犬瘟熱病毒感染雪貂的臨床癥狀及其治療探究

潘虹軍，陳 杰，龔成燕，胡 博，白 雪，王全凱，趙建軍

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130118；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 特產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)部經(jīng)濟(jì)動(dòng)物疫病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130122；3.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，黑龍江 大慶 158308)

犬瘟熱(Canine distemper, CD)是由犬瘟熱病毒(Canine distemper virus, CDV)引起的一種難治愈、死亡率高的高度接觸性傳染病，臨床癥狀以直腸溫度升高、消化道和呼吸道感染為主要特征。CDV傳播途徑多樣，傳播范圍廣泛，報(bào)道的物種除犬科外，還包括貓科、鼬科、熊貓科、熊科等食肉目動(dòng)物及獼猴等非人類靈長(zhǎng)動(dòng)物，甚至在人類的體內(nèi)也檢測(cè)到CDV的存在。有研究者認(rèn)為犬瘟熱可能成為人畜共患疾病，對(duì)公共衛(wèi)生安全造成威脅，所以對(duì)CDV的研究愈發(fā)重要。

雪貂因?qū)Χ喾N病毒性傳染病易感性強(qiáng)、容易飼養(yǎng)、性格溫順而逐漸被用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。隨后研究人員將雪貂陸續(xù)應(yīng)用于生理、病理、毒理、藥理的研究，但因雪貂特異性試劑而使其應(yīng)用受到限制。雪貂對(duì)CDV高度易感，致死率高達(dá)100%。因此CDV感染雪貂模型常被用于CD的相關(guān)研究，von Messling等利用CDV 5804P株建立了CDV感染雪貂的毒力和免疫抑制模型，并發(fā)現(xiàn)基質(zhì)、融合和血凝素蛋白基因是決定CDV毒力的重要因素。在此基礎(chǔ)上，von Messling等構(gòu)建了一種表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(eGFP)的重組CDV毒株5804P-eGFP/H，并證明CDV V蛋白維持以淋巴細(xì)胞為基礎(chǔ)粘膜組織和淋巴器官的快速侵襲，而CDV C蛋白維持隨后的感染階段。隨后，他們通過替換野生型5804P和A75毒株的H蛋白，證明CD病程是主要由H蛋白的神經(jīng)毒力決定。并以CDV 5804PeH質(zhì)粒全基因組為基礎(chǔ)構(gòu)建了重組CDVs，證明了麻疹病毒M和F基因之間的區(qū)域通過轉(zhuǎn)錄控制F基因表達(dá)來調(diào)節(jié)毒力。

目前，接種疫苗的動(dòng)物能有效控制CDV的感染和流行，但依然有因接種不及時(shí)或疫苗毒力殘留所致的動(dòng)物發(fā)病而死亡。因此，疫苗并不能完全保護(hù)集約化飼養(yǎng)或作為寵物的雪貂，需要探索一種動(dòng)物感染CDV后的救治方案。由于CD是一種免疫抑制性傳染病，且常引起混合感染及繼發(fā)感染, 因此多采用抗病毒和消炎的方式治療。李明浩等使用CDV單抗配合拜有利注射液、維生素B、B和科特壯使患CD的犬病情得到控制。王風(fēng)蓮等采用CDV抗體血清聯(lián)合復(fù)方氨基比林、頭孢曲松鈉和開胃消食靈聯(lián)合給藥的方式治療CDV感染發(fā)病的雪貂。

本試驗(yàn)使用雪貂為試驗(yàn)動(dòng)物，5804P-eGFP/H作為接種毒株進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，對(duì)該毒株所產(chǎn)生穩(wěn)定、發(fā)病明顯的臨床癥狀及CDV感染雪貂的治療方法進(jìn)行探究，為犬瘟熱的早期診斷和后期治療提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物和毒株

安格魯雪貂()，12只，2月齡，體重0.40～0.50 kg，購自中國(guó)江蘇省無錫珊瑚生物科技有限公司，試驗(yàn)前CDV抗原和抗體檢測(cè)結(jié)果均為陰性，試驗(yàn)在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房進(jìn)行。為保證動(dòng)物福利，雪貂試驗(yàn)開始前將舒泰-50注射至后腿肌肉(10 mg/kg)將動(dòng)物麻醉，減少動(dòng)物痛苦。試驗(yàn)用CDV強(qiáng)毒5804P-eGFP/H株由德國(guó)Paul Ehrlich Institute(PEI)研究所Veronica von Messling教授惠贈(zèng)。

1.2 主要試劑和儀器

TRIzol購自Thermo公司；Prime Script II 1st Strand cDNA Kit 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、HS Ex Taq Premix reaction mix熒光定量PCR 試劑盒購自寶生物工程技術(shù)有限公司；EDTA-K2抗凝管購自洪達(dá)醫(yī)療器械集團(tuán)有限公司；拜有利針劑(Baytril，100 mL)購自拜耳醫(yī)藥保健有限公司；舒泰-50(Zoletil-50)購買自法國(guó)維克制藥有限公司；CDV多克隆抗體血清中和效價(jià)為1:64，由本實(shí)驗(yàn)室制備和保存；安乃近(2 mL)、鹽酸腎上腺素(1 mL)、維生素B(2 mL)和B(1 mL)針劑購自新鄉(xiāng)市華畜商貿(mào)有限公司，獸藥產(chǎn)品批準(zhǔn)文號(hào)分別為：獸藥字(2016)163232505、獸藥字(2016)163231220、獸藥字163232797、獸藥字163231406。

1.3 攻毒試驗(yàn)

攻毒試驗(yàn)參考文獻(xiàn)[11]，試驗(yàn)前禁食12 h，少量喂水；5804P-eGFP/H配置至105.0 TCID50/250 μL備用。動(dòng)物分為試驗(yàn)組A、治療組B和對(duì)照組，試驗(yàn)組A和治療組B通過鼻內(nèi)接種5804P-eGFP/H病毒液，對(duì)照組接種等量PBS；動(dòng)物被麻醉后用移液器將病毒液緩慢滴入鼻腔，攻毒劑量250 μL/只。詳細(xì)過程見表1。

表1 犬瘟熱病毒攻毒試驗(yàn)

1.4 臨床癥狀觀察和評(píng)分

攻毒后每天觀察、測(cè)量和記錄所有出現(xiàn)的臨床癥狀，并參照文獻(xiàn)[17]進(jìn)行分級(jí)評(píng)分，其中黑色為2分，花色為1分，白色為0分。詳細(xì)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表2。綜合癥狀分?jǐn)?shù)=所有試驗(yàn)動(dòng)物9種癥狀(直腸溫度、體重變化率、精神狀態(tài)、腹瀉、食欲、結(jié)膜炎、鼻腔分泌物、嘔吐和紅疹)得分之和/試驗(yàn)動(dòng)物數(shù)；體重變化率為檢測(cè)體重/攻毒當(dāng)天體重。

表2 臨床癥狀評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.5 淋巴細(xì)胞數(shù)檢測(cè)

試驗(yàn)組A于攻毒0 d、7 d、14 d使用頸靜脈采血的方法，取雪貂全血放入抗凝真空采血管(EDTA-K2)，抗凝血分離出淋巴細(xì)胞后用于淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.6 排毒檢測(cè)

排毒通過鼻腔、眼角分泌物拭子和直腸拭子進(jìn)行測(cè)定，每日采集拭子后于-20 ℃ 保存?zhèn)溆?；使用TRIzol提取病毒RNA，cDNA的合成和熒光定量PCR試驗(yàn)過程參照文獻(xiàn)[3]，引物和探針序列由長(zhǎng)春生工公司合成。

1.7 剖檢觀察

試驗(yàn)過程中病死動(dòng)物或14 d 后存活動(dòng)物安樂死，解剖后對(duì)腦、肝、脾、肺、腎、腸進(jìn)行觀察。

1.8 治療試驗(yàn)

根據(jù)試驗(yàn)組A中臨床癥狀種類和發(fā)病程度確定治療時(shí)間和藥品使用。試驗(yàn)起點(diǎn)為試驗(yàn)組A中臨床癥狀明顯發(fā)病且血液中淋巴細(xì)胞明顯受到抑制時(shí)，試驗(yàn)終點(diǎn)為連續(xù)5 d未見發(fā)病和排毒，試驗(yàn)期間參照1.4對(duì)臨床癥狀進(jìn)行記錄和評(píng)分。試驗(yàn)開始后每天清理眼、鼻分泌物，并使用高錳酸鉀對(duì)環(huán)境進(jìn)行消毒；所有藥品在第1次使用前，均通過皮內(nèi)注射0.1 mL藥品的10倍稀釋液進(jìn)行皮試，觀察是否有藥品不良反應(yīng)，治療過程中根據(jù)臨床癥狀適當(dāng)調(diào)整藥品使用，詳細(xì)治療過程見表3。其中鹽糖飲用水為生理鹽水：葡萄糖注射液：飲用水1∶1∶1混合，流食為鹽糖飲用水與飼料混合。

表3 犬瘟熱治療方案

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 試驗(yàn)組A臨床癥狀匯總和評(píng)分

試驗(yàn)組A臨床癥狀匯總結(jié)果見圖1，雪貂體重從接毒后第6 d開始下降，變化率達(dá)5%，第8天超過10%，直到第14天未見體重明顯的改變，與對(duì)照組差異顯著(<0.05，圖1A)；直腸溫度從接毒后第3天開始升高，第4 d超過39.2 ℃，第5天直到試驗(yàn)結(jié)束維持在39.5～40.0 ℃之間(圖1B)；在接毒后第6天，可見雪貂有輕微的結(jié)膜炎，隨后眼鼻分泌物逐漸增加，9 d左右發(fā)現(xiàn)分泌物化膿(圖1C)；少量紅疹在接毒后第8天開始出現(xiàn)，發(fā)病較輕且未擴(kuò)散到全身(圖1D)；接毒后第3天開始發(fā)現(xiàn)部分動(dòng)物有明顯的食欲減退，7 d后動(dòng)物出現(xiàn)食欲廢絕，第9天左右發(fā)現(xiàn)抽搐、轉(zhuǎn)圈等神經(jīng)癥狀；接毒后第6 d發(fā)現(xiàn)動(dòng)物腹瀉，7 d發(fā)現(xiàn)部分動(dòng)物嘔吐，9 d出現(xiàn)便血現(xiàn)象。對(duì)照組動(dòng)物正常，均未出現(xiàn)任何臨床癥狀。試驗(yàn)組A臨床評(píng)分結(jié)果和綜合癥狀評(píng)分結(jié)果見圖2，在感染過程中臨床癥狀分?jǐn)?shù)與試驗(yàn)時(shí)間成正比，綜合癥狀分?jǐn)?shù)在0～3 d、4～6 d、7～9 d、10～14 d分別為0.5、6、12.25、14。

圖1 CDV感染發(fā)病雪貂的臨床癥狀

圖2 試驗(yàn)組A臨床癥狀評(píng)分

2.2 剖檢觀察結(jié)果

組織器官的CDV試紙條的檢測(cè)結(jié)果見圖3，對(duì)照組為陰性，試驗(yàn)組A為陽性；試驗(yàn)組A動(dòng)物的病理剖檢結(jié)果見圖4，腎臟腫大且有發(fā)炎現(xiàn)象，肝臟腫脹并有點(diǎn)狀出血，腸體有明顯帶狀和彌漫性出血，腦有充血現(xiàn)象，脾臟充血，肺臟紅腫、充血。對(duì)照組臟器形態(tài)、顏色均正常。

圖3 對(duì)照組(左)與試驗(yàn)組A(右)紙條檢測(cè)結(jié)果

圖4 雪貂感染CDV后組織剖檢結(jié)果

2.3 血液中淋巴細(xì)胞分析結(jié)果

血液中淋巴細(xì)胞結(jié)果見圖5，CDV感染后宿主體內(nèi)免疫細(xì)胞受到抑制。試驗(yàn)組A淋巴細(xì)胞在攻毒后第7天明顯減少，0～7 d從4 300 μL下降到2 200 μL，與對(duì)照組淋巴細(xì)胞數(shù)差異顯著(<0.01)。

2.4 排毒檢測(cè)結(jié)果

CDV病毒在宿主體內(nèi)復(fù)制后經(jīng)眼鼻和直腸排出。試驗(yàn)組A中眼鼻拭子和直腸拭子排毒結(jié)果見表4，整體變化基本相似，最早在接毒后第3天檢測(cè)到CDV RNA，隨后在眼鼻和直腸拭子中均能檢測(cè)到病毒RNA直至試驗(yàn)結(jié)束。對(duì)照組眼鼻拭子和直腸拭子中未檢測(cè)到CDV RNA。

2.5 血液中淋巴細(xì)胞分析結(jié)果

血液中淋巴細(xì)胞結(jié)果見圖5，CDV感染后宿主體內(nèi)免疫細(xì)胞受到抑制。試驗(yàn)組A淋巴細(xì)胞在攻毒后第7天明顯減少，0～7 d從4 300 μL下降到2 200 μL，與對(duì)照組淋巴細(xì)胞數(shù)差異顯著(<0.01)。

圖5 淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果

2.6 排毒檢測(cè)結(jié)果

CDV病毒在宿主體內(nèi)復(fù)制后經(jīng)眼鼻和直腸排出。試驗(yàn)組A中眼鼻拭子和直腸拭子排毒結(jié)果見表4，整體變化基本相似，最早在接毒后第3天檢測(cè)到CDV RNA，隨后在眼鼻和直腸拭子中均能檢測(cè)到病毒RNA直至試驗(yàn)結(jié)束。對(duì)照組眼鼻拭子和直腸拭子中未檢測(cè)到CDV RNA。

表4 拭子中病毒載量檢測(cè)結(jié)果

2.7 犬瘟熱的治療

于攻毒后第9天對(duì)B組雪貂進(jìn)行治療，雪貂呈現(xiàn)不同程度的消化道癥狀(食欲減退或廢絕、嘔吐、腹瀉、便血、脫水、消瘦)，呼吸道癥狀(鼻腔分泌物、呼吸困難呈腹式呼吸)，神經(jīng)癥狀(抽搐、轉(zhuǎn)圈)，皮膚癥狀(少量紅疹)，眼睛癥狀(結(jié)膜紅腫、分泌物增多化膿)和炎癥反應(yīng)(發(fā)熱、繼發(fā)性感染)等。首先保證治療后每天對(duì)動(dòng)物自身和生活環(huán)境進(jìn)行徹底消毒，隨后對(duì)犬瘟熱臨床癥狀進(jìn)行觀察和治療。結(jié)果顯示：治療后1～3 d臨床癥狀仍然較為嚴(yán)重，雪貂精神萎靡、食欲減退、呼吸困難、有較多的眼鼻分泌物、直腸溫度高、排血便、瘦弱，參照表3針對(duì)性使用CDV抗體血清、拜有利、安乃近、鹽酸腎上腺素、維生素B和B等針劑，密切觀察雪貂休克現(xiàn)象，及時(shí)使用鹽酸腎上腺素，避免因休克導(dǎo)致的死亡，同時(shí)對(duì)病重動(dòng)物使用注射器進(jìn)行鹽糖水和流食的飼喂，在治療的同時(shí)補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)和水分；4～6 d雪貂精神狀態(tài)稍有恢復(fù)，發(fā)熱、呼吸困難等現(xiàn)象減輕，行動(dòng)狀態(tài)遲緩，所有雪貂均可自主采食，繼續(xù)飼喂鹽糖水和流食，停用CDV抗體血清和鹽酸腎上腺素，其他治療方案與0～3 d相同；7～10 d臨床癥狀基本消失，嘗試停止用藥，開始飼喂正常飼料和飲用水，但9 d有一只雪貂發(fā)熱，9 d當(dāng)天再次進(jìn)行治療，治療方案與4～6 d相同；11 d之后臨床癥狀完全消失，于11～21 d對(duì)雪貂進(jìn)行試紙條檢測(cè)，結(jié)果見表5，檢測(cè)結(jié)果均為陰性，期間未見臨床癥狀復(fù)發(fā)，確認(rèn)雪貂康復(fù)。

表5 治療11 d后CDV試紙條檢測(cè)結(jié)果

試驗(yàn)組B臨床評(píng)分結(jié)果見圖6，攻毒后7～9 d、治療后0～3 d、4～6 d、7～10 d、11～21 d綜合癥狀分?jǐn)?shù)分別為11.25，13，9.25，1.25，0。從攻毒到治療，除治療后0～3相較攻毒后7～9 d得分稍有上升外，綜合癥狀分?jǐn)?shù)隨著時(shí)間的增加而下降，直至降為0。

圖6 治療前后臨床癥狀評(píng)分結(jié)果

3 討 論

自20世紀(jì)50-60年代犬瘟熱弱毒疫苗應(yīng)用以來，犬等易感動(dòng)物CD發(fā)病率大大降低，但仍有野生動(dòng)物、寵物感染CDV而發(fā)病的報(bào)道。雪貂除用作某些疾病和藥物的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物外，因雪貂生性活潑、外形可愛而成為一種新型高端寵物。在國(guó)內(nèi)，將雪貂作為寵物的數(shù)量正逐漸上升，因此，對(duì)CDV感染雪貂發(fā)病程度的準(zhǔn)確判斷可為成功治療提供有價(jià)值的參考。為了對(duì)試驗(yàn)雪貂的發(fā)病程度進(jìn)行準(zhǔn)確描述而便于診斷，本研究參考已有CDV感染雪貂的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物致病模型，以綜合癥狀分?jǐn)?shù)(動(dòng)物癥狀得分之和/試驗(yàn)所用動(dòng)物數(shù))作為試驗(yàn)結(jié)果。在臨床癥狀觀察時(shí)發(fā)現(xiàn)CDV感染雪貂出現(xiàn)直腸溫度上升、體重下降、結(jié)膜炎、精神狀態(tài)、食欲減退、腹瀉、鼻腔分泌物增多，這些明顯可見的變化可作為臨床評(píng)價(jià)指標(biāo)。紅疹等癥狀與von Messling等研究結(jié)果不同，試驗(yàn)中僅在2只動(dòng)物腹部發(fā)現(xiàn)少量紅疹，且持續(xù)時(shí)間短，具體原因仍需探究。在接毒后第0～3天臨床綜合分?jǐn)?shù)較低，與接毒后第3天開始排毒的結(jié)果共同表明，此時(shí)雖然有病毒排出，但未對(duì)雪貂造成嚴(yán)重?fù)p傷。然而病毒經(jīng)過進(jìn)一步大量增殖，表現(xiàn)明顯的臨床癥狀。同時(shí)接毒后病毒持續(xù)抑制雪貂免疫系統(tǒng)，使其淋巴細(xì)胞數(shù)下降。與之相對(duì)應(yīng)的感染雪貂病理解剖結(jié)果顯示因CDV感染而導(dǎo)致的主要器官的炎癥、腫脹等變化。本研究臨床評(píng)分可以為診斷提供參考，通過外在臨床綜合表現(xiàn)可推斷出病毒的感染情況。

為了找到控制CDV感染的有效措施，在臨床癥狀評(píng)估的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)雪貂犬瘟熱的治療方法展開研究。在治療過程中需對(duì)動(dòng)物和環(huán)境進(jìn)行清理和消毒，從而在一定程度上減少與病毒接觸頻率；飼喂的飼料為商品全價(jià)飼料，將其與鹽糖混合水制成流食后可保證營(yíng)養(yǎng)和水分的攝入。在治療過程中，為避免藥品對(duì)雪貂產(chǎn)生副作用，所有治療性藥物在使用前均需進(jìn)行藥物皮試。在治療藥物的選擇上，對(duì)患犬瘟熱的動(dòng)物采取特異性治療的方法可以提高其治愈率：犬瘟熱的主要治療包括CDV單克隆抗體及含有抗體的高免血清，兩者均有不錯(cuò)的臨床效果；在犬瘟熱其他臨床癥狀治療中，對(duì)于雪貂的神經(jīng)癥狀、驚厥和休克，使用鹽酸腎上腺素針劑輔助治療，同時(shí)使用維生素B和B營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)；對(duì)于繼發(fā)性感染引起的炎癥，可選用氨芐青霉素、頭孢菌素、喹諾酮類和磺胺嘧啶類等，拜有利通過阻斷致病菌DNA合成從而達(dá)到抗菌消炎作用，其安全性較高，且對(duì)革蘭陽性和革蘭陰性菌均有較好的抑制效果；對(duì)于感染雪貂出現(xiàn)的直腸溫度上升現(xiàn)象，柴胡、地塞米松、賴氨匹林、安宮牛黃丸和紫雪丹后具由不錯(cuò)的降溫效果，但對(duì)于價(jià)格適中、快速退燒的要求，安乃近是最好的選擇。

本研究成功治愈了典型CD臨床癥狀均已出現(xiàn)，并且免疫系統(tǒng)受到明顯抑制的雪貂，說明所采用的治療方法可以有效消除體內(nèi)的病毒對(duì)雪貂的致病作用，但本試驗(yàn)僅通過治療后的臨床癥狀評(píng)分對(duì)該治療方案的效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，未對(duì)不同發(fā)病程度、不同年齡段的雪貂、不同給藥梯度、不同藥物之間的配伍禁忌做研究，同時(shí)未檢測(cè)治療期間雪貂的血常規(guī)、電解質(zhì)、抗原、抗體和體內(nèi)器官隨時(shí)間的變化情況。接下來的試驗(yàn)將參考Krumm等，將攻毒后到治療結(jié)束期間分成幾個(gè)區(qū)段、選取不同年齡段的雪貂和不同給藥濃度進(jìn)行研究，并對(duì)雪貂的血常規(guī)、電解質(zhì)、抗原、抗體、血液中藥物濃度等進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)使用X光、B超、病理切片、免疫組化切片等病毒感染檢查措施對(duì)體內(nèi)器官進(jìn)行檢查，進(jìn)一步探究此治療方案中藥物的最佳給藥劑量和半數(shù)致死劑量，從而更準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)治療方案對(duì)犬瘟熱的影響。

4 小 結(jié)

本研究成功治愈了典型CD臨床癥狀均已出現(xiàn)、并且免疫系統(tǒng)受到明顯抑制的雪貂，說明所采用的治療方法可以有效消除體內(nèi)的病毒對(duì)雪貂的致病作用。但本試驗(yàn)僅通過治療后的臨床癥狀評(píng)分對(duì)該治療方案的效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，未對(duì)不同發(fā)病程度、不同年齡段的雪貂、不同給藥梯度、不同藥物之間的配伍禁忌做研究，同時(shí)未檢測(cè)治療期間雪貂的血常規(guī)、電解質(zhì)、抗原、抗體和體內(nèi)器官隨時(shí)間的變化情況。接下來還需對(duì)這些項(xiàng)目進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)結(jié)合X光、B超、病理切片、免疫組化切片等病毒感染檢查措施對(duì)體內(nèi)器官進(jìn)行檢查，進(jìn)一步探究此治療方案中藥物的最佳給藥劑量和半數(shù)致死劑量，從而更準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)治療方案對(duì)犬瘟熱的影響。