腹主動脈縮窄術前跑臺運動對大鼠心源性惡液質的影響及機制

陳雪飛 李世田 李靈杰 張靚

北京師范大學體育與運動學院（北京 100875）

心力衰竭是指由心臟結構和功能異常導致心室收縮或舒張能力受損而引起的一系列病理生理變化的臨床綜合征[1]。隨著人口老齡化及醫(yī)療藥物、手段的改善，冠心病、高血壓及其他心血管疾病患者生存時間延長，導致心力衰竭的發(fā)病率顯著增加。美國心臟協(xié)會（American Heart Association，AHA）發(fā)布的心力衰竭管理指南中，以左心室射血分數(shù)（left ventricular ejection fractions，LVEF）降低50%為臨界點，將心力衰竭分為射血分數(shù)降低的心力衰竭（heart failure with reduced ejection fraction，HFrEF）和射血分數(shù)保留的心力衰竭（heart failure with preserved ejection fraction，HFpEF）（LVEF ≥ 50%）[2]。其中HFpEF 的患病率約占全部心力衰竭的50%，其病因復雜、治療效果不明顯、預后差、死亡率高，受到越來越多專家學者的關注[3]。

心源性惡液質是導致心力衰竭死亡的重要誘因。惡液質是一種嚴重的并發(fā)癥，多發(fā)于各種慢性疾病的晚期，包括癌癥，多種器官特異性炎癥疾病或是心血管疾病[4]。多項研究發(fā)現(xiàn)心力衰竭時骨骼肌萎縮[5]，肌纖維類型改變[6]，蛋白質含量減少[6]；白色脂肪組織的重量減輕，細胞體積變小，脂滴減小，胞內線粒體的數(shù)量增加；褐色脂肪細胞體積減小，褐色化標志基因解偶聯(lián)蛋白1（uncoupling protein 1，UCP-1）表達上調達4倍[7]。

良好的運動習慣對于心血管疾病的發(fā)生及發(fā)展具有強大的保護作用[8]。研究表明，運動可以抑制心力衰竭時心源性惡液質的發(fā)展[9]，本實驗室前期研究也發(fā)現(xiàn)，在心力衰竭發(fā)生后，中小強度的跑臺運動顯著增加心力衰竭大鼠骨骼肌和脂肪組織重量，調節(jié)脂肪組織的代謝異常和骨骼肌萎縮，改善心源性惡液質[10]。有研究[11]發(fā)現(xiàn)，維持鍛煉的中年受試者在65 歲之后由于心力衰竭住院的風險降低，中年時身體活動量每增加1個代謝當量（metabolic equivalent，MET），老年因心力衰竭住院的風險會降低17%。這提示，在心力衰竭發(fā)生前運動對心力衰竭的發(fā)展可能有防治作用，但是目前關于心力衰竭發(fā)生前運動對惡液質的影響和機制的研究較少。鑒于此，本研究以腹主動脈縮窄（abdominal aortic coarctation，AAC）誘導的射血分數(shù)保留型心力衰竭大鼠為模型，觀察AAC 術前4 周的跑臺運動干預對大鼠心臟功能、心源性惡液質的影響，觀察脂肪組織表型轉變，測定炎癥調節(jié)因子C 反應蛋白（C-reactive protein，C-RP）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）及脂肪組織炎癥的改變，探究術前運動干預對心力衰竭時機體惡液質的防治作用和可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

5 周齡雄性Spraque-Dauley（SD）大鼠購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0006。動物分籠飼養(yǎng)，室內溫度為22℃± 5℃，濕度為50% ± 10%，明暗交替周期為12 h，自由進食和飲水。適應性飼養(yǎng)1 周，待體重達220± 10 g時，隨機分成假手術對照組（CON組，n=8）、腹主動脈縮窄組（AAC 組，n=8）和跑臺運動干預加AAC 組（E+AAC 組，n=8）。E+AAC 組進行持續(xù)4 周的跑臺運動，跑臺速度26 m/min，每次運動40 min，每周5次，持續(xù)4周，每次訓練在下午6點至8點間進行，不使用聲、光、電等刺激手段。4 周后，CON 組進行假手術，AAC組和E+AAC組進行AAC手術。

1.2 腹主動脈縮窄術誘導的心力衰竭大鼠模型建立

術前禁食12 h，自由飲水。大鼠用戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔注射麻醉，使其仰臥，固定。腹左側備皮，用3%碘伏消毒，于左肋弓下緣0.5 cm、腹正中線旁0.5 cm 處行1.5～2.0 cm 縱切口，逐層分離皮下組織、進入腹腔。用生理鹽水紗布將腸管推向腹腔右側、隔離，同時用生理鹽水浸濕紗布將胃體、脾臟向上輕推隔離，可顯露后腹膜及左側腎臟。找到左腎動脈，在左腎動脈上方分離腹主動脈，AAC組和E+AAC組用銀夾造成腹主動脈部分狹窄（銀夾內徑0.7 mm），CON 組僅分離血管，腹腔內滴入青霉素（40 萬U/ml）適量，逐層縫合、關腹[12]。

1.3 大鼠超聲心動圖測定

術后6 周，使用VisualSonics Vevo@2100 小動物超聲影像系統(tǒng)（Fujifilm VisualSonics，加拿大）測定各組大鼠心功能。測前腹腔注射戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉大鼠，胸部備皮，仰臥位將頭部及四肢固定在木板上，將探頭置于左前胸，與前正中線呈30°左右的夾角，顯示胸骨旁左室長軸切面；探頭順時針旋轉90°可顯示左室短軸切面圖像。于胸骨旁左室長軸切面二維測量左室室壁厚度等；在二維引導下，將取樣線置于左室健索水平，取M型曲線，進行心功能測量。超聲心動圖測量指標包括：左室舒張末期內徑（left ventricular inner dimension diastolic，LVIDd）與收縮末期內徑（left ventricular inner dimension systole，LVIDs）；左室舒張末期前壁厚度（left ventricular anterior wall diastolic，LVAWd）與后壁厚度（left ventricular posterior wall diastolic，LVPWd）；左室射血分數(shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）。所有測值均測量3 個心動周期取平均值。

1.4 取材

超聲心動圖測定結束后，各組大鼠禁食過夜，自由飲水，腹腔注射戊巴比妥鈉（Sigma，美國）（50 mg/kg）麻醉。經(jīng)腹主動脈取血，用于ELISA 測試。動物處死后，分離心臟組織、比目魚肌、腓腸肌、內臟脂肪（附睪脂肪）、皮下脂肪（腹股溝脂肪）和褐色脂肪（背部肩胛骨間脂肪），分別稱重心臟組織、比目魚肌、腓腸肌、內臟脂肪、皮下脂肪組織并記錄。取部分左心室、脂肪組織和骨骼肌放入4%多聚甲醛中固定，用于后續(xù)的染色，其他部分放入-80℃保存用于后續(xù)mRNA的測定。

1.5 ELISA法檢測IL-6、C-RP水平

腹主動脈取血，緩慢注入含有10%EDTA-2Na 100 μl（Sigma，美國）的試管中混勻，4℃、3000 rpm/min離心10 min，分離血漿。按ELISA試劑盒（華英生物，北京）要求步驟測定C-RP和IL-6濃度，在反應結束后15 min內用酶標儀在450 nm波長處測量各孔光密度值，并計算血漿中C-RP和IL-6的濃度。CRP的靈敏度＜0.05 pg/ml，曲線范圍0～10 mg/ml，批內變異系數(shù)＜8%，批間變異系數(shù)＜10%；IL-6的靈敏度＜3 pg/ml，曲線范圍0～800 pg/ml，批內變異系數(shù)＜4.5%，批間變異系數(shù)＜8%。

1.6 HE染色觀察脂肪組織形態(tài)

將大鼠脂肪組織在4%多聚甲醛中固定24 h后，進行梯度酒精脫水，二甲苯浸泡透明，再用石蠟浸泡6 h后進行包埋，用切片機將包埋好的組織塊切成5 μm厚度貼在載玻片上，用于后續(xù)的染色觀察。石蠟切片放在65℃的烘箱中烤片1 h，二甲苯浸泡20 min，共兩次。依次用100%、95%、75%、50%乙醇、PBS 復水。使用蘇木精染色20 s 后，用蒸餾水漂洗2～3 次，再用伊紅染色20 s，蒸餾水漂洗2～3 次。依次用75%、95%、100%乙醇脫水（各兩次，每次20 s），二甲苯透明（兩次，每次2 min），中性樹膠封片，常溫保存。隨機抽取各組動物切片（n=3），使用奧林巴斯BX51系統(tǒng)顯微鏡（OLYMPUS，日本）分別在40×視野下進行觀察組織結構。

1.7 天狼星紅染色檢測心肌纖維化

將大鼠心肌組織在4%多聚甲醛中固定24 h后，進行梯度酒精脫水，二甲苯浸泡透明，再用石蠟浸泡6h后進行包埋，用切片機將包埋好的組織塊切成5 μm厚度貼在載玻片上，用于后續(xù)的染色觀察。石蠟切片放在65℃的烘箱中烤片1 h，二甲苯浸泡20 min，共兩次。依次用100%、95%、75%、50%乙醇、PBS 復水。使用蘇木精染色20 s后，用蒸餾水漂洗2～3次，天狼星紅染色液滴染1 h，蒸餾水漂洗2～3次。依次用75%、95%、100%乙醇脫水（各2 次，每次20 s），二甲苯透明（2次，每次2分鐘），中性樹膠封片，常溫保存。隨機抽取各組動物切片（n=3），使用奧林巴斯BX51 系統(tǒng)顯微鏡（OLYMPUS，日本）在10×和20×視野下進行觀察心肌纖維化情況。

1.8 Real-time PCR檢測脂肪組織中目的基因表達

使用動物組織總RNA 提取試劑盒（TianGen Biotech，北京）提取組織總RNA，使用反轉錄試劑盒（Tian-Gen Biotech，Beijing）進行逆轉錄。real-time PCR反應體 積 共20 μl：Super Real Pre Mix Plus （SYBR Green）體 系（TransGene Biotech，Beijing）15 ml，10 mmol/L的上下游引物各0.5 μl，cDNA模板5 μl。所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。經(jīng)94℃30 s，94℃5 s，60℃34 s，熱循環(huán)40 次。Realtime PCR 于LightCycler96 熒光定量PCR 儀（Roche，Switzerland）上進行，以GAPDH 作為內參，具體檢測基因包括：褐色化標志基因UCP-1 和過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助激活因子α（ peroxisome proliferatoractivated receptor γ coactivator-1α，PGC-1α），白色脂肪標志基因脂聯(lián)素（adiponectin）、瘦素（leptin）；炎癥類基因：M2 型巨噬細胞標志基因白介素10（interleukin-10，IL-10），血紅蛋白清道夫受體（cysteine-rich scavenger receptor type 1 M130，CD163），M1 型巨噬細胞標志基因誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）。采用2-ΔΔCT法進行計算。所用引物序列見表1。

表1 real time PCR引物序列

1.9 統(tǒng)計方法

數(shù)據(jù)采用PRISM 6.0軟件進行統(tǒng)計分析。實驗結果以均數(shù)±標準差（±s）表示。組間差異采用單因素方差分析，方差分析后采用多重比較檢驗比較三組兩兩之間是否具有顯著性差異，多重比較采用Newman-Keuls檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 運動對腹主動脈縮窄大鼠心臟結構和功能的影響

與CON 組相比，6 周AAC 大鼠的心重/體重顯著升高（圖1A）（P＜0.01），LVIDs 和LVIDd 顯著增加（圖1B、C）（P＜0.001 和P＜0.05），LVAWd 和LVPWd 顯著增加（圖1D、E）（P＜0.05 和P＜0.01），LVEF 顯著降低但仍大于50%（圖1F）（P＜0.01），心肌天狼星紅染色結果表明AAC組大鼠心肌出現(xiàn)纖維化（圖1G）。與AAC組相比，E+AAC 組大鼠心重/體重顯著下降（圖1A）（P＜0.01），LVIDs 和LVIDd 顯著降低（圖1B、C）（P＜0.01 和P＜0.05），LVAWd 顯著降低（圖1D）（P＜0.05），LVEF 顯著提升（圖1F）（P＜0.05），天狼星紅染色結果顯示心肌纖維化有所改善（圖1G），提示運動改善了大鼠的心臟肥大及心肌纖維化。

圖1 各組大鼠心臟結構和功能指標比較

2.2 運動對腹主動脈縮窄大鼠體重、骨骼肌和脂肪重量的影響

與CON 組相比，AAC 組大鼠體重顯著下降（P＜0.05），皮下脂肪和內臟脂肪的重量顯著下降（P＜0.001和P＜0.05），比目魚肌和腓腸肌的重量均顯著下降（均P＜0.01），提示AAC 大鼠出現(xiàn)心源性惡液質。與AAC組相比，E+AAC組大鼠體重顯著增加（P＜0.05），皮下脂肪重量顯著上調（P＜0.05），內臟脂肪、比目魚肌和腓腸肌重量有所增加，但差異無統(tǒng)計學意義（表2）。

表2 各組大鼠體重、骨骼肌以及脂肪重量比較

2.3 運動對AAC大鼠脂肪組織形態(tài)和表型的影響

與CON 組相比，AAC 組大鼠褐色脂肪組織中細胞體積減小，脂滴變?。▓D2A），UCP-1 和PGC-1α的mRNA 表達顯著增加（圖3A）（均P＜0.05），leptin 的mRNA 表達顯著下調（圖3A）（P＜0.05）；皮下脂肪組織細胞橫截面積減?。▓D2B），adiponectin mRNA 表達顯著下調（圖3B）（P＜0.01）；內臟脂肪組織中細胞橫截面積減小（圖2C），adiponectin和leptin mRNA表達顯著下調（圖3C）（P＜0.01，P＜0.001）。

與AAC組相比，E+AAC組大鼠褐色脂肪組織中細胞形態(tài)恢復正常，脂滴變大（圖2A），UCP-1 和PGC-1α的mRNA表達顯著減少（圖3A）（均P＜0.05）；皮下脂肪組織中細胞形態(tài)無顯著變化（圖2B），leptin的mRNA表達顯著上調（圖3B）（P＜0.05）；內臟脂肪組織中細胞形態(tài)無顯著改變（圖2C），adiponectin mRNA 表達顯著上調（圖3C）（P＜0.05）。

圖3 大鼠脂肪組織UCP-1、PGC-1α、adiponectin和leptin基因表達的變化

2.4 運動調節(jié)AAC大鼠機體的慢性炎癥

與CON 組相比，AAC 組大鼠血漿中C-RP 和IL-6水平顯著上調（圖4A、B）（均P＜0.001），表明機體處于慢性炎癥狀態(tài)。褐色脂肪中IL-10和CD163 mRNA表達表達顯著上調（均P＜0.05），iNOS和TNF-α mRNA表達顯著上調（圖5A）（P＜0.01 和P＜0.001），在皮下脂肪中IL-10、iNOS和TNF-α mRNA表達顯著上調（圖5B）（均P＜0.05），內臟脂肪中IL-10、CD163和iNOS mRNA表達顯著上調（圖5C）（均P＜0.05），脂肪組織中炎癥水平顯著上調。與AAC組相比，E+AAC組大鼠血漿中CRP和IL-6水平顯著下調（圖4A、B）（均P＜0.001），褐色脂肪中IL-10、CD163、iNOS和TNF-α mRNA表達均顯著下調（圖5A）（P＜0.05，P＜0.05，P＜0.05和P＜0.01），皮下脂肪組織中IL-10、iNOS和TNF-α mRNA表達顯著下調（圖5B）（均P＜0.05），以上結果表明術前運動干預能夠有效減輕心力衰竭時脂肪組織炎癥和機體慢性炎癥。

圖4 大鼠血漿中C-RP、IL-6水平比較

圖5 大鼠脂肪組織中IL-10、CD163、iNOS和TNF-α基因表達的變化

3 討論

3.1 運動對心力衰竭發(fā)展的預防作用

運動對心血管健康的促進作用已成為共識。有研究表明，良好的身體鍛煉習慣對心力衰竭的發(fā)生具有保護性作用[8]。運動可以改善心臟的結構和功能，降低心力衰竭的風險。一項為期12年、對2925人的健身狀況與心臟功能的縱向研究發(fā)現(xiàn)，較高的運動強度與心臟舒張功能障礙的發(fā)生率和心臟重塑的患病率成反比[13]。與健康久坐的年輕人群相比，健康但久坐的老年人群出現(xiàn)左室順應性，左室舒張功能異常[14]。本研究在AAC手術前，對大鼠進行4周的跑臺運動干預，發(fā)現(xiàn)大鼠心室壁厚度、舒張與收縮末期左心室內徑均顯著降低，心肌纖維化程度降低，提示運動對心力衰竭發(fā)生后心臟肥大和心功能下降有較好的預防作用。

3.2 運動對心源性惡液質的預防作用

肥胖通常與心血管疾病，尤其是心力衰竭的發(fā)病率成正相關，但心力衰竭時，肥胖對于患者的預后更為有利，這種現(xiàn)象被稱為“肥胖悖論”[15]，可見脂肪組織是改善心力衰竭至關重要的靶點。研究發(fā)現(xiàn)，心力衰竭患者脂肪組織存在代謝失衡現(xiàn)象，導致體重減輕，心源性惡液質發(fā)展[16]。在腎切除后4 周醛固酮誘導的C57小鼠HFpEF 模型中，小鼠皮下脂肪和內臟脂肪中細胞體積明顯減小，脂肪組織中UCP-1、Cidea 等褐色化標志基因表達顯著上調，內臟脂肪組織中Adiponectin、leptin等白色脂肪標志基因的表達顯著下調，白色脂肪組織出現(xiàn)明顯的褐色化[17]。Panagia 等[18]發(fā)現(xiàn)在心梗小鼠模型，褐色脂肪組織體積顯著減小，UCP-1 mRNA表達顯著上調，褐色脂肪組織過度激活。運動對心力衰竭時脂肪組織褐色化具有明顯的抑制作用。有研究發(fā)現(xiàn)4 周跑臺運動能夠改善心力衰竭誘導的脂肪組織重量的下降，抑制褐色脂肪組織的過度激活，改善機體惡液質[10]。本研究結果顯示，心衰時大鼠體重和骨骼肌重量下降，白色脂肪組織重量降低、細胞橫截面積減小，褐色脂肪組織脂滴變小、褐色化標志基因UCP-1和PGC-1α表達上調，出現(xiàn)褐色脂肪的過度激活，提示脂肪組織出現(xiàn)惡液質現(xiàn)象；心力衰竭發(fā)生前進行跑臺運動能夠上調體重和皮下脂肪組織重量，褐色脂肪組織脂滴增大，褐色化標志基因顯著下調，其過度激活受到明顯抑制，骨骼肌重量有所增加但差異無統(tǒng)計學意義。以上結果提示術前中小強度的運動顯著抑制了心力衰竭時脂肪組織的惡液質，減緩了心源性惡液質的發(fā)生。

3.3 運動改善大鼠心源性惡液質的炎癥機制

心源性惡液質受多種因素的調節(jié)，氧氣運輸與利用障礙、氧化應激、細胞凋亡及自噬和內分泌紊亂都會導致機體出現(xiàn)惡液質，其中炎癥水平升高是重要機制之一[19]。脂肪組織炎癥水平的升高會導致機體各項功能發(fā)生紊亂，影響其它的器官和組織，最終加劇惡液質的發(fā)展。在高脂誘導的肥胖小鼠中，附睪脂肪TNF-α、IL-1β、MCP1、F4/80基因的表達顯著上調，表明脂肪組織出現(xiàn)炎癥[20]。心力衰竭患者通常伴有慢性低水平的全身炎癥，這對于脂肪組織和骨骼肌都會產(chǎn)生持續(xù)的影響。本研究測定了脂肪組織的炎癥因子表達的變化，發(fā)現(xiàn)脂肪組織產(chǎn)生的大量炎癥因子可能是心力衰竭時慢性炎癥的主要來源。Shimizu等[21]報道胸主動脈縮窄誘導的小鼠心力衰竭模型中，內臟脂肪中發(fā)生了巨噬細胞的浸潤，促炎因子TNF-α和MCP1 mRNA 表達顯著上調，內臟脂肪組織的慢性炎癥會加劇心力衰竭的發(fā)展。本研究中，AAC誘導的心力衰竭大鼠，血漿中C-RP 和IL-6 水平顯著上調，脂肪組織中炎癥因子上調，表明大鼠體內炎癥反應顯著增強。運動作為治療惡液質的有效干預手段之一，能夠通過減輕氧化應激，抑制骨骼肌凋亡，抑制蛋白質降解，以及減輕機體炎癥等多種作用機制，改善骨骼肌萎縮和脂肪組織的褐色化[10，19，22]。但目前關于運動改善心源性惡液質的機制尚未明了。本研究發(fā)現(xiàn)術前運動干預顯著抑制了AAC大鼠血漿中C-RP、IL-6的水平和脂肪組織中促炎因子的表達。巨噬細胞被認為是脂肪組織中炎癥發(fā)生的關鍵細胞。巨噬細胞根據(jù)其極化狀態(tài)的不同可以分為M1 型（經(jīng)典活化）或M2 型（選擇性活化）巨噬細胞[23]。M1 型巨噬細胞的增加會導致TNF-α和IL-6 等各種促炎細胞因子的表達升高，加劇脂肪組織炎癥[24]。有研究發(fā)現(xiàn)在脂肪組織中M2型巨噬細胞極化后，釋放抗炎細胞因子激活脂肪細胞中的β腎上腺素受體，促進產(chǎn)熱基因的表達如UCP-1、PGC1-α等，導致脂肪組織褐色化[25]。本研究發(fā)現(xiàn)在心衰時脂肪組織中M1 和M2型巨噬細胞標志基因的表達均顯著增加，運動干預能夠抑制M1和M2巨噬細胞的極化。以上研究結果提示運動可能是通過下調脂肪組織的炎癥水平和抑制脂肪組織M1 和M2 巨噬細胞的激活，從而降低機體慢性炎癥水平，改善脂肪組織褐色化和心源性惡液質。

4 結論

AAC誘導的心力衰竭大鼠心肌肥大、心功能下降、體重下調、骨骼肌重量和白色脂肪組織重量降低、褐色脂肪組織過度激活，發(fā)生明顯的心源性惡液質；術前運動干預可以改善AAC 誘導的心肌肥大、抑制褐色脂肪組織的過度激活，減緩脂肪組織惡液質的發(fā)展；運動對機體慢性炎癥的調節(jié)，可能是運動抑制脂肪組織惡液質的潛在機制。