支氣管哮喘患兒血清骨膜蛋白、IL-13和miR-155水平相關(guān)性的研究

路黎娟，徐梅佳，董 焱，呂 偉，林 珍

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院兒科，上海 201999)

支氣管哮喘屬于多種炎性細(xì)胞參與介導(dǎo)的慢性呼吸道炎性疾病。以氣道高反應(yīng)性、氣道慢性炎癥為主要特征，不同程度的氣促、喘息、咳嗽或胸悶為支氣管哮喘的主要臨床表現(xiàn)。支氣管哮喘的發(fā)病機(jī)制尚不明晰，但以往認(rèn)為其發(fā)生與多種免疫細(xì)胞及產(chǎn)生的細(xì)胞因子有關(guān)聯(lián)。據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示，受環(huán)境惡化及遺傳因素作用的影響，支氣管哮喘發(fā)病率呈逐年上升趨勢；同時(shí)其發(fā)病無特定年齡限制，且常于清晨及夜間發(fā)作[1-2]。近年來臨床研究發(fā)現(xiàn)，支氣管哮喘與免疫調(diào)節(jié)紊亂、炎癥反應(yīng)、感染等因素密切關(guān)聯(lián)[3-4]。本文對(duì)127例支氣管哮喘患兒的骨膜蛋白(Periostin)、白介素-13(interleukin-13，IL-13)和微小RNA-155(microRNA-155，miR-155)水平進(jìn)行檢測，并對(duì)其相關(guān)性進(jìn)行研究。

1 研究對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2019年1月至2020年1月在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院門診就診的支氣管哮喘患兒127例為研究對(duì)象(研究組)；選擇同時(shí)間段在本院接受健康體檢的兒童127例為健康志愿者(對(duì)照組)。

研究組：男66例，女61例；年齡為5～13歲；緩解期65例，急性期62例。對(duì)照組：男63例，女64例；年齡為3～15歲。兩組的性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)、膳食鈣攝入量比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。

納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患兒均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)對(duì)支氣管哮喘的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]。排除標(biāo)準(zhǔn)：①一般資料不全；②患有先天性心臟疾病或肝腎等重要臟器功能不全；③患有血液系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)疾?。虎芎喜⑵渌瓨蛹膊』蚵苑渭膊。虎莺喜⑦^敏性疾病。

本文研究內(nèi)容均已告知患兒家屬并知情同意，同時(shí)獲得本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

表1 兩組一般資料的比較Table 1 Comparison of baseline data between the two

1.2 肺功能的檢測

采用Master Screen肺功能儀對(duì)所有受檢兒童進(jìn)行肺功能檢查。對(duì)每位受檢者測量3次以上，保留3次最佳數(shù)值，取其平均值。主要測試參數(shù)：第1秒用力呼氣容積(forced expiratory volume in 1 second，F(xiàn)EV1)，第1秒用力呼氣量占用力肺活量比值(ratio of forced expiratory volume in 1 second to forced vital capacity，F(xiàn)EV1/FVC%)，最大呼氣50%流量(maximal expiratory flow at 50%，MEF50)。

1.3 方法

對(duì)所有受檢兒童于接診當(dāng)日采集外周空腹靜脈血5mL，要求血液標(biāo)本無脂血和溶血，置于無抗凝劑試管中，室溫下凝固，3 000r/min離心處理15min，分離上清，-70℃低溫下保存待檢。

1.3.1 酶聯(lián)免疫吸附檢測相關(guān)指標(biāo)表達(dá)水平

取50mL碳酸鹽緩沖液對(duì)抗原進(jìn)行稀釋，加蓋處理，4℃冰箱內(nèi)存放24h，第2天重復(fù)洗滌3次，拋干，將稀釋液(pH值為7.4的0.02mol/L Tris-HCl緩沖液)稀釋的待測標(biāo)本0.1mL放入酶標(biāo)本空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔內(nèi)，同時(shí)放入陽性和陰性對(duì)照標(biāo)本，42℃環(huán)境中存放1h，移除液體，3次洗滌后拋干，在每個(gè)孔中放Periostin、IL-13、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、γ-干擾素(interferon γ，IFN-γ)、缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)蛋白抗體0.1mL，存放1h，移除液體后進(jìn)行3次洗滌并拋干，在每個(gè)孔中放入底物液(0.1mol/L的Na2HPO4，0.05mol/L的枸櫞酸)，混勻后放入0.1mL鄰苯二胺，進(jìn)行20min遮光，再次將2mol/L的H2SO40.05mL放置在每個(gè)孔內(nèi)，終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀下測定Periostin、IL-13、TGF-β1、IFN-γ、HIF-1α、VEGF具體數(shù)值，參照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3.2 間接法檢測免疫功能T淋巴細(xì)胞亞群水平

將待測空腹靜脈血5mL/人傳代到5孔板中，置于37℃、5%二氧化碳的飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)1天、2天和3天，然后再加入0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化，以2 000r/min離心5min收取細(xì)胞，收取細(xì)胞后使用PBS緩沖液洗滌3min，再重復(fù)洗滌2次，完成后以2 000r/min離心，收集細(xì)胞后加入1mL PI染液，一定要在避光的常溫下放置1h后，使用PE熒光染色進(jìn)行特異熒光標(biāo)記，在鞘液包裹下高速流動(dòng)，流動(dòng)期間會(huì)發(fā)射出光子，用流式細(xì)胞儀檢測T細(xì)胞亞群CD3+、CD4+、CD8+水平。

1.3.3 RT-PCR法檢測miR-155表達(dá)水平

提取TTK細(xì)胞總RNA，對(duì)提取總RNA的純度、含量進(jìn)行檢測，隨后逆轉(zhuǎn)，逆轉(zhuǎn)錄處理后獲得cDNA，使用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，采用2-△△Ct方法計(jì)算，內(nèi)參U6。設(shè)置反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：25℃ 10min，40℃ 1h，85℃ 5min；設(shè)置擴(kuò)增條件：94℃ 20s，72℃ 30s，60℃ 30s，35個(gè)循環(huán)，采用2-△△Ct方法計(jì)算出需要檢測的miR-155表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組兒童肺功能指標(biāo)情況

與對(duì)照組相比，研究組的FEV1、FEV1/FVC%、MEF50水平均顯著下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 兩組兒童肺功能指標(biāo)的比較Table 2 Comparison of pulmonary function indicators between the two

2.2 兩組兒童血清Periostin、IL-13和miR-155水平情況

與對(duì)照組相比，研究組的哮喘緩解期、哮喘急性期患兒的Periostin、IL-13、miR-155水平均顯著上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 兩組兒童血清Periostin、IL-13和miR-155水平的比較Table 3 Comparison of serum Periostin,IL-13 and miR-155 levels among the

2.3 兩組兒童哮喘相關(guān)炎癥因子水平情況

在對(duì)照組、研究組的哮喘緩解期和哮喘急性期患兒中，TGF-β1、IFN-γ、HIF-1α、VEGF水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；相比對(duì)照組，哮喘緩解期、哮喘急性期患兒TGF-β1、HIF-1α、VEGF水平均上升，IFN-γ水平下降(哮喘緩解期與對(duì)照組比較，t值分別為13.830、29.730、28.180、10.790，P<0.05；哮喘急性期與對(duì)照組比較，t值分別為39.140、26.420、29.540、19.170，P<0.05)；相比哮喘緩解期，哮喘急性期患兒TGF-β1、HIF-1α、VEGF水平均上升，IFN-γ水平下降(t值分別為14.270、15.970、13.510、11.160，P<0.05)，見表4。

表4 兩組兒童哮喘相關(guān)炎癥因子水平的比較Table 4 Comparison of the levels of inflammatory factors related to asthma among the

2.4 兩組兒童免疫功能情況

在對(duì)照組、研究組的哮喘緩解期和哮喘急性期患兒中，CD3+、CD4+、CD8+水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；相比對(duì)照組，哮喘緩解期、哮喘急性期患兒CD3+、CD4+、CD8+水平均下降(哮喘緩解期與對(duì)照組比較，t值分別為12.400、21.480、9.374，P<0.05；哮喘急性期與對(duì)照組比較，t值分別為19.810、32.050、11.720，P<0.05)；與哮喘緩解期相比，哮喘急性期患兒CD3+、CD4+、CD8+水平均下降(t值分別為6.001、8.246、2.039，P<0.05)，見表5。

表5 兩組兒童免疫功能的比較Table 5 Comparison of immune functions among the

2.5 Periostin、IL-13和miR-155三者的相關(guān)性

采用Pearson進(jìn)行相關(guān)性分析，Periostin與IL-13呈正相關(guān)(r=0.403，P=0.001)；Periostin與miR-155呈正相關(guān)(r=0.655，P=0.001)；IL-13與miR-155呈正相關(guān)(r=0.482，P=0.001)，見圖1。

3 討論

支氣管哮喘屬于慢性氣道炎癥疾病，以不同程度的咳嗽、氣喘、胸悶為主要癥狀。臨床研究表明，兒童機(jī)體器官及組織發(fā)育尚未成熟，肺泡較少、身體免疫力低下、呼吸道系統(tǒng)功能不全是導(dǎo)致其呼吸道細(xì)菌侵襲感染的主要原因[6]。近年來，隨著我國對(duì)支氣管哮喘研究的增多，發(fā)現(xiàn)其是由多種細(xì)胞和細(xì)胞組分參與的異質(zhì)性疾病，多發(fā)于清晨或夜間；受環(huán)境、遺傳、氣候等多種因素影響，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢[7]。若不及時(shí)接受有效治療，會(huì)引發(fā)呼吸衰竭，甚至死亡，對(duì)患者生命健康造成極大威脅。因此，準(zhǔn)確有效地診斷對(duì)治療及預(yù)后評(píng)估具有重要意義。

3.1 Periostin、IL-13和miR-155生物學(xué)特征及其在支氣管哮喘發(fā)病中的作用

本研究顯示，急性期支氣管哮喘患兒Periostin、IL-13、miR-155水平均顯著高于健康兒童和緩解期患兒，提示Periostin、IL-13、miR-155均參與了哮喘的發(fā)生、發(fā)展過程。Periostin屬于細(xì)胞基質(zhì)蛋白，于細(xì)胞表面與數(shù)種整合素分子相互作用，為組織生長、重構(gòu)提供了條件[8]。相關(guān)研究顯示，在氣道上皮細(xì)胞中，Periostin蛋白通過促進(jìn)纖維母細(xì)胞趨化因子生成，加劇患者肺部炎癥；同時(shí)，Periostin具有自分泌效應(yīng)，通過調(diào)節(jié)相關(guān)細(xì)胞水平，在氣道纖維化過程中發(fā)揮作用，其是哮喘發(fā)病的作用機(jī)理[9]。IL-13主要由Th2細(xì)胞分泌，是重要的炎癥因子，具有多種效能。相關(guān)研究顯示，氣道的免疫調(diào)節(jié)和炎癥與IL-13有關(guān)聯(lián)，可單獨(dú)介導(dǎo)引起哮喘；同時(shí)，IL-13可對(duì)纖維細(xì)胞產(chǎn)生刺激，使其活化參與氣道重塑[10]。miRNA對(duì)臨床多種病理、生理的生物學(xué)改變具有調(diào)控作用，其表達(dá)水平能夠?qū)Χ喾N疾病的發(fā)病情況做出相對(duì)反映。miR-155在T細(xì)胞分化過程中具有關(guān)鍵意義。在機(jī)體正常情況下，miR-155水平較為平穩(wěn)，當(dāng)機(jī)體發(fā)生疾病時(shí)，其水平呈異常高表達(dá)，因此，通過miR-155水平的檢測能夠?qū)膊?yán)重程度做出直觀評(píng)估。本研究顯示，Periostin、IL-13、miR-155在支氣管哮喘中表達(dá)均較高，且其表達(dá)水平在急性期中均明顯高于緩解期。由此證實(shí)，Periostin、IL-13、miR-155與支氣管哮喘發(fā)生存在必要關(guān)聯(lián)，且其水平變化受病情程度影響，因此可通過對(duì)其水平的檢測有效評(píng)估病情，臨床應(yīng)用價(jià)值較高。

3.2 炎癥因子在支氣管哮喘發(fā)病中的作用

本研究顯示，支氣管哮喘患兒血清TGF-β1、HIF-1α、VEGF水平均高于健康兒童，IFN-γ、CD8+、CD3+、CD4+水平均低于健康兒童，說明支氣管哮喘的發(fā)生與機(jī)體炎癥反應(yīng)、免疫功能存在關(guān)聯(lián)。氣道重塑與氣道炎癥是支氣管哮喘中最常見的病理變化。研究顯示，TGF-β1作為強(qiáng)烈致纖維化作用因子，是氣道重塑的實(shí)質(zhì)，可有效刺激氣道平滑肌細(xì)胞[11]。IFN-γ對(duì)細(xì)胞免疫反應(yīng)具有介導(dǎo)作用，能夠減輕哮喘氣道炎癥。相關(guān)研究表明，肺組織缺氧導(dǎo)致HIF-1α降解減少和轉(zhuǎn)錄增加，造成氣道痙攣、氣管壁平滑肌細(xì)胞機(jī)械張力增加[12]。VEGF作為血管新生正調(diào)控因子，對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用，同時(shí)對(duì)血管通透性的增加具有促進(jìn)效果，在呼吸道炎癥和重塑中發(fā)揮重要作用。T淋巴細(xì)胞亞群作為臨床常用免疫檢測指標(biāo)，其水平變化顯示患者機(jī)體免疫情況。CD3+能夠反映機(jī)體免疫能力，其高表達(dá)表示機(jī)體免疫能力增強(qiáng)；CD4+對(duì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)具有刺激或介導(dǎo)作用；CD8+屬于細(xì)胞毒性T細(xì)胞[13]。本研究顯示，支氣管哮喘患兒機(jī)體炎癥反應(yīng)明顯高于健康者，免疫功能較低，同時(shí)通過對(duì)不同程度病情觀察發(fā)現(xiàn)，機(jī)體炎癥反應(yīng)狀態(tài)隨病情發(fā)展而升高，機(jī)體免疫能力隨病情發(fā)展而降低，提示炎癥因子在支氣管哮喘病情進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，并對(duì)機(jī)體免疫能力造成影響。

綜上所述，檢測Periostin、IL-13、miR-155水平對(duì)支氣管哮喘患兒的診斷及預(yù)后具有重要意義，且其水平在支氣管哮喘中具有一定的相關(guān)性，可為支氣管哮喘臨床診斷提供一定參考依據(jù)。