肺炎支原體混合EB病毒感染的臨床免疫特征分析

高頌軼，趙文靜，謝紫陽，李延琪，侯紅紅，劉 穎，王 欣，田 恬

(1.西安市中心醫(yī)院兒科，陜西 西安 710003；2.西安市兒童醫(yī)院呼吸一科，陜西 西安 710004)

肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae，MP)是引起各年齡段兒童急性上、下呼吸道感染的常見病原體，尤其是社區(qū)獲得性肺炎(community acquired pneumonia，CPA)的常見病原體之一[1]。近年發(fā)現(xiàn)，兒童大葉性肺炎發(fā)病年齡有向小年齡段發(fā)展的趨勢，且支原體感染臨床表現(xiàn)為大葉性肺炎的情況在臨床上也越來越多見。部分支原體感染患兒表現(xiàn)為大葉性肺炎，經大環(huán)內酯類抗生素治療后，體溫下降緩慢，熱程明顯延長，合并胸腔積液及肺不張發(fā)生率高，甚至發(fā)生肺壞死，對大環(huán)內酯類藥物的耐藥率也在逐漸升高[2]。EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)是一種親人類B淋巴細胞的皰疹病毒，臨床上發(fā)現(xiàn)兒童肺炎支原體肺炎合并EBV感染并不少見，發(fā)病率逐年升高[3-4]，在兩者同時感染時，有可能會帶來臨床上的治療困難。MP感染及EBV感染時均可引起免疫損傷及免疫紊亂，因此研究二者混合感染時的臨床特征、合發(fā)癥的發(fā)生率、體液免疫和細胞免疫特點等問題，可進一步分析其對導致重癥肺炎及對難治性支原體感染的影響，從而有助于指導臨床中免疫干預、免疫調節(jié)治療，為預防嚴重并發(fā)癥的發(fā)生提供依據(jù)。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

本研究為前瞻性設計，選取2017年1月至2018年12月西安市中心醫(yī)院和西安市兒童醫(yī)院收治的99例大葉性肺炎患兒為研究對象。根據(jù)《兒科學》[5]中的標準診斷MP感染(單次MP抗體滴度≥1∶160可作為診斷MP近期感染或急性感染的參考；恢復期和急性期MP抗體滴度呈4倍及以上增高或降低時，可確診為MP感染)和/或EBV感染(血清EBV早期抗原抗體(immunoglobulin G，IgG)陽性和/或衣殼抗原抗體(immunoglobulin M，IgM)陽性，同時伴有外周血PCR EBV-DNA定量>103IU/mL，提示現(xiàn)癥EBV感染)。

按照患兒感染不同病原進行分組，MP混合EBV感染為組1(MP+EBV+，24例)，有MP感染無EBV感染為組2(MP+EBV-，40例)，無MP和EBV感染為組3(MP-EBV-，35例：有相關證據(jù)表明為大葉性肺炎，但除外MP和EBV相關檢測陽性)。

1.2 納入與排除標準

納入標準：①患兒年齡為3～11歲；②所有患兒均符合《兒科學》[5]中對大葉性肺炎的相關診斷標準，胸片檢查發(fā)現(xiàn)患兒一個肺段、肺葉甚至全肺出現(xiàn)大片狀致密實變陰影；③病例資料完整；④與患兒家屬均簽署知情同意書。排除標準：①肺氣腫、肺結核、支氣管哮喘；②先天性心臟病；③自身免疫性疾??；④腫瘤疾??；⑤呼吸系統(tǒng)畸形或異物吸入；⑥長期應用糖皮質激素；⑦嚴重過敏。

該研究獲得西安市中心醫(yī)院倫理委員會批準[批準文號20200420(1)]和西安市兒童醫(yī)院倫理委員會批準(批準文號20200015)。

1.3 研究方法

1.3.1 評價指標

所有患兒入院后均觀察并記錄臨床癥狀、肺部體征、年齡、性別、熱程，以及并發(fā)癥情況，包括胸腔積液、液氣胸、肺不張，肝功異常、心肌損害、腦炎、神經系統(tǒng)癥狀等。記錄三組患兒治療期間的不良反應發(fā)生情況。

1.3.2 實驗室檢查

完善入院患兒的血常規(guī)、外周血異常淋巴細胞、C-反應蛋白、降鈣素原、肝腎功能、胸片、胸部CT、腹部超聲、未經治療前血清免疫球蛋白及淋巴細胞亞群檢測。采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測血清中MP-IgM濃度，效價≥1:80有意義；采用ELISA法測定血清EBV抗體，以上試劑盒購自德國歐蒙醫(yī)學實驗診斷股份有限公司。采用實時熒光定量PCR(polymerase chain reaction，PCR)法測定EB-DNA定量，試劑盒購自廣州中山大學達安基因股份有限公司，儀器為美國BIO-RAD公司的Lcycleriq熒光定量PCR儀。血清免疫球蛋白試劑盒購自德國西門子醫(yī)學診斷產品有限公司。采用邁瑞B(yǎng)riCyteE6流式細胞儀測定外周血T淋巴細胞及其亞群、B淋巴細胞。嚴格按試劑盒說明書進行操作。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 治療及轉歸的情況

在確診MP后，>1歲者給予靜滴阿奇霉素(國藥準字：H20020254，規(guī)格：0.5g)10mg·kg-1·d-1，用藥5d，間隔4d，再次序貫治療口服阿奇霉素(國藥準字：H10960112，規(guī)格：0.1g)10mg·kg-1·d-1，用藥3d；≤1歲者給予紅霉素(國藥準字：H21021678，規(guī)格：0.25g)20～30mg·kg-1·d-1，總療程不短于2周。合并EBV感染者聯(lián)用重組人干擾素α-1b注射液(國藥準字：S20010006，規(guī)格：10μg)，1～2μg·kg-1·d-1，肌肉注射，療程為5d；靜滴阿昔洛韋(國藥準字：H20068119，規(guī)格：0.25g)5mg·kg-1·次-1，1次/8h，療程為7～14d。合并細菌感染者聯(lián)合應用頭孢類抗生素，并輔以止咳、化痰、平喘等對癥治療。在對出現(xiàn)影像學肺實變、胸腔積液及出現(xiàn)炎癥反應較重者，給予聯(lián)合甲潑尼龍琥珀酸鈉(國藥準字：HJ20170197，規(guī)格：40mg)抗炎治療，1～2mg·kg-1·d-1，療程為3～7d。全部患兒均臨床癥狀消失后出院，部分影像學未完全恢復者在門診隨診均吸收。

2.2 三組臨床指標的情況

2.2.1 三組基本資料的比較

三組患兒的年齡比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，組1與組2、組3的年齡比較差異均有統(tǒng)計學意義(t值分別為-2.825、-2.986，P<0.05)，組2與組3的年齡比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；三組的性別分布比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 三組患兒基本情況的比較Table 1 Comparison of basic information in the

2.2.2 三組臨床指標的比較

在三組患兒中，熱退時間、影像學恢復時間及住院時間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；組1與組2、組3的熱退時間比較均有明顯延長(t值分別為2.664、3.241，P<0.05)，組1與組3的影像學恢復時間和住院時間比較均有明顯延長(t值分別為2.019、3.583，P<0.05)，見表2。

表2 三組患兒臨床指標的比較Table 2 Comparison of clinical indicators in the three

2.2.3 三組并發(fā)癥的比較

三組的并發(fā)癥發(fā)生率比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，組1與組2、組3并發(fā)癥發(fā)生率比較均明顯升高(χ2值分別為4.156、10.717，P<0.05)；在所有出現(xiàn)的并發(fā)癥中，呼吸系統(tǒng)并發(fā)癥發(fā)生率最高(92.31%)，其次為臟器損害(46.15%)，血液系統(tǒng)損害(11.54%)，神經系統(tǒng)損害為0；三組間各個系統(tǒng)的并發(fā)癥發(fā)生率比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表3。

2.3 三組血清免疫球蛋白的情況

三組的IgM水平比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，組1與組2、組3的IgM水平比較均有明顯升高(t值分別為2.685、2.880，P<0.05)；三組的IgG和IgA水平比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表4。

表3 三組患兒并發(fā)癥發(fā)生率的比較[n(%)]Table 3 Comparison of the incidence of complications in three groups[n(%)]

表4 三組患兒血清免疫球蛋白水平的比較Table 4 Comparison of serum immunoglobulin levels among the three

2.4 三組淋巴細胞亞群情況

三組的CD8+、CD4+、CD4+/CD8+、T淋巴細胞、B淋巴細胞、自然殺傷細胞(natural killer cell，NK cell)水平比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；組1與組2、組3的CD8+水平比較均有明顯升高(t值分別為2.422、2.892，P<0.05)；組1、組2分別與組3的CD4+和CD4+/CD8+水平比較均有明顯下降(組1與組3比較，CD4+：t=-3.111，CD4+/CD8+：t=-4.708；組2與組3比較，CD4+：t=-3.365，CD4+/CD8+：t=-5.417，P<0.05)，組1、組2分別與組3的T淋巴細胞和B淋巴細胞水平比較均有明顯升高(組1與組3比較，T淋巴細胞：t=2.010；B淋巴細胞：t=2.334，P<0.05；組2與組3比較，T淋巴細胞：t=2.512；B淋巴細胞：t=3.243，P<0.05)；組1與組3的NK細胞水平比較明顯下降(t=-2.444，P<0.05)，見表5。

表5 三組患兒淋巴細胞亞群水平的比較Table 5 Comparison of lymphocyte subsets in three

3 討論

3.1 MP及EBV感染的臨床特征分析

MP感染導致大葉性肺炎，不僅損害呼吸系統(tǒng)，還可引起肺外臟器受累，例如心、肝、腎、皮膚、神經等多系統(tǒng)受損，且部分易進展為難治性肺炎支原體肺炎。EBV對于人類普遍易感，有調查資料顯示，3～5歲兒童血清EBV抗體陽性率為80.7%～100.0%，至10歲時已增至100.0%[6]。大多數(shù)人最初在兒童時感染EBV并可終生攜帶，EBV與人類多種疾病有關，病變可涉及全身多個系統(tǒng)和器官，首發(fā)癥狀亦多種多樣。有研究表明，當MP及EBV出現(xiàn)混合感染時，在免疫學機制上可能有重疊效應[7]。本研究顯示，MP混合EBV感染與單一的MP感染、無MP和EBV感染患兒相比，在熱退時間上有明顯延長，并發(fā)癥發(fā)生率明顯升高，且MP混合EBV感染與無MP和EBV感染患兒的影像學恢復時間和住院時間比較均有明顯延長(P<0.05)；考慮可能當混合感染時，疊加的免疫炎癥反應增強了其對組織器官的免疫損傷，可能造成的機體損傷及感染更加難以控制，更容易出現(xiàn)并發(fā)癥。有研究認為MP及EBV兩種病原相互作用導致的疾病損傷會加重，可有肺外并發(fā)癥發(fā)生率高及肝臟、心肌、血液系統(tǒng)損害嚴重等特點，從而出現(xiàn)更為明顯地包括肌酸激酶同工酶-MB(creatine kinase-mb，CK-MB)升高等表現(xiàn)[8-9]。本研究顯示，呼吸系統(tǒng)并發(fā)癥發(fā)生率最高(92.31%)，其次為臟器損害(46.15%)，再次為血液系統(tǒng)損害(11.54%)，神經系統(tǒng)損害為0；考慮免疫損傷的靶器官最主要仍為初始病灶(呼吸系統(tǒng))，其次為外周靶器官(肝臟、心肌等)。三組間各個系統(tǒng)的并發(fā)癥發(fā)生率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但就三組各系統(tǒng)的并發(fā)癥發(fā)生率顯示，MP混合EBV感染與單一的MP感染在呼吸系統(tǒng)并發(fā)癥發(fā)生率更高；考慮可能與本研究收錄的并發(fā)癥發(fā)生總例數(shù)較少有關。另外，本次納入的患兒多以肺部癥狀為首發(fā)，神經系統(tǒng)并發(fā)癥發(fā)生率為0，也與總樣本量偏少有關。但結合總體發(fā)病率情況，提示在臨床治療中，若出現(xiàn)病情轉變及治療效果不佳時，更應警惕呼吸系統(tǒng)并發(fā)癥的出現(xiàn)，與有關文獻[10-11]一致。

3.2 MP及EBV感染的免疫功能特征分析

目前認為MP感染引發(fā)肺炎與其導致免疫功能紊亂有關[12]。有研究證實，MP進入體內可影響B(tài)淋巴細胞過度激活、增殖、功能亢進，并產生各種自身抗體[13]。EBV作為一種嗜淋巴細胞DNA病毒，經由EBV侵犯B淋巴細胞，也可引起其抗原發(fā)生改變，繼而導致T淋巴細胞活化成細胞毒性T淋巴細胞，以清除被感染的B淋巴細胞[14]。本研究中均于治療前測定免疫球蛋白功能，MP混合EBV感染患兒的IgM水平均顯著高于單一的MP感染、無MP和EBV感染者(P<0.05)，提示大多數(shù)患兒處于感染早期狀態(tài)，分析可能在混合感染這兩種病原體時，肥大細胞與嗜酸性粒細胞進行有效結合，形成相應的感染特異性致敏狀態(tài)，故IgM水平明顯增高；而三組的IgG和IgA水平于感染初期無明顯差異，分析可能該兩項指標于感染中后期會出現(xiàn)相應變化，但本研究未評估中后期情況，故數(shù)據(jù)顯示三組之間無顯著性差異。

有研究表明，MP可通過影響固有免疫細胞(巨噬細胞、NK細胞)，使CD4+及CD4+/CD8+水平下降，并產生多種細胞因子，導致機體免疫清除功能障礙，從而達到免疫損傷的目的；且MP可直接侵入機體細胞及組織內，通過表面黏附蛋白黏附到宿主細胞，以其自身的抗原多態(tài)性進行免疫逃逸，導致慢性感染和重癥肺炎支原體肺炎的發(fā)生[15]。EBV感染時，患兒機體處于T淋巴細胞激活狀態(tài)，CD8+呈現(xiàn)高度活化及增殖狀態(tài)，可及時清除病毒感染細胞，但也可能導致T/B/NK細胞出現(xiàn)無限增長及轉化惡性疾病，并能通過多種生物調節(jié)機制與宿主共進化，達到免疫損傷及器官功能損害[3]。在EBV感染活動期，可引起機體免疫功能異常，可為單一致病或混合致病重要因素。本研究顯示，MP混合EBV感染、單一的MP感染的T淋巴細胞及B淋巴細胞水平均顯著高于無MP和EBV感染者，提示MP及EBV感染均可引起細胞免疫功能紊亂；而MP混合EBV感染分別與單一的MP感染、無MP和EBV感染相比，CD8+均顯著升高，提示在混合感染的同時，疊加的免疫因子異?？赡茉诩毎庖咛岢手性斐筛鼮轱@著的影響。MP混合EBV感染、單一的MP感染的CD4+及CD4+/CD8+較無MP和EBV感染者均明顯降低，提示MP和/或EBV感染時，機體固有的免疫消耗明顯增高，而MP混合EBV感染的NK細胞水平較無MP和EBV感染的明顯減少，也提示混合感染時，機體免疫消耗較為明顯，可能影響后期疾病恢復及導致再次感染的幾率升高。故在混合感染患兒中，應充分考慮其免疫消耗或免疫相對低下可能造成的后續(xù)影響。

3.3 MP及EBV感染的患兒年齡構成分析

本研究顯示，MP混合EBV感染在年齡上與單一的MP感染、無MP及EBV感染者均有顯著性差異，提示出現(xiàn)混合感染的患兒年齡相對較小，平均年齡為(5.19±1.24)歲，多為學齡前期兒童，該年齡段為EBV原發(fā)感染好發(fā)年齡[16]，可能與接觸環(huán)境(幼托內共同飲食生活)有相關，造成感染率相對過高，此外可能與該年齡段患兒免疫功能相對低于大年齡段兒童有關。

3.4 本研究的局限性

本研究中收集到無支原體感染，有EBV感染患兒的比例較低；這可能與EBV更多侵犯淋巴組織有關，故其在兒童中也以傳染性單核細胞增多癥(infectious mononucleosis，IM)、慢性活動性EBV感染(chronic active epstein-barr virus infection，CAEBV)及EBV相關噬血細胞性淋巴組織細胞增多癥(epstein-barr virus-associated hemophagocytic lymphohistiocytosis，EBV-HLH)等多見[17]。而EBV肺炎在影像學上類似其他病毒性肺炎，CT上常見的表現(xiàn)有肺葉實變、彌漫性和局灶性實質模糊影、不規(guī)則網格影、多發(fā)粟粒性結節(jié)或小結節(jié)及伴隨的磨玻璃影[18-19]。本研究擬繼續(xù)收集病例，增大樣本量，以進行多因素分析。

3.5 總結

在MP感染的大葉性肺炎中，如果治療時間長，發(fā)熱時間長，出現(xiàn)并發(fā)癥等表現(xiàn)，需警惕混合EBV感染，尤其在小年齡患兒中更需注意。MP及EBV感染，對兒童體液免疫及細胞免疫功能均有影響。對于存在難治性或治療效果不佳的大葉性肺炎患兒，應警惕存在支原體及EBV感染可能導致的疾病遷延。