產(chǎn)木聚糖酶微生物的篩選鑒定及特性分析

趙龍妹，張迎燕，李 旺，李元曉，曹平華，何萬領(lǐng)

(河南科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，河南 洛陽 471023)

木聚糖是自然界中含量最高的半纖維素，是由以β-1,4-糖苷鍵連接的吡喃木糖殘基構(gòu)成的骨架組成的復(fù)雜多聚物。根據(jù)植物種類的不同，木聚糖的含量和結(jié)構(gòu)組成差異較大。中國纖維類農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品種類多、數(shù)量大，其中玉米芯木聚糖含量較高，約為35%～40%。中國畜牧業(yè)面臨著飼料資源短缺的問題，若能有效利用微生物和酶對(duì)農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物中難以被消化吸收的物質(zhì)進(jìn)行降解，就可以實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品高值化、營養(yǎng)化，緩解飼料資源緊張的現(xiàn)狀。纖維類農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物中主要包括大量纖維素、木聚糖等半纖維素以及少量的木質(zhì)素、果膠，其中木聚糖包裹著纖維素，阻礙纖維素的酶解，因此，降解木質(zhì)纖維類物質(zhì)的關(guān)鍵是解除阻礙，增加酶與纖維素接觸的機(jī)會(huì)。木聚糖經(jīng)酶解后可生成低聚木糖，這種益生元還能夠維護(hù)動(dòng)物胃腸道微生態(tài)平衡。

對(duì)多纖維物質(zhì)的降解有兩個(gè)途徑：一是利用水解酶進(jìn)行直接降解；另一個(gè)是利用產(chǎn)酶微生物進(jìn)行生物發(fā)酵降解；后者降解更充分，因此需要篩選獲得高效產(chǎn)酶微生物。而決定篩菌是否成功的關(guān)鍵在于樣品的選擇和篩選方案的設(shè)計(jì)。不同的樣品特征決定其中所含微生物的種類，不同的篩選方案和樣品處理方法會(huì)導(dǎo)致所獲得的目的菌株的差異。因此，本研究選擇不同樣品(土壤、山羊瘤胃內(nèi)容物、山羊腸道內(nèi)容物和山羊糞便)，以自制木聚糖為唯一底物從中篩選產(chǎn)木聚糖酶微生物并對(duì)其進(jìn)行鑒定和特性分析。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣品

取放牧山羊草地表層土壤及10 cm深處土壤混合物，4 ℃保存并立即進(jìn)行樣品處理。選取體重55 kg的1.5歲雌性波爾山羊進(jìn)行解剖，分別取瘤胃內(nèi)容物20 mL、腸道后段內(nèi)容物適量和山羊新鮮糞便適量置于滅菌離心管中，4 ℃保存并立即進(jìn)行樣品處理。

1.2 主要儀器設(shè)備

立式高壓蒸汽滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠)，雙人單面超凈工作臺(tái)(SW-CJ-2FD，蘇州凈化設(shè)備有限公司)，電子精密天平(JA2003，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)，恒溫?fù)u床(SKY-2112B，上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司)，恒溫培養(yǎng)箱(DNP-9272BS-Ⅲ，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)，高速臺(tái)式離心機(jī)(TGL-16B，上海安亭科學(xué)儀器廠)，酶標(biāo)儀(ReadMax 1000F，上海閃譜生物科技有限公司)，生物顯微鏡(CX31，購于奧林巴斯有限公司)。

1.3 主要試劑和培養(yǎng)基

自制木聚糖：利用堿法提取玉米芯中的木聚糖；胰蛋白胨和酵母浸粉：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；硝酸鈉、磷酸氫二鉀等試劑均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid，DNS)試劑：參照文獻(xiàn)[7-8]配制；初篩固體培養(yǎng)基：自制木聚糖10 g，NaNO2.0 g，KHPO1.0 g，KCl 0.5 g，MgSO0.5 g，F(xiàn)eSO0.01 g，瓊脂 20 g，蒸餾水1 000 mL；復(fù)篩固體培養(yǎng)基：KHPO1.31 g，KCl 0.5 g，MgSO0.5 g，NaNO2 g，F(xiàn)eSO0.002 g，自制木聚糖 5 g，胰蛋白胨 10 g，酵母浸粉 5 g，瓊脂 20 g，蒸餾水 1 000 mL；液體發(fā)酵培養(yǎng)基：KHPO1.31 g，KCl 0.5 g，MgSO0.5 g，NaNO2 g，F(xiàn)eSO0.002 g，自制木聚糖 5 g，胰蛋白胨 10 g，酵母浸粉 5 g，蒸餾水 1 000 mL；產(chǎn)蛋白酶篩選固體培養(yǎng)基：蛋白胨5.0 g，酵母粉5.0 g，葡萄糖10.0 g，磷酸氫二鉀4.0 g，瓊脂20.0 g，脫脂奶粉 2 g，蒸餾水 1 000 mL；121 ℃，0.11 MPa滅菌25 min，制備固體平板培養(yǎng)基或直接冷卻備用。

1.4 產(chǎn)木聚糖酶微生物的篩選

1.4.1 初篩 分別取1 g樣品置于50 mL離心管中，加入9 mL 無菌生理鹽水，置于搖床中振蕩均勻，使用滅菌生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋，將適當(dāng)稀釋的樣品均勻涂布于初篩固體培養(yǎng)基上，將平板倒置于30 ℃條件下培養(yǎng)24～48 h，直至菌落長出。

1.4.2 復(fù)篩 將初篩固體培養(yǎng)基上長勢(shì)良好的單菌落接種于復(fù)篩固體培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)24～48 h，菌落長出后先用1 mg/mL 剛果紅染色3 h，然后用1 mol/L NaCl溶液進(jìn)行脫色，根據(jù)透明圈和菌落的大小篩選具有較強(qiáng)木聚糖降解能力的菌株。篩選出的菌株30 ℃ 200 r/min條件下培養(yǎng)24～48 h，取菌液12 000 r/min離心5 min，使用DNS法測(cè)定發(fā)酵上清液中的木聚糖酶活力，根據(jù)木聚糖酶活力大小確定目的菌株。

1.5 產(chǎn)木聚糖酶微生物的鑒定

1.5.1 形態(tài)學(xué)鑒定 挑取單菌落接種于復(fù)篩固體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)24～48 h，觀察平板上長出單菌落的形態(tài)特征，并對(duì)其進(jìn)行革蘭染色鏡檢，觀察菌體特征，根據(jù)伯杰細(xì)菌手冊(cè)對(duì)其進(jìn)行鑒定。

1.5.2 分子生物學(xué)鑒定及遺傳多樣性分析 挑取單菌落接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃ 200 r/min條件下培養(yǎng)18～24 h，提取基因組，使用16S rDNA通用引物(27f：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；1492r：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲取16S rDNA片段，送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，將獲得的序列信息在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行比對(duì)分析，并通過GenBank下載相似性高的序列，使用MEGA X軟件通過NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析產(chǎn)木聚糖酶微生物之間以及與其他菌株的遺傳學(xué)關(guān)系。

1.6 木聚糖酶酶學(xué)特性分析

1.6.1 木聚糖酶活力測(cè)定 取適量菌液，12 000 r/min離心5 min，上清即為粗酶液。木聚糖酶活力測(cè)定方法參考《飼料添加劑木聚糖酶活力的測(cè)定 分光光度法》，使用DNS法進(jìn)行測(cè)定。木聚糖酶活力定義：在一定溫度和pH條件下，每分鐘水解1%自制木聚糖產(chǎn)生1 μmol還原糖(木糖)對(duì)應(yīng)的酶量為一個(gè)酶活力單位(U)。

1.6.2 最適反應(yīng)溫度 在一定pH條件下，將適當(dāng)稀釋的粗酶液與1%自制木聚糖底物溶液分別于30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃條件下反應(yīng)，測(cè)定木聚糖酶活力大小，確定最適反應(yīng)溫度。

1.6.3 最適反應(yīng)pH 配制pH為3.0～7.0的0.2 mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液和pH為8.0～10.0的0.2 mol/L甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液，在一定溫度條件下，分別測(cè)定粗酶液于pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0條件下的木聚糖酶活力大小，確定最適反應(yīng)pH。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)木聚糖酶微生物的篩選與鑒定

2.1.1 菌株篩選 經(jīng)過初篩，從土壤、山羊腸道內(nèi)容物、瘤胃內(nèi)容物和糞便中共篩選到9個(gè)株菌，分別接種于復(fù)篩固體培養(yǎng)基上，經(jīng)剛果紅染色和NaCl脫色后，其透明圈如圖1所示。木聚糖酶活力測(cè)定結(jié)果見表1。選取酶活力最高的3株菌YL3-2-1、YF-2-1和T2-2-1進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)分析。

表1 篩選菌株的透明圈、菌落直徑和酶活

圖1 9株菌在平板上的透明圈

2.1.2 菌株形態(tài)學(xué)鑒定 YL3-2-1、YF-2-1和T2-2-1在30 ℃培養(yǎng)24 h，其菌落形態(tài)和鏡檢結(jié)果如圖2A和圖3所示。菌株YF-2-1在平板上的菌落近圓形，暗白色，不透明，表面干燥呈褶皺狀，褶皺菌膜內(nèi)呈粘液狀，經(jīng)革蘭染色鏡檢發(fā)現(xiàn)該菌為革蘭陽性菌，多為單桿菌，少數(shù)菌體內(nèi)可見芽孢；菌株YL3-2-1在平板上的菌落為圓形或不規(guī)則形，色暗，呈奶油色，表面濕潤，經(jīng)革蘭染色后鏡檢可觀察到其為革蘭陽性菌，呈桿狀，少數(shù)菌體內(nèi)可見芽孢；菌株T2-2-1在平板上菌落呈圓形，暗白色，表面變厚，無褶皺，經(jīng)革蘭染色鏡檢發(fā)現(xiàn)其為革蘭陽性菌，多為單桿菌，極少數(shù)雙桿菌，個(gè)別菌體內(nèi)可見芽孢。查閱《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)(第八版)》，初步鑒定3株菌均為芽孢桿菌。此外，使用產(chǎn)蛋白酶篩選固體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)3株菌均具有蛋白酶活性，其中YF-2-1與T2-2-1較明顯(圖2B)。

圖2 3株菌的菌落形態(tài)以及產(chǎn)蛋白酶透明圈

圖3 3株菌的鏡檢圖

2.1.3 菌株分子生物學(xué)鑒定 將測(cè)序獲取的16S rDNA序列在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST，并通過MEGA X使用鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)菌株YL3-2-1與高地芽孢桿菌()同源性最高，相似性為99.86%、菌株YF-2-1與貝萊斯芽孢桿菌()同源性最高，相似性為99.93%，菌株T2-2-1與貝萊斯芽孢桿菌()同源性最高，相似性為100%，故將菌株YL3-2-1鑒定為高地芽孢桿菌()、將菌株YF-2-1和T2-2-1鑒定為貝萊斯芽孢桿菌()。

2.2 序列分析

將分離獲得的3株芽孢桿菌的16S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的相關(guān)菌株序列進(jìn)行同源性分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并分析3株菌及其與其他相關(guān)菌株之間的親緣關(guān)系，結(jié)果見圖4。

YL3-2-1菌株與6株相關(guān)菌株聚類后分為2個(gè)主要分支，其中較大分支又由2個(gè)小分支組成，在其中1個(gè)小分支中可見菌株YL3-2-1與MN511801.1聚為一支(圖4A)。

圖4 3株產(chǎn)木聚糖酶芽孢桿菌與Genbank相關(guān)菌株的16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹

YF-2-1菌株與4株相關(guān)菌株聚類后分為2支，其中較大分支又分為2個(gè)小分支，在其中1個(gè)小分支中可見菌株YF-2-1與MK070084.1聚為一支(圖4B)。

T2-2-1菌株與4株相關(guān)菌株聚類后分為2支，其中較小分支中可見菌株T2-2-1與MF620083.1聚為一支(圖4C)。

本試驗(yàn)獲得的3株菌與Genbank數(shù)據(jù)庫收錄的5株相關(guān)菌株聚類后分為2個(gè)主要分支，每個(gè)主要分支又由2個(gè)小分支組成，其中一個(gè)主要分支中可見T2-2-1與MF620083.1聚為1支后，又與YL3-2-1聚為1支，另一個(gè)主要分支中可見YF-2-1與MK070084.1聚為1支，YL3-2-1、YF-2-1和T2-2-1有一定的親緣關(guān)系(圖4D)。

2.3 木聚糖酶酶學(xué)特性分析

試驗(yàn)獲得的3個(gè)菌株所產(chǎn)木聚糖酶測(cè)定結(jié)果見圖5。YL3-2-1所產(chǎn)木聚糖酶最適反應(yīng)pH為7.0，在pH 6.0～8.0之間能夠發(fā)揮70%以上的酶活；最適反應(yīng)溫度為60 ℃，且在70 ℃條件下能夠發(fā)揮90 %以上的酶活，在30～70 ℃之間能夠發(fā)揮70 %以上的酶活，此木聚糖酶為中性木聚糖酶。

圖5 3株菌所產(chǎn)木聚糖酶最適反應(yīng)條件

YF-2-1所產(chǎn)木聚糖酶最適反應(yīng)pH為5.0，當(dāng)pH下降時(shí)，酶活急劇下降，在pH 5.0～8.0之間，能夠發(fā)揮60 %以上的酶活；最適反應(yīng)溫度為60 ℃，在50～70 ℃之間能夠發(fā)揮70%以上的酶活，說明該酶為酸性木聚糖酶。

T2-2-1所產(chǎn)木聚糖酶最適反應(yīng)pH為5.0，隨著pH下降，酶活急劇降低，在pH 5.0～8.0之間，能夠發(fā)揮60 %以上的酶活；最適反應(yīng)溫度為50 ℃，在30～70 ℃之間能夠發(fā)揮60%以上的酶活，說明該酶是一種酸性木聚糖酶。

3 討 論

現(xiàn)階段，對(duì)于木質(zhì)纖維類的廢棄物的開發(fā)利用是畜牧業(yè)、飼料業(yè)乃至整個(gè)輕工業(yè)的研究熱點(diǎn)，中國木質(zhì)纖維類廢棄物種類多、數(shù)量大，如果能夠?qū)ζ溥M(jìn)行充分的開發(fā)利用，有利于推進(jìn)中國畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，在一定程度上緩解飼料資源短缺的現(xiàn)狀。木質(zhì)纖維類物質(zhì)中半纖維素的降解能夠增加其他酶與底物的接觸機(jī)會(huì)，而含量較多的半纖維素為木聚糖，因此有效水解木聚糖有利于木質(zhì)纖維類物質(zhì)的高效利用。目前研究較多的產(chǎn)纖維素酶或半纖維素酶微生物是真菌，且大多需要對(duì)其所產(chǎn)酶進(jìn)行純化后添加在底物中發(fā)揮作用，而如果能開發(fā)一種產(chǎn)木聚糖酶益生菌，可直接用于木質(zhì)纖維類物質(zhì)的發(fā)酵，能夠?qū)崿F(xiàn)在降解纖維大分子的同時(shí)分泌活性產(chǎn)物，包括各種酶類、活性肽類等。本研究篩選到的3株產(chǎn)木聚糖酶菌皆為芽孢桿菌，包括高地芽孢桿菌和貝萊斯芽孢桿菌，它們與枯草芽孢桿菌的親緣關(guān)系較近，芽孢桿菌是比較常見的一種用于單胃動(dòng)物的益生素，而枯草芽孢桿菌也在中國制定的《允許使用的飼料添加劑品種目錄》中，可對(duì)其進(jìn)一步開發(fā)，作為靶向降解木聚糖的發(fā)酵菌種或者編碼木聚糖酶蛋白基因的供體菌，用于新型飼料添加劑的開發(fā)利用。

酶發(fā)揮作用的關(guān)鍵是合適的反應(yīng)條件，飼料添加劑中木聚糖酶發(fā)揮作用的環(huán)境主要有兩種，一個(gè)是動(dòng)物體外環(huán)境，反應(yīng)條件易控；另一個(gè)是動(dòng)物體內(nèi)環(huán)境，根據(jù)動(dòng)物消化道的不同位置，溫度和pH有所差異。酸性酶可在動(dòng)物的胃部發(fā)揮作用，對(duì)大分子進(jìn)行降解，中性酶可在家禽的嗉囊和小腸中發(fā)揮作用，堿性酶可在小腸中發(fā)揮作用。有研究報(bào)道稱，飼料用酶若要在動(dòng)物消化道中發(fā)揮作用，需要在40 ℃左右，pH 4.8左右具有較好活性。本研究中篩選獲得的產(chǎn)酶微生物所產(chǎn)的木聚糖酶為中性和酸性木聚糖酶，在動(dòng)物體內(nèi)胃部和腸道中能發(fā)揮一定的水解作用。目前關(guān)于產(chǎn)木聚糖酶微生物的研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)堿性木聚糖酶產(chǎn)自芽孢桿菌，大多數(shù)酸性木聚糖酶產(chǎn)自木霉、曲霉和青霉，而本研究中篩選獲得產(chǎn)中性和酸性木聚糖酶芽孢桿菌，拓寬了產(chǎn)木聚糖酶芽孢桿菌的應(yīng)用范圍。

自然界中的微生物資源十分豐富，目前已經(jīng)被分離到的微生物僅僅占自然界微生物資源的小部分，而其中得到有效開發(fā)利用的更是少之又少，因此，掌握高效的篩菌方法才能夠從自然界浩瀚的微生物資源中篩選到最理想的菌株。樣品的選擇是篩菌的第一步，也是決定篩菌成功與否的關(guān)鍵。本研究發(fā)現(xiàn)動(dòng)物胃腸道中微生物的多樣性與動(dòng)物生長環(huán)境中的微生物多樣性息息相關(guān)，針對(duì)3株菌共同做的系統(tǒng)發(fā)育樹分析中發(fā)現(xiàn)從土壤中篩選獲得的芽孢桿菌T2-2-1與從山羊瘤胃內(nèi)容物中篩選獲得的芽孢桿菌YL3-2-1以及從山羊糞便中篩選獲得的芽孢桿菌YF-2-1有著較近的親緣關(guān)系。也有研究發(fā)現(xiàn)，從山羊瘤胃內(nèi)容物中分離獲得的1株芽孢桿菌與中國某地區(qū)蜈蚣草根際土壤中分離的1株芽孢桿菌(KP986945)親緣關(guān)系較近，推測(cè)可能隨牧草進(jìn)入瘤胃中，說明山羊瘤胃中微生物多樣性可能極大程度受到山羊采食植物及周邊土壤中微生物多樣性的影響，而糞便中微生物多樣性也由此受到影響，由于反芻動(dòng)物會(huì)將瘤胃食物進(jìn)行反芻咀嚼，瘤胃內(nèi)微生物多樣性可能也同樣會(huì)影響到放牧土地生態(tài)環(huán)境中的微生物多樣性。因此，選擇篩菌樣品時(shí)，除了動(dòng)物消化道和糞便外，還可擴(kuò)大范圍，將動(dòng)物生長環(huán)境中的水、土壤或植物作為第二樣品，進(jìn)行目的菌的分離篩選，提高篩選成功的幾率。

4 小 結(jié)

本研究從土壤、山羊瘤胃內(nèi)容物和山羊糞便中各篩選出1株產(chǎn)木聚糖酶芽孢桿菌，通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法分別將其鑒定為貝萊斯芽孢桿菌、高地芽孢桿菌和貝萊斯芽孢桿菌；對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹分析發(fā)現(xiàn)山羊瘤胃微生物多樣性可能受到土壤微生物多樣性的影響；對(duì)其所產(chǎn)木聚糖酶的酶學(xué)特性進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，最適反應(yīng)條件分別為50 ℃、pH 5.0，60 ℃、pH 7.0和60 ℃、pH 5.0，3株菌均能夠分泌蛋白酶，其中YF-2-1與T2-2-1具有明顯的產(chǎn)蛋白酶特性。產(chǎn)木聚糖酶芽孢桿菌的獲取為新型飼料添加劑和生物飼料的制備提供材料，來自土壤和動(dòng)物消化道產(chǎn)木聚糖酶微生物的遺傳學(xué)分析也為篩菌樣品的選擇提供了理論依據(jù)。