飼糧中添加海藻對(duì)山羊瘤胃微生物多樣性的影響

代邦國(guó)，耿亞楠，翁玉楠，史懷平

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

海藻作為飼料添加劑的一種，含有氨基酸、脂肪酸、藻多糖、維生素等多種高價(jià)值的營(yíng)養(yǎng)成分。但目前海藻飼料的研究主要集中在其對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育和生產(chǎn)性能的研究，本實(shí)驗(yàn)室先前的研究表明，添加3%的海藻不會(huì)影響山羊的生長(zhǎng)性能、屠宰性能和肌肉品質(zhì)，但有改善血脂指標(biāo)以及肌肉與脂肪組織脂肪酸組成的潛力。山羊瘤胃作為一個(gè)厭氧的消化系統(tǒng)，瘤胃中的微生物，包括細(xì)菌、真菌、古菌和病毒等共同組成了復(fù)雜的微生物共生群落，良好的瘤胃菌群環(huán)境能提高反芻動(dòng)物飼料轉(zhuǎn)換和營(yíng)養(yǎng)吸收效率。瘤胃中微生物的多樣性對(duì)瘤胃的發(fā)育至關(guān)重要，不僅可以幫助宿主將難以消化的纖維素和半纖維素等物質(zhì)分解成微生物蛋白以及揮發(fā)性脂肪酸(VFA)，同時(shí)在維持宿主消化道穩(wěn)態(tài)及免疫健康等方面也發(fā)揮著重要作用。本試驗(yàn)旨在探究飼糧中添加海藻對(duì)山羊瘤胃內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)的影響，為海藻飼料的應(yīng)用提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2017年8-11月在西北農(nóng)林科技大學(xué)薩能奶山羊原種場(chǎng)進(jìn)行。選擇16只6月齡的西農(nóng)薩能奶山羊青年公羔(21.9±0.98 kg)。采用單因素隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，隨機(jī)分為對(duì)照組(C)和試驗(yàn)組(A)，每組4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)2只公羔在一個(gè)圈內(nèi)。對(duì)照組羔羊飼喂TMR基礎(chǔ)日糧，試驗(yàn)組羔羊飼喂TMR基礎(chǔ)日糧+3%海藻(Schizochytrium sp.，粗脂肪(EE)≥ 60%, DHA ≥ 12%; 天津奧特奇生物制品有限公司)。試驗(yàn)期共89d，其中預(yù)飼期5d，正飼期12周。每日8：00和16：00飼喂2次，自由飲水?；A(chǔ)飼糧組成和營(yíng)養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.2 瘤胃液樣品采集

試驗(yàn)最后一天早晨7：30從每個(gè)重復(fù)內(nèi)隨機(jī)選擇一只羔羊，即每組4只，共8只羔羊，通過(guò)真空泵采集瘤胃液。每只羊采集50 mL，迅速測(cè)定pH后，經(jīng)4層消毒紗布過(guò)濾，將濾液4 000 r/min離心15 min后取5 mL瘤胃液液氮速凍，之后送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限責(zé)任公司。

1.3 DNA 抽提、PCR 擴(kuò)增和熒光定量

1.4 Miseq文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序

通過(guò)PCR將Illumina官方接頭序列添加至目標(biāo)區(qū)域外端，使用凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris-HCl緩沖液洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測(cè)，氫氧化鈉變性，產(chǎn)生單鏈DNA片段，送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行Miseq測(cè)序。

1.5 生物信息分析及統(tǒng)計(jì)處理

利用上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司提供的生信Usearch分析平臺(tái)對(duì)Miseq測(cè)序得到的PE reads首先根據(jù)overlap關(guān)系進(jìn)行拼接，同時(shí)對(duì)序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控和過(guò)濾，區(qū)分樣本后采用RDP classifier貝葉斯算法對(duì)97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析，使用RDP分類器classifier tool(http://rdp.cme.msu.edu/)對(duì)16s序列進(jìn)行物種分類注釋，最低分類到種水平，使用 Silva 數(shù)據(jù)庫(kù)(SSU123)比對(duì)，置信度閾值設(shè)置為 0.7。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010進(jìn)行初步整理，結(jié)果用 x±s表示，P<0.05表示差異顯著。利用R語(yǔ)言工具制作曲線圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 瘤胃微生物多樣性

2.1.1 瘤胃微生物測(cè)序深度和OTU分析 試驗(yàn)8個(gè)樣品共得到406 316條原始序列，平均每個(gè)樣品50 790±5 529條。對(duì)序列進(jìn)行優(yōu)化后按照97%相似度對(duì)序列進(jìn)行OTU聚類，其中有效序列278 740條，共聚類得到1 236條OTU。對(duì)OTU序列進(jìn)行物種注釋發(fā)現(xiàn)OTU序列共覆蓋20個(gè)門，41個(gè)綱，77個(gè)目，126個(gè)科，264個(gè)屬及447個(gè)種的細(xì)菌。對(duì)OUT序列進(jìn)行門水平核心物種分析(圖1A)，發(fā)現(xiàn)樣本量>4時(shí)，核心菌門為12，核心菌門不再隨樣本量增加而增加，表明測(cè)序樣本量充足(圖1B)。由稀釋性曲線圖可以看出，各樣本稀釋曲線均趨于平緩。當(dāng)原始序列數(shù)>20000時(shí)，得到的物種數(shù)量增加趨勢(shì)緩慢，說(shuō)明在原始序列數(shù)>20000的測(cè)序深度條件下，測(cè)序結(jié)果可以覆蓋絕大多數(shù)的瘤胃微生物。同時(shí)在測(cè)序深度相同時(shí)，對(duì)照組相比于試驗(yàn)組可以覆蓋到更多的微生物。

圖1 Sobs曲線(a)和核心物種曲線(b)

2.1.2 瘤胃微生物群落α多樣性分析 α 多樣性分析是用來(lái)反映微生物群落的豐富度和多樣性，并可通過(guò)一系列的統(tǒng)計(jì)分析指標(biāo)對(duì)環(huán)境群落的物種豐富度和多樣性進(jìn)行估計(jì)分析。由表3可知，在瘤胃微生物群落α多樣性分析中，群落豐富度指數(shù)chao 1、ace海藻添加組顯著小于對(duì)照組(<0.05)，表明海藻添加組瘤胃微生物群落豐富度顯著低于對(duì)照組；群落多樣性指數(shù)Simpsen、shannon和群落均勻度指數(shù)shannoneven兩組差異不顯著(>0.05)，群落覆蓋度指數(shù)Coverage指數(shù)兩組均大于99%。

表2 飼糧中添加海藻對(duì)西農(nóng)薩能奶山羊公羔瘤胃微生物α多樣性指數(shù)的影響

2.2 瘤胃微生物物種組成分析

圖2為門水平上兩組共有微生物群落分布圖。占菌群種類總數(shù)1%以上的有擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、螺旋體門(Spirochaetes)、纖維桿菌門(Fibrobacteres)、變形菌門(Proteobacteria)和放線菌門(Actinobacteria)等，分別占菌群總數(shù)的54.03%、37.44%、1.88%、1.58%、1.4%和1.0%。其中擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)占菌群總數(shù)的91%以上，是瘤胃中最重要的菌門。

圖2 門水平上兩組共有微生物群落分布圖

2.3 瘤胃微生物比較分析

圖3a中Stress<0.05，表明該NMSD結(jié)果有很好的代表性。A組和C組的各自的4個(gè)樣本點(diǎn)互相接近，且通過(guò)分組橢圓可以將兩組樣本清晰的分開，分組橢圓無(wú)交叉。圖3b中兩組樣本OTU水平聚類效果明顯。均表明兩組組內(nèi)樣本組成相似，樣本間差異明顯。

圖3 瘤胃微生物比較分析

在門水平上，由圖4a可以看出添加海藻的試驗(yàn)組纖維桿菌門(Fibrobaceters)和螺旋體菌門(Saccharibacteria)相對(duì)豐度顯著低于對(duì)照組(<0.05)，其余菌門差異均不顯著(>0.05)。在屬水平上，由圖4b可以看出添加海藻的試驗(yàn)組未知屬型擬桿菌BS11(norank_f__Bacteroidales_BS11_gut_group)、纖維桿菌屬(Fibrobacter)和瘤胃球菌屬_NK4A214(Ruminococcaceae_NK4A214_group)相對(duì)豐度顯著低于對(duì)照組(<0.05)。

圖4 門水平(a)和屬水平(b)上的物種差異分析

3 討 論

青年羊瘤胃占全胃的比例在60%左右，飼糧對(duì)瘤胃內(nèi)發(fā)酵主要是通過(guò)影響瘤胃菌群區(qū)系或功能來(lái)實(shí)現(xiàn)。腸道中的厚壁菌門和擬桿菌門有利于動(dòng)物消化植物來(lái)源的食物，較高含量的厚壁菌門和擬桿菌門是植食性動(dòng)物腸道微生物群落的典型特征。曾燕等報(bào)道蒙古羊瘤胃中主要優(yōu)勢(shì)菌群為擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)。索效軍等報(bào)道的湖北黑頭羊中擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)占菌群總數(shù)的90%以上。本研究發(fā)現(xiàn)，奶山羊瘤胃中擬桿菌門(Bacteroidetes,54.03%)和厚壁菌門(Firmicutes,37.44%)占菌群總數(shù)的91%以上，與上述結(jié)果一致，表明飼糧中添加海藻不會(huì)改變山羊瘤胃中的主要優(yōu)勢(shì)菌門。

海藻中富含多糖類、多酚類等生物活性物質(zhì)，具有較好的抗氧化活性和抗菌活性，能有效抑制和清除動(dòng)物體內(nèi)活性氧自由基。抑菌相關(guān)試驗(yàn)表明藻類中的一些成分可以減少細(xì)菌、原生動(dòng)物、古細(xì)菌、真菌的復(fù)雜瘤胃微生物群。白建等選取1日齡體重相近的AA肉雞，發(fā)現(xiàn)添加海藻粉和抗菌肽降低了21和42日齡肉雞盲腸大腸桿菌的數(shù)量。Leonard 等研究發(fā)現(xiàn)添加海藻提取物后仔豬結(jié)腸大腸桿菌種群和腸桿菌科數(shù)量顯著減少，結(jié)腸中具有更高水平的黏蛋白 MUC2 m RNA 豐度。本試驗(yàn)在山羊飼糧中添加3%海藻，瘤胃中纖維桿菌門(Fibrobaceters)和螺旋體菌門(Saccharibacteria)豐富度指數(shù)chao 1和ace顯著降低，與上述結(jié)果一致，表明添加海藻降低了山羊瘤胃微生物群落的豐富度，可能原因是海藻中多糖和多酚等物質(zhì)的抑菌作用引起的。

瘤胃球菌屬是消化球菌科(Peptoeaccaeeae)的革蘭氏陽(yáng)性厭氧細(xì)菌，其下的兩個(gè)種白色瘤胃球菌、黃色瘤胃球菌和屬于纖維桿菌門的產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌是現(xiàn)今公認(rèn)的瘤胃三大優(yōu)勢(shì)纖維分解菌。白色瘤胃球菌和黃色瘤胃球菌均能產(chǎn)生大量的纖維素酶和半纖維素酶，是降解木聚糖主要的細(xì)菌。產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌能產(chǎn)生高水平的內(nèi)切纖維素酶和β-葡萄糖苷酶，是降解重鈣化纖維素，如棉花粗纖維素的重要細(xì)菌。Zeng等在山羊日糧中添加烷基多糖苷后改變了瘤胃細(xì)胞膜上的脂肪酸組成，降低了白色瘤胃球菌的數(shù)量。這與本試驗(yàn)添加海藻后瘤胃球菌屬_NK4A214(_NK4A214_group)顯著下降的結(jié)果一致，推測(cè)可能原因是由于海藻中一些多糖類作用引起的。李旦等發(fā)現(xiàn)在肉牛瘤胃日糧中添加4%的豆油和胡麻油可以顯著減少瘤胃中纖維分解菌，表明飼糧中植物油脂中某些脂肪酸可能對(duì)纖維分解菌有抑制作用。孫云章等研究表明，隨著精料比例的增大, 瘤胃真菌數(shù)量逐漸降低直到消失, 細(xì)菌數(shù)量逐漸上升，當(dāng)精料增加到一定水平時(shí)，瘤胃內(nèi)的低 pH 環(huán)境最終會(huì)抑制纖維降解菌的生長(zhǎng)。柳君輝等發(fā)現(xiàn)，高精料模式下肉牛瘤胃中門水平上的纖維桿菌數(shù)量下降。本試驗(yàn)結(jié)果表明，基礎(chǔ)日糧中添加3%海藻可以顯著降低山羊未知屬型擬桿菌BS1(norank_f___BS11_gut_group)、纖維桿菌屬()，可能原因是海藻中豐富的脂肪酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)抑制了山羊瘤胃中的纖維素降解菌的數(shù)量。層級(jí)聚類和NMSD分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，可通過(guò)比較瘤胃微生物進(jìn)而區(qū)分試驗(yàn)組與對(duì)照組，試驗(yàn)組又以某種新的相似性而獨(dú)自聚合，表明飼糧中添加海藻可以顯著影響山羊瘤胃微生物的結(jié)構(gòu)，使其具有新的群落特點(diǎn)。綜上所述，添加海藻對(duì)山羊瘤胃微生物區(qū)系具有顯著的影響，更深入的原因還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

飼糧中添加海藻顯著影響青年山羊瘤胃群落結(jié)構(gòu)，降低瘤胃微生物群落豐富度，降低了瘤胃中纖維桿菌和瘤胃球菌等主要纖維降解菌的相對(duì)豐度。