基于線粒體DNA D-loop 區(qū)序列分析中國(guó)及新西蘭奶山羊遺傳進(jìn)化關(guān)系

蘇少鋒，孟子琪，王 超，趙俊利，郝宸昉，趙啟南

（內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031）

相對(duì)于細(xì)胞核內(nèi)遺傳物質(zhì)，線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA） 是動(dòng)物體內(nèi)唯一存在的核外遺傳物質(zhì)。 mtDNA 分子量較小，含量相當(dāng)于核DNA 的1%～2%，長(zhǎng)度為15～20 kb，含量和長(zhǎng)度遠(yuǎn)小于核基因組［1-2］。 mtDNA 為母系遺傳，由環(huán)狀的重鏈（H）和輕鏈（L）構(gòu)成，2 條鏈均參與復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程［3］。 mtDNA 上的D 環(huán)控制區(qū) （D-loop區(qū)），是研究物種起源進(jìn)化和遺傳多樣性的有效分子標(biāo)記［4］。 D-loop 區(qū)由多個(gè)重要元件組成，雖為非編碼區(qū)，但其是進(jìn)化速度最快、最具多態(tài)性的區(qū)域［5］。 D-loop 區(qū)已廣泛應(yīng)用于群體遺傳多樣性及進(jìn)化發(fā)育關(guān)系、 核外基因效應(yīng)及親緣結(jié)構(gòu)分析等研究領(lǐng)域。利用mtDNA 研究動(dòng)物的遺傳進(jìn)化關(guān)系取得了顯著成果。 mtDNA 結(jié)構(gòu)特殊，能以恒定的速度突破物種的限制，在山羊上，特別是在奶山羊的遺傳多樣性研究中具有一定意義［6-9］。

在國(guó)外，Luikart 等［10］研究發(fā)現(xiàn)，全世界88 個(gè)山羊品種的mtDNA 高變區(qū)存在大量變異位點(diǎn)和單倍型，說明山羊群體遺傳多樣性非常豐富。Saeid等［11］研究表明，山羊mtDNA 存在7 個(gè)高度多樣化的 單 倍 型。 Kang 等［12］通 過 對(duì) 山 羊 完 整 的mtDNA D-loop 分析表明，山羊可以分成4 個(gè)明確的譜系，進(jìn)一步證明了山羊群體遺傳多樣性豐富。在國(guó)內(nèi)，張紅平等［13］利用mtDNA D-loop 區(qū)對(duì)中國(guó)16 個(gè)山羊品種的遺傳多樣性進(jìn)行研究， 結(jié)果表明， 共有41 種單倍型，說明中國(guó)家養(yǎng)山羊的遺傳多樣性較為豐富，部分地方品種具有獨(dú)特的單倍型。Liu 等［14］對(duì)9 個(gè)中國(guó)山羊品種的mtDNA D-loop 區(qū)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)中國(guó)山羊存在2 種母系來源。侯磊等［15］的研究也發(fā)現(xiàn)中國(guó)黑山羊群體具有豐富的遺傳多樣性。在奶山羊的遺傳多樣性研究方面，皮秀霜［16］對(duì)中國(guó)奶山羊mtDNA D-loop 區(qū)的研究表明，中國(guó)奶山羊品種遺傳多樣性相對(duì)貧乏， 培育品種中含有較多的薩能奶山羊血統(tǒng)， 中國(guó)奶山羊的遺傳多樣性不受地域限制；韓浩園等［17］對(duì)河南奶山羊遺傳資源現(xiàn)狀進(jìn)行研究， 表明河南奶山羊是以薩能奶山羊?yàn)楦副?，河南地方品種為母本雜交選育而成。

羊奶具有營(yíng)養(yǎng)和保健雙重功效， 是當(dāng)今乳營(yíng)養(yǎng)保健的最佳選擇之一。 羊奶的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值越來越受到人們的關(guān)注。 中國(guó)奶山羊的養(yǎng)殖量居世界前列，主要分布在新疆、內(nèi)蒙古、陜西、河北、河南、山東、四川等地。 目前，關(guān)于中國(guó)奶山羊遺傳多樣性及進(jìn)化關(guān)系的研究報(bào)道較少。 筆者以7 個(gè)奶山羊品種（嶗山奶山羊、文登奶山羊、關(guān)中奶山羊、雅安奶山羊、薩能奶山羊、阿爾卑斯奶山羊、吐根堡奶山羊）為研究對(duì)象，采用PCR 擴(kuò)增后直接測(cè)序的方法研究中國(guó)奶山羊品種和國(guó)外引進(jìn)品種的群體mtDNA D-loop 區(qū)全序列多態(tài)性，分析不同奶山羊品種的遺傳多樣性及進(jìn)化關(guān)系， 了解中國(guó)奶山羊和國(guó)外奶山羊的遺傳資源狀況， 為加快我國(guó)奶山羊育種工作， 以及奶山羊種質(zhì)資源的長(zhǎng)期有效保護(hù)和科學(xué)開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

采集7 個(gè)奶山羊品種的33 只個(gè)體的外周血樣本（見表1），包括文登奶山羊（n=5）、關(guān)中奶山羊（n=4）、嶗山奶山羊（n=7）和雅安奶山羊（n=4）4個(gè)中國(guó)培育奶山羊品種，以及阿爾卑斯奶山羊（n=5）、吐根堡奶山羊（TGB）、薩能奶山羊（SN）3 個(gè)新西蘭引進(jìn)奶山羊品種。選擇譜系信息清晰、無親緣關(guān)系的個(gè)體采樣，每個(gè)個(gè)體均代表一個(gè)母系群體，滿足樣本量最小需求。 靜脈采血， 放置在加有EDTA 抗凝劑的真空采血管中，-20 ℃冰箱保存。

表1 7 個(gè)品種奶山羊信息 單位：只

1.2 基因組提取及PCR 擴(kuò)增

采用血液基因組DNA 提取試劑盒提取血樣基因組DNA。 PCR 引物以山羊線粒體參考基因組（GenBank 登 錄 號(hào)：NC_005044.2） 中mtDNA Dloop 區(qū)全長(zhǎng)序列為參考設(shè)計(jì)，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（見表2）。

表2 奶山羊mtDNA D-loop 區(qū)PCR 引物信息

PCR 反應(yīng)體系為40 μL：DNA 模板2 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各2 μL，ExTaq mix 20 μL，ddH2O 14 μL；反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃5 min；95 ℃10 s，58 ℃10 s，72 ℃90 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測(cè)， 確認(rèn)正確后，直接送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

測(cè)序結(jié)果文件使用LaserGene 軟件的SeqMan模塊進(jìn)行拼接， 拼接序列使用ClustalW 軟件進(jìn)行全局比對(duì)， 確定種屬關(guān)系并分析各品種組內(nèi)以及組間遺傳距離；然后使用MEGA 7.0 軟件［18］，以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，1 000 個(gè)自舉檢驗(yàn)（Bootstrap） 重復(fù)評(píng)估系統(tǒng)發(fā)育樹的穩(wěn)定性并計(jì)算品種間的相關(guān)遺傳距離。 將比對(duì)后的FASTA 文件導(dǎo)入DnaSP V 5［19］軟件，對(duì)7 個(gè)奶山羊品種的mtDNA D-loop 區(qū)進(jìn)行遺傳多樣性分析以及品種間基因流和遺傳分化分析。 利用DnaSP V 5 軟件生成單倍型數(shù)據(jù)，導(dǎo)入NETWORK 10.2.0.0 軟件構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)圖并分析其頻率分布。

2 結(jié)果與分析

2.1 奶山羊mtDNA D-loop 區(qū)全序列的PCR 擴(kuò)增及檢測(cè)

奶山羊血液樣本提取基因組DNA 后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。 PCR 擴(kuò)增結(jié)果（見圖1）顯示，擴(kuò)增條帶清晰且明亮，無明顯雜帶，大小約1 200 bp，與預(yù)期大小一致， 可用于后續(xù)試驗(yàn)。 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過回收、純化處理，進(jìn)行Sanger 測(cè)序。

2.2 奶山羊mtDNA D-loop 區(qū)全序列分析

測(cè)序拼接和截切后， 經(jīng)ClustalX 軟件進(jìn)行序列同源性比對(duì)， 用MAGE 7.0 軟件對(duì)D-loop 區(qū)全序列進(jìn)行核苷酸組成分析，結(jié)果表明，4 種核苷酸T、C、A、G 的 平 均 比 例 分 別 為30.9%、14.4%、28.7%、26.1%，A+T 含量（59.60%）高于G+C 含量（40.50%），說明奶山羊mtDNA D-loop 區(qū)富含A、T 堿基，顯示出哺乳動(dòng)物線粒體DNA 堿基組成偏倚性的基本特征。 對(duì)奶山羊樣本的mtDNA D-loop區(qū)序列堿基變異位置進(jìn)行分析，結(jié)果表明，奶山羊的mtDNA D-loop 區(qū)全序列堿基變異位點(diǎn)分布不均勻，250～500 bp 區(qū)段比較保守，500～650 bp 區(qū)段變異最為豐富，650～1 000 bp 區(qū)段變異較弱，550～650 bp 區(qū)段變異率達(dá)到最高 （見圖2A）；mtDNA D-loop 區(qū)左功能區(qū)為保守區(qū)域，中間為高變區(qū)域。核苷酸多樣度分布檢測(cè)結(jié)果顯示，250～500 bp 區(qū)段堿基較保守，500～600 bp 區(qū)段核苷酸多樣度較高，608 bp 左右核苷酸多樣度的值最大，650～1 000 bp 區(qū)段核苷酸多樣度較弱（見圖2B），該結(jié)果與堿基變異分布變化趨勢(shì)一致。

2.3 奶山羊mtDNA D-loop 區(qū)序列的SNPs 分析

使用DNASP 5.10 軟件對(duì)33 只奶山羊mtDNA D-loop 區(qū)的序列進(jìn)行分析， 檢測(cè)到82 個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，占檢測(cè)核苷酸總量的7.41%，說明該序列突變率較大， 穩(wěn)定性較差。 有25 個(gè)單一多態(tài)位點(diǎn)（singleton variable sites）， 占 總 多 態(tài) 位 點(diǎn) 數(shù) 的30.48%， 分 別 位 于158、183、476、542、569、585、650、651、702、736、759、763、790、814、862、959、962、963、964、972、973、1 007、1 112、1 170、1 174 bp處。 有55 個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)（parsimony informative sites），占總多態(tài)位點(diǎn)數(shù)的64.63%，其中，有53 個(gè)2 種變異型， 分別位于13、14、103、126、133、141、160、178、258、320、391、540、578、580、581、583、586、596、604、612、613、614、617、631、640、641、642、643、646、647、648、649、654、658、673、676、703、710、712、727、730、750、780、788、812、816、869、878、899、1 004、1 012、1 100、1 173 bp 處； 有2 個(gè)3 種變異型，分別位于693、1 177 bp 處。

2.4 奶山羊mtDNA D-loop 區(qū)單倍型多樣性分析

使用DNASP 5.10 軟件對(duì)奶山羊mtDNA Dloop 區(qū)的序列進(jìn)行檢測(cè)，7 個(gè)奶山羊品種的總單倍型多樣度（haplotype diversity，Hd）為0.980，各品種單倍型多樣度范圍為0.905～1.000；總核苷酸多樣度（nucleotide diversity，Pi）為0.014 42，各品種核苷酸多樣度的范圍為0.001 51～0.013 32， 文登奶山羊的單倍型多樣度和核苷酸多樣度最高， 表現(xiàn)出較豐富的遺傳多樣性， 而嶗山奶山羊的遺傳多樣性較單一。 單倍型分析共發(fā)現(xiàn)26 個(gè)單倍型（Hap1～Hap26，見表3），其中，文登奶山羊和薩能奶山羊各有5 個(gè)單倍型， 分別為Hap19～23 和Hap5～9；阿爾卑斯奶山羊有4 個(gè)單倍型，為Hap1～4；嶗山奶山羊、吐根堡奶山羊、關(guān)中奶山羊、雅安奶 山 羊 各 有3 個(gè) 單 倍 型， 分 別 為Hap10 ～12、Hap16～18、Hap13～15、Hap24～26。單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹和單倍型網(wǎng)絡(luò)圖可以分出5 個(gè)單倍型組， 嶗山奶山羊和文登奶山羊聚在一起； 關(guān)中奶山羊和阿爾卑斯奶山羊聚在一起； 其他3 個(gè)品種分別單獨(dú)聚為一組（見圖3、圖4）。 6 個(gè)品種奶山羊的Tajima′s D 中性進(jìn)化檢驗(yàn)均不顯著（P>0.10），符合平衡發(fā)展趨勢(shì)， 說明群體未出現(xiàn)大規(guī)模擴(kuò)張或瓶頸現(xiàn)象，群體大小始終保持在相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)（見表3）。 利用MEGA 7.0 軟件中的Kimura2-parameter模型，以鄰接法NJ 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并對(duì)拓?fù)鋱D進(jìn)行了自展檢驗(yàn)（Bootstrap），重復(fù)抽樣次數(shù)為1 000 次。 結(jié)果表明，26 種單倍型被聚類成5 個(gè)分支，薩能奶山羊?qū)儆? 個(gè)分支上。

表3 奶山羊品種的遺傳多樣度及單倍型

2.5 遺傳分化及基因流分析

7 個(gè)奶山羊品種間相關(guān)分析結(jié)果 （見表4）表明， 核苷酸平均差異數(shù) （KXY） 范圍在6.400 00～38.450 00，核苷酸歧異度（DXY）范圍在0.005 79～0.034 76；阿爾卑斯奶山羊與薩能奶山羊的KXY和DXY最低， 文登奶山羊和雅安奶山羊的KXY和KXY最高；遺傳分化系數(shù)（GST）范圍為0.000 00～0.186 05，遺傳分化指數(shù)（FST）范圍為0.231 56～0.971 52，7 個(gè)奶山羊品種的FST均大于0.150 000，說明群體間存在較大的遺傳分化，其中，嶗山奶山羊與雅安奶山羊的FST最高，說明2 個(gè)群體存在很大的遺傳分化。

表4 遺傳分化及基因流分析相關(guān)參數(shù)

2.6 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建與遺傳距離分析

系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果與單倍型網(wǎng)絡(luò)關(guān)系分析一致。 7 個(gè)奶山羊品種間遺傳距離（見表5）表明，在引進(jìn)品種中， 薩能奶山羊與阿爾卑斯奶山羊和吐根堡奶山羊的遺傳距離相近，分別為0.012 2 和0.015 5；在培育品種中，嶗山奶山羊與文登奶山羊聚為一支，遺傳距離為0.008 0。 地方品種雅安奶山羊與其他品種遺傳距離最遠(yuǎn)。 關(guān)中奶山羊與國(guó)外奶山羊遺傳距離較近， 符合關(guān)中奶山羊來源于國(guó)外奶山羊的雜交歷史。系統(tǒng)發(fā)育樹NJ 聚類圖同樣證明了該結(jié)果（見圖5）。

表5 奶山羊群體間平均遺傳距離參數(shù)

3 討論

3.1 奶山羊的遺傳多樣性

研究表明， 山羊mtDNA D-loop 區(qū)位于tRNA pro 和t RNA phe 之間， 長(zhǎng)度在1 120 bp 左右［20］。在該研究中，7 個(gè)品種奶山羊的mtDNA D-loop 區(qū)長(zhǎng)度為1 213～1 215 bp，與前人研究一致，插入或缺失堿基導(dǎo)致品種間存在少數(shù)堿基的差異； 奶山羊的mtDNA D-loop 區(qū)全序列堿基變異位點(diǎn)分布不均勻， 核苷酸位置及突變率與前人研究結(jié)果相似，說明該研究中奶山羊mtDNA 的遺傳多樣性結(jié)果可信［13，21-22］；mtDNA D-loop 區(qū)中A、T 堿基含量高于G、C 堿基含量， 證明奶山羊mtDNA D-loop區(qū)序列存在堿基偏倚性， 符合哺乳動(dòng)物線粒體mtDNA 堿基組成偏倚性的特征。

單倍型多樣度和核苷酸多樣度可以衡量群體遺傳分化程度， 與群體遺傳性呈正相關(guān)。 該研究中，7 個(gè)品種奶山羊mtDNA D-loop 區(qū)的單倍型多樣度為0.980，核苷酸多樣度為0.014 42，說明奶山羊品種的總體核苷酸多樣性與核苷酸多樣性均較高，提示奶山羊的遺傳多樣性比較豐富；關(guān)中奶山羊、 嶗山奶山羊和雅安奶山羊的核苷酸多樣度較低， 關(guān)中奶山羊和嶗山奶山羊的研究結(jié)果與前人研究結(jié)果一致［9，23-24］，表明關(guān)中奶山羊、嶗山奶山羊和雅安奶山羊的遺傳多樣性較為貧乏， 該結(jié)果可能與分析的序列相關(guān)。 有學(xué)者以mtDNA 的HVI 片段為研究序列，而筆者以mtDNA D-loop 區(qū)全序列為研究對(duì)象進(jìn)行分析。此外，這三個(gè)品種可能均以薩能奶山羊?yàn)橛H本， 長(zhǎng)期與地方品種進(jìn)行雜交改良和選育而成，血統(tǒng)來源途徑相對(duì)單一。

遺傳分化指數(shù)反映遺傳分化程度，普遍認(rèn)為在0.25～1 為高度遺傳分化［25-26］。該研究中，7 個(gè)品種奶山羊的遺傳分化指數(shù)范圍為0.231 56～0.971 52，表明品種之間存在較高水平的遺傳分化， 文登奶山羊和吐根堡奶山羊的分化系數(shù)最低， 說明文登奶山羊可能在后期演變過程中存在吐根堡奶山羊的基因滲入。

3.2 奶山羊mtDNA D－loop 區(qū)系統(tǒng)發(fā)育分析

該研究的系統(tǒng)發(fā)育分析表明， 中國(guó)奶山羊mtDNA D-loop 區(qū)序列由明顯的2 個(gè)進(jìn)化系組成，說明中國(guó)奶山羊種群有2 個(gè)母系起源， 這與其他學(xué) 者 對(duì) 中 國(guó) 山 羊 的 研 究 結(jié) 果 一 致［14，16，27-28］；其 中，支系與國(guó)外品種遺傳距離很近， 說明中國(guó)奶山羊是國(guó)外引進(jìn)品種培育而成，含本地山羊血緣較少。文登奶山羊與嶗山奶山羊在系統(tǒng)發(fā)育樹中關(guān)系緊密， 這是因?yàn)? 個(gè)品種都產(chǎn)自中國(guó)山東省， 均由1898—1934 年從德國(guó)與俄羅斯引入的薩能奶山羊與當(dāng)?shù)厣窖蚱贩N雜交培育形成［29-30］；關(guān)中奶山羊是我國(guó)分布最廣、推廣范圍最大的奶山羊品種，該品種起源于20 世紀(jì)30 年代， 由西方傳教士帶入少量薩能奶山羊和吐根堡奶山羊， 并在中原地區(qū)與地方山羊雜交而成，因此，關(guān)中奶山羊與國(guó)外引進(jìn)品種的親緣關(guān)系較近［31］。 雅安奶山羊在系統(tǒng)發(fā)育樹中獨(dú)立成一支。 雅安奶山羊分布在我國(guó)四川盆地，雖然最早也是國(guó)外引進(jìn)品種培育的，但后期再?zèng)]有進(jìn)行大規(guī)模的引進(jìn)及導(dǎo)血， 選育工作也在20 世紀(jì)80 年代末中斷， 導(dǎo)致雅安奶山羊群體數(shù)量銳減， 再加上長(zhǎng)期的地理結(jié)構(gòu)影響和歷史原因，與其他地方品種少有雜交，存在較為單一的遺傳背景［32］。

3.3 奶山羊群體擴(kuò)張分析

群體擴(kuò)張及進(jìn)化歷史可影響mtDNA 的遺傳變異模式和遺傳多樣性，飼養(yǎng)環(huán)境的強(qiáng)烈改變，可顯著改變家養(yǎng)動(dòng)物群體的隨機(jī)漂變和等位基因頻率，因此，當(dāng)群體數(shù)量驟減或驟增時(shí)，檢測(cè)是否發(fā)生過群體擴(kuò)張具有必要性。 該研究中所有奶山羊品種的Tajima′s D 值為負(fù)數(shù)，P>0.10，無顯著差異，表明奶山羊未出現(xiàn)較大規(guī)模的群體擴(kuò)張。

該研究采集的樣本可能無法代表整個(gè)奶山羊品種群體的遺傳分化情況，但是在目前，關(guān)于奶山羊遺傳多樣性的研究報(bào)道較少， 該研究獲得的結(jié)果可為今后研究奶山羊群體遺傳結(jié)構(gòu)提供參考。在后期研究中，通過增加奶山羊種類及個(gè)體數(shù)量，剔除遺傳背景復(fù)雜的樣本， 可有效降低遺傳進(jìn)化分析誤差， 進(jìn)一步明晰中國(guó)奶山羊和國(guó)外奶山羊的遺傳多樣性及進(jìn)化關(guān)系， 為奶山羊新品種選育提供理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

利用mtDNA D-loop 區(qū)對(duì)7 個(gè)奶山羊品種的遺傳多樣性進(jìn)行研究， 發(fā)現(xiàn)中國(guó)奶山羊存在2 個(gè)支系起源且未發(fā)現(xiàn)群體擴(kuò)張； 中國(guó)培育奶山羊品種含有較多的國(guó)外奶山羊血統(tǒng)； 文登奶山羊與嶗山奶山羊親緣關(guān)系較近， 雅安奶山羊在遺傳進(jìn)化中可能存在地域隔離。