了進(jìn)一步對(duì)比游泳運(yùn)動(dòng)和自由轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)對(duì)小鼠心肌基因表達(dá)的影響，本研究將兩者的上調(diào)和下調(diào)基因進(jìn)行了交互分析，結(jié)果顯示兩者共同上調(diào)的基因有8個(gè)，共同下調(diào)的基因有10個(gè)?？紤]到兩種運(yùn)動(dòng)方式都可以誘導(dǎo)生理性心肌重塑，本研究查看了兩者共同上調(diào)的8個(gè)基因，然而在這8個(gè)基因中并未發(fā)現(xiàn)促進(jìn)心肌細(xì)胞生長(zhǎng)的基因，提示兩種運(yùn)動(dòng)方式誘導(dǎo)的心臟重塑可能存在著不同的分子機(jī)制。因此，通過(guò)對(duì)不同運(yùn)動(dòng)方式誘導(dǎo)的心肌中差異基因取交集來(lái)獲取運(yùn)動(dòng)心臟重塑的關(guān)鍵基因可能并不是一個(gè)理想的方法。

為進(jìn)一步明確游泳運(yùn)動(dòng)和自由轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)在誘導(dǎo)心臟重塑過(guò)程中不同的分子機(jī)制，本研究分別對(duì)兩者的差異表達(dá)基因進(jìn)行了調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析，并篩選出兩者的關(guān)鍵基因。本研究發(fā)現(xiàn)游泳運(yùn)動(dòng)后心臟重塑的關(guān)鍵基因是血管緊張素原（angiotensinogen，Agt）和Pik3r2。Agt 最終可生成血管緊張素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，AngⅡ），對(duì)于血管而言，AngⅡ具有很強(qiáng)的縮血管作用從而增加心臟的前負(fù)荷及后負(fù)荷。此外，文獻(xiàn)報(bào)道AngⅡ還可直接作用于心肌細(xì)胞，并導(dǎo)致心肌重塑。AngⅡ通過(guò)與血管緊張素Ⅱ-1 型受體（angiotensinⅡtype 1 receptor，AT1R）結(jié)合激活G 蛋白耦聯(lián)受體，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白合成和細(xì)胞生長(zhǎng)。但是，過(guò)量的AngⅡ會(huì)導(dǎo)致心肌由生理性肥大轉(zhuǎn)為病理性肥大，與此同時(shí)AT1R的表達(dá)水平也會(huì)顯著升高[20]。本研究發(fā)現(xiàn)游泳運(yùn)動(dòng)后小鼠心肌中Agt表達(dá)水平升高，那么在運(yùn)動(dòng)過(guò)程中，AngⅡ/AT1R這一病理性信號(hào)通路將會(huì)發(fā)生怎樣的變化？Li等[21]報(bào)道8周跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)后心肌中AngⅡ的表達(dá)水平顯著升高，同時(shí)他們發(fā)現(xiàn)AT1R的數(shù)量及親和力均顯著下降，因而運(yùn)動(dòng)后高水平的AngⅡ并沒(méi)有導(dǎo)致心肌病理性重塑。但是運(yùn)動(dòng)后心肌中Agt 水平升高并未導(dǎo)致病理性心肌重塑的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)游泳運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)心臟重塑過(guò)程中的另一個(gè)關(guān)鍵基因Pik3r2（P85b）表達(dá)水平顯著上升。Pik3r2 是PI3K 復(fù)合物的亞基之一，其表達(dá)水平上調(diào)后可負(fù)向調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路，而這條通路被證實(shí)是心肌細(xì)胞生長(zhǎng)的重要信號(hào)通路[14]。此外，Pik3ca（P110a）是PI3K 復(fù)合物的另一個(gè)亞基，它活化后可調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和存活。本研究發(fā)現(xiàn)游泳運(yùn)動(dòng)后心肌中Pik3ca 的表達(dá)水平顯著下降（圖2b）。綜合來(lái)看，本研究結(jié)果提示，3 周游泳運(yùn)動(dòng)后心肌中的PI3K/AKT信號(hào)通路可能是被抑制的。然而，McMullen 等[14]發(fā)現(xiàn)激活PI3K/AKT 信號(hào)通路是運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)生理性心肌肥厚的重要途徑，敲除小鼠P110a基因后，盡管運(yùn)動(dòng)仍可引起心肌質(zhì)量增加，但是其增加幅度不如野生小鼠大。Weeks等[22]發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT信號(hào)通路對(duì)心肌具有保護(hù)作用，過(guò)表達(dá)P110a 基因可減輕動(dòng)脈縮窄引起的心肌損傷，敲除P110a 基因則會(huì)加重動(dòng)脈縮窄引起的心肌損傷。運(yùn)動(dòng)對(duì)動(dòng)脈縮窄引起的心肌損傷也有保護(hù)作用，敲除P110a 基因后運(yùn)動(dòng)的心肌保護(hù)效應(yīng)減弱。PI3K/AKT信號(hào)通路適度的激活對(duì)于心肌細(xì)胞的正常生長(zhǎng)很有必要，然而其過(guò)度激活也會(huì)對(duì)心臟造成不利的影響。李奕等[23]報(bào)道PI3K蛋白水平在運(yùn)動(dòng)后上調(diào)然后回落，運(yùn)動(dòng)后24 h運(yùn)動(dòng)組PI3K蛋白水平與安靜組無(wú)顯著性差異，表明機(jī)體內(nèi)存在一種機(jī)制在運(yùn)動(dòng)后抑制PI3K/AKT 信號(hào)通路防止其過(guò)度激活，最終實(shí)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)后發(fā)生生理性不是病理性心肌肥大而。因此，本研究觀察到游泳運(yùn)動(dòng)后Pik3ca基因的下調(diào)及Pik3r2基因的上調(diào)可能是運(yùn)動(dòng)后抑制PI3K/AKT信號(hào)通路的分子機(jī)制，這一解釋尚待今后研究證實(shí)。

本研究發(fā)現(xiàn)在自由轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)后小鼠心肌重塑過(guò)程中共有7 個(gè)關(guān)鍵基因，分別是Mad2l1、Spc25、Cdk1、Mcm6、Tipin、Cks2 和Cd68。除了Cd68 外，其他6 個(gè)基因均參與細(xì)胞周期，表明自由轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)可能會(huì)促進(jìn)心肌細(xì)胞的分裂和生長(zhǎng)?？梢?jiàn)，從差異基因網(wǎng)絡(luò)互作結(jié)果上來(lái)看，游泳運(yùn)動(dòng)和自由轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)最終篩選出來(lái)的差異基因也是截然不同的。游泳運(yùn)動(dòng)可能是通過(guò)調(diào)節(jié)Agt 和PI3K/AKT 信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)心肌細(xì)胞的生理性肥大，而自由轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)可能是通過(guò)促進(jìn)心肌細(xì)胞的分裂和生長(zhǎng)而實(shí)現(xiàn)心肌細(xì)胞的生理性肥大。

基因的表達(dá)受到轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，為了進(jìn)一步了解不同方式的運(yùn)動(dòng)對(duì)心臟重塑過(guò)程中基因表達(dá)變化的影響，本研究根據(jù)游泳和自由轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)后小鼠心肌中的差異基因分析它們所對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子。Kohli等[24]報(bào)道過(guò)一些影響心臟肥大的轉(zhuǎn)錄因子，包括促進(jìn)心肌肥大的轉(zhuǎn)錄因子：GATA 家族（GATA-4/5/6）、MEF-2、Csx-Nkx-2.5、SRF /Myocardin、HAND、TEAD 和NFAT，以及抗心肌肥大轉(zhuǎn)錄因子：FoxO、MITF、YY1 和CHF1/Hey2。本研究結(jié)果顯示游泳運(yùn)動(dòng)后小鼠心肌中的差異基因富集到的轉(zhuǎn)錄因子按AUC 排名前3 位的是predrem_nrMotif2039、predrem_nrMotif1919 和TBP，這三個(gè)轉(zhuǎn)錄因子在運(yùn)動(dòng)心臟重塑過(guò)程中的作用尚待進(jìn)一步研究。自由轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)后小鼠心肌中的差異基因富集到的轉(zhuǎn)錄因子AUC排名前3位的是jaspar_MA0050.2、IRF1、IRF7，IRF 家族的轉(zhuǎn)錄因子主要參與免疫反應(yīng)，這一結(jié)果與本研究差異基因功能富集到病毒反應(yīng)相一致。

4 結(jié)論

通過(guò)對(duì)GEO 數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，本研究發(fā)現(xiàn)游泳運(yùn)動(dòng)和自由轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)兩種運(yùn)動(dòng)方式在誘導(dǎo)小鼠心臟重塑過(guò)程中差異基因的數(shù)量不同、共同差異基因少、差異基因功能富集及轉(zhuǎn)錄因子富集結(jié)果都截然不同，因此，這兩種運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的生理性心肌重塑的分子機(jī)制有可能也不同。