黃連生物堿改善心力衰竭的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)機(jī)制研究*

劉卓超，黃小靖，曾志聰

1 深圳市中醫(yī)院,廣州 深圳 518000；2 深圳市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院；3 廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬寶安中醫(yī)院

心力衰竭是多種原因?qū)е滦呐K結(jié)構(gòu)和/或功能的異常，使心室收縮和/或舒張功能發(fā)生障礙引起的一組復(fù)雜臨床綜合征，主要表現(xiàn)為呼吸困難、疲乏和液體潴留等［1］。根據(jù)流行病學(xué)研究［2］，我國(guó)人群的心衰患病率約為2%～3%，且隨著年齡的增長(zhǎng)，患病率有上升的趨勢(shì)［3］，60歲以上患病率達(dá)到23%以上，嚴(yán)重影響人類(lèi)健康。近年來(lái)研究［4-7］發(fā)現(xiàn)，黃連所含化學(xué)成分及其組方對(duì)心力衰竭具有治療作用，其中黃連生物堿是黃連起效的重要成分，其作用機(jī)制尚未明確，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討黃連生物堿治療心力衰竭的機(jī)制，為黃連生物堿藥理作用機(jī)制提供一定的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料來(lái)源本研究檢索數(shù)據(jù)庫(kù)包括：Uni-Prot（https：//www. uniprot. org/）、GeneCards（http：//www.gene-cards.org/）、String（http：//string-db.org/）、TTD（http：//bidd，nus，edu.sg/BIDD-Databases/TTD/TTD.asp）、TCMSP（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）、PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、Metascape（http：//metascape.org/，Version 3.5）；軟件包括：Cytoscape 3.7.1及Venny 2.1。

1.2 研究方法

1.2.1 黃連生物堿的靶點(diǎn)篩選 TCMSP 是一個(gè)中草藥系統(tǒng)藥理學(xué)平臺(tái)，收錄了中藥、靶點(diǎn)和疾病之間的關(guān)聯(lián)信息，該數(shù)據(jù)庫(kù)包括化學(xué)成分、作用靶點(diǎn)和中藥靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，以及相關(guān)的藥物靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)，以及關(guān)于口服生物利用度、藥物相似性、腸上皮通透性、血腦屏障、水溶性等天然化合物的藥代動(dòng)力學(xué)特性的信息。利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)篩選中藥黃連的化學(xué)成分，并篩選出黃連生物堿的化學(xué)成分及相關(guān)靶點(diǎn)信息，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）和類(lèi)藥性（drug-likeness，DL）為篩選條件，設(shè)置OB≥30%和DL≥0.18，篩選出符合條件的生物堿化合物。再檢索黃連生物堿的靶點(diǎn)，將獲取信息輸入U(xiǎn)niProt 數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索，篩選選擇“Reviewed”，選擇物種為“Human”，剔除非人源及未經(jīng)驗(yàn)證的靶點(diǎn)，最終檢索出黃連生物堿的基因靶點(diǎn)，通過(guò)Cytoscape 3.7.1 軟件構(gòu)建中藥-成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2.2 心衰相關(guān)靶點(diǎn)的獲取 以“heart failure”為關(guān)鍵詞，檢索TTD、GENECARDS 數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取心衰的相關(guān)疾病靶點(diǎn)。

1.2.3 黃連生物堿對(duì)心衰相關(guān)靶點(diǎn)的獲取 將“1.2.1”及“1.2.2”項(xiàng)下獲取的黃連生物堿作用靶點(diǎn)及心衰相關(guān)靶點(diǎn)的信息使用Venny 2.1 工具進(jìn)行交集對(duì)比，所得的重復(fù)靶點(diǎn)將視為黃連生物堿作用于心衰的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)，并繪制韋恩圖。

1.2.4 蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)分析 將“1.2.3”項(xiàng)下映射到的靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，限定物種為“Homo sapiens”，設(shè)置置信系數(shù)為0.4，構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的PPI 網(wǎng)絡(luò)，導(dǎo)出網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)nodel1、nodel2 和Combined score，利用Cytoscape3.7.1 軟件構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，利用“Network Analyzer”計(jì)算靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)，參數(shù)如下：平均最短路徑（average shortest path length，ASPL）、介數(shù)中心性（betweenness centrality，BC）、中 心 接 近 度（closeness centrality，CC）、聚類(lèi)系數(shù)（clustering coefficient，CC）、連通度（degree），設(shè)置節(jié)點(diǎn)大小與顏色反映連通度（degree）值大小，邊的粗細(xì)反映Combined score 大小，最終獲得蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)。

1.2.5 通路富集分析 運(yùn)用R3.6.1使用Bioconductor 提供的分析和理解高通量基因組數(shù)據(jù)的工具，完成GO 基因富集分析，并繪制條形圖，且進(jìn)行KEGG通路分析，并繪制通路圖。

2 結(jié)果

2.1 黃連生物堿的靶點(diǎn)篩選通過(guò)檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)，以O(shè)B≥30%和DL≥0.18 為檢索條件，從黃連中收集了6 個(gè)滿(mǎn)足條件的生物堿成分，分別為coptisine、berberrubine、berberine、epiberberine、Worenine、palmatine，見(jiàn)表1。檢索相關(guān)作用靶點(diǎn)，通過(guò)UniProt 的篩選及標(biāo)準(zhǔn)化，最終獲得79 個(gè)作用靶點(diǎn)，通過(guò)Cytoscape 3.7.1 構(gòu)建中藥-成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖1。

表1 黃連生物堿成分

圖1 中藥-成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.2 心衰相關(guān)靶點(diǎn)的獲取以“heart failure“為關(guān)鍵詞，經(jīng)TTD 數(shù)據(jù)庫(kù)、GENECARDS 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，共獲取1614個(gè)結(jié)果。

2.3 黃連生物堿對(duì)心衰相關(guān)靶點(diǎn)的獲取將“2.1”與“2.2”獲取靶點(diǎn)通過(guò)Venny2.1 進(jìn)行篩選，獲取其中與黃連生物堿靶點(diǎn)有20 個(gè)重合，其中包括ESR1、CSNK2A1、PTGS1、ATP5F1A、EGFR、IFNG 等，約占合計(jì)總數(shù)的1.1%，見(jiàn)圖2。

圖2 心衰相關(guān)靶點(diǎn)及黃連生物堿靶點(diǎn)的韋恩圖

2.4 蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)分析將20個(gè)重疊的靶點(diǎn)上傳String數(shù)據(jù)庫(kù)，獲取蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。將String 數(shù)據(jù)庫(kù)導(dǎo)出信息導(dǎo)入Cytoscape3.7.1 軟件中，重疊的靶點(diǎn)相互作用見(jiàn)圖3。重疊的靶點(diǎn)拓?fù)鋵W(xué)分析，見(jiàn)表2。經(jīng)Network Analyzer 分析網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)數(shù)為16，邊緣數(shù)為31，聚類(lèi)系數(shù)為0.610，見(jiàn)圖3。

表2 黃連生物堿對(duì)心衰作用靶點(diǎn)的拓?fù)鋵W(xué)分析

圖3 蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 通路富集分析

2.5.1 GO 注釋分析 利用Metascape 的數(shù)據(jù)庫(kù)，將20 個(gè)重疊的靶點(diǎn)進(jìn)行GO 富集分析，設(shè)置閾值P＜0.01，minimum count 3、enrichmentfactor＞1.5，得到靶點(diǎn)的通路信息，見(jiàn)圖4A—4B。GO 富集分析結(jié)果顯示：生物學(xué)過(guò)程（biological pro-cess，BP）分析其P≤0.01 共331 條，涉及血液循環(huán)、血壓調(diào)節(jié)、血管收縮、腺苷酸環(huán)化酶調(diào)節(jié)性G 蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路、兒茶酚胺分泌的負(fù)調(diào)控、G 蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路，兒茶酚胺轉(zhuǎn)運(yùn)等，見(jiàn)圖5。細(xì)胞組件（cellular component，CC）分析P≤0.01 共有26 條，涉及基底外側(cè)質(zhì)膜、膜筏、受體復(fù)合體、突觸膜的固有成分等，見(jiàn)圖6。分子功能（molecular function，MF）分析P≤0.01 共有21 條，兒茶酚胺結(jié)合、G 蛋白偶聯(lián)的胺受體活性、腎上腺素結(jié)合、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、鈣調(diào)蛋白結(jié)合等，見(jiàn)圖7。

圖4A 靶點(diǎn)的GO富集總分析

圖5 BP分析

圖6 CC分析

圖7 MF分析

2.5.2 KEGG 通路富集分析 通過(guò)Metascape 平臺(tái)將篩選的黃連生物堿的活性靶點(diǎn)進(jìn)行富集，得到靶點(diǎn)KEGG 通路信息，篩選出5 條直接與心力衰竭相關(guān)的信號(hào)通路，且對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化，信號(hào)通路包括神經(jīng)活性配體-受體相互作用（neuroacive ligand-receptor interaction）、鈣信號(hào)通路（calcium signaling pathway）、cGMP-PKG 信號(hào)通路（cGMP-PKG signaling pathway）、HIF-1 信號(hào)通路（HIF-1 signaling pathway）、cAMP 信號(hào)通路（cAMP signaling pathway）。見(jiàn)圖8。

圖8 KEGG富集分析圖

圖4B 靶點(diǎn)的GO富集總分析2

3 討論

本研究是通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)和文獻(xiàn)檢索化合物、作用靶點(diǎn)以及疾病的靶點(diǎn)信息，通過(guò)構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)通路可視化展示“藥物-靶點(diǎn)-疾病”的方法，同時(shí)對(duì)網(wǎng)絡(luò)中特性靶點(diǎn)在細(xì)胞、分子以及生物整體水平上的通路分析，從而預(yù)測(cè)藥物治療疾病的有效成分、相關(guān)靶點(diǎn)及作用機(jī)制等［8］。故通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，來(lái)探討黃連生物堿治療心力衰竭的有效成分、相關(guān)靶點(diǎn)及作用機(jī)制。

心力衰竭是心血管疾病的嚴(yán)重表現(xiàn)或晚期階段，致殘率及致死率居高不下，其常見(jiàn)病因分類(lèi)有心肌病變、免疫及炎癥介導(dǎo)的心肌損害、心臟負(fù)荷異常及心律失常等。目前認(rèn)為影響心衰的關(guān)鍵因素是神經(jīng)內(nèi)分泌疾病導(dǎo)致心肌重構(gòu)，進(jìn)而出現(xiàn)心衰。目前對(duì)心衰的預(yù)防包括［1］：對(duì)危險(xiǎn)因素的干預(yù)，包括長(zhǎng)期有效的控制血壓、血脂、血糖，篩查高危人群；干預(yù)無(wú)癥狀性左心室收縮功能障礙。西藥臨床治療心衰主要通過(guò)利尿、強(qiáng)心、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈等治療方式，達(dá)到拮抗心肌重構(gòu)的目的。

黃連作為常用的中藥，首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其味苦，性寒，歸心、脾、胃等經(jīng)，《日華子本草》記載：“治五勞七傷，益氣，止心腹痛。驚悸煩躁，潤(rùn)心肺，長(zhǎng)肉，止血……”現(xiàn)代研究表明，其含有生物堿、木脂素、香豆素、黃酮、萜類(lèi)等多種化合物，具有抗氧化、抗炎、降糖、抗菌等作用［9］。

本研究通過(guò)對(duì)黃連生物堿的相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行篩選，共有20 個(gè)靶點(diǎn)蛋白，通過(guò)對(duì)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)的蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)分析，可知靶蛋白具有一定協(xié)同性，在GO 通路富集分析可知，預(yù)測(cè)靶點(diǎn)蛋白的作用于循環(huán)及神經(jīng)體液因素相關(guān)。在KEGG 分析過(guò)程中，結(jié)果預(yù)測(cè)其主要與神經(jīng)體液、離子信號(hào)通路等相關(guān)調(diào)節(jié)。其神經(jīng)活性配體-受體作用通路包括了α2腎上腺素能受體、M2膽堿受體（muscarinic acetylcholine receptor m2，CHRM2）等。在心力衰竭的神經(jīng)體液機(jī)制中，隨著心臟射血量不足，交感神經(jīng)系統(tǒng)活性增高，體內(nèi)的去甲腎上腺素水平升高，作用于β1腎上腺素能受體，通過(guò)cAMP-PKA通路，使細(xì)胞內(nèi)cAMP升高，激活鈣離子通道，使細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，從而增加心肌收縮，提高心排血量。且增加心臟后負(fù)荷，心肌耗氧量上升，同時(shí)會(huì)提高心率。同時(shí)去甲腎上腺素的水平升高，可直接導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡、壞死，最終使心室重構(gòu)，導(dǎo)致心臟衰竭。神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路中，其預(yù)測(cè)機(jī)制可能是激動(dòng)血管壁的α2腎上腺素能受體，抑制去甲腎上腺素釋放，降低細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，從而拮抗交感神經(jīng)興奮性增強(qiáng)，減少心室做功，從而達(dá)到拮抗心室重構(gòu)的作用［10］。相關(guān)臨床研究發(fā)現(xiàn)，α2腎上腺素受體激動(dòng)藥物可樂(lè)定可用于治療急性或慢性心力衰竭［11］。M 膽堿受體具有膽堿能神經(jīng)傳遞作用，其中M2 型主要分布于心臟和突觸前末梢，其作用機(jī)制為通過(guò)與G 蛋白偶聯(lián)，激活受體激活磷脂酶C，促進(jìn)IP3 與DAG 生成，抑制腺苷酸環(huán)化酶活性，調(diào)節(jié)K+/Ca2+離子通道，從而調(diào)節(jié)心肌收縮。在心力衰竭的過(guò)程中，血漿中去甲腎上腺素水平升高，短期內(nèi)可進(jìn)行代償血流動(dòng)力學(xué)異常，長(zhǎng)期保持濃度增加可導(dǎo)致心肌缺血，從而發(fā)生心律失常。相關(guān)臨床研究發(fā)現(xiàn)，M2受體具有調(diào)節(jié)心率的作用［12-13］。根據(jù)蛋白互助網(wǎng)絡(luò)可知，CHRM2與ADRA2具有協(xié)同作用，可以預(yù)測(cè)，黃連生物堿可激動(dòng)M 受體，起到減慢心率，減緩心肌收縮力，減少心肌耗氧量，緩解心肌缺血，起到保護(hù)心肌細(xì)胞的作用。

鈣離子通道廣泛存在于機(jī)體細(xì)胞中，起到調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的作用，從而起到產(chǎn)生、傳遞興奮、介導(dǎo)興奮-收縮偶聯(lián)等作用。它有多種亞型，在心臟部位主要為L(zhǎng) 型，在KEGG 結(jié)果中，它又包括了NOS2 及CHRM2 等。NOS2 可通過(guò)PKG 磷酸化抑 制Ca2+內(nèi) 流，降 低β 腎 上 腺 素 受 體 表 達(dá)［14］。CHRM2可通過(guò)與G偶聯(lián)，調(diào)節(jié)Ca2+離子通道，從而調(diào)節(jié)心肌收縮。心力衰竭時(shí)交感神經(jīng)興奮性增強(qiáng)，心臟β 腎上腺素受體激活，使心肌細(xì)胞鈣離子通道開(kāi)放，代償心臟負(fù)荷變化，長(zhǎng)期導(dǎo)致心臟重構(gòu)，可預(yù)測(cè)其作用機(jī)制為通過(guò)調(diào)控鈣離子通道，拮抗心肌過(guò)度收縮，拮抗心室重構(gòu)。

心臟重構(gòu)是導(dǎo)致心力衰竭發(fā)展的基礎(chǔ)，心臟功能受損，心腔增大、心肌肥厚進(jìn)行代償；心肌氧耗及能量不足，更加劇了心肌整體收縮力下降，形成惡性循環(huán)。HIF-1 信號(hào)通路主要表達(dá)在缺氧的狀態(tài)下發(fā)揮作用，HIF-1 由α 和β 兩個(gè)亞基組成，缺氧時(shí)，脯氨酸羥化酶的羥化作用減弱，HIF-1a的降解減少，同時(shí)增強(qiáng)缺氧相關(guān)基因的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，心臟特異性pVHL 基因被敲除的小鼠，其心肌纖維化，心肌發(fā)生重構(gòu)，導(dǎo)致其心力衰竭［15］。HOLSCHER 等［16］研究發(fā)現(xiàn)，心力衰竭患者心肌的HIF 表達(dá)與正常心肌相比，增長(zhǎng)了1.5 倍。通過(guò)KEGG 及蛋白-蛋白互助網(wǎng)絡(luò)結(jié)果，可預(yù)測(cè)機(jī)制或?yàn)橥ㄟ^(guò)抑制HIF-1 表達(dá)，降低HIF-1 的濃度，起到保護(hù)心肌細(xì)胞的作用。

cGMP/cAMP 為細(xì)胞內(nèi)第二信使物質(zhì)，是第一信使作用后產(chǎn)生的信息分子。其具有調(diào)控心肌、血管等功能。當(dāng)β 腎上腺素受體激活后，cAMP 可激活PKA，通過(guò)作用于心肌肌鈣蛋白，降低Ca2+敏感性；同時(shí)可加速橫橋循環(huán)，使心肌舒張［17］。另一方面，心肌細(xì)胞鈣離子通道使其作用靶點(diǎn)，通過(guò)增加Ca2+通道開(kāi)放率，使動(dòng)作電位時(shí)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度上升，增強(qiáng)心肌收縮力［18］。LV等［19］研究發(fā)現(xiàn)，β1-ARcAMP-PKA 通路激活使心臟成纖維細(xì)胞的增殖，長(zhǎng)期β 腎上腺素受體激活與心臟纖維化密切相關(guān)，將誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致心臟衰竭的發(fā)生。cGMP 通路受多種物質(zhì)影響，包括一氧化氮、鈉尿肽等。心力衰竭時(shí)心肌細(xì)胞為適應(yīng)心臟負(fù)荷，結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致心肌細(xì)胞缺氧、ATP 合成減少，引起一系列病理反應(yīng)，導(dǎo)致cGMP-PKG 信號(hào)通路中斷，心肌重構(gòu)的發(fā)生。根據(jù)KEGG 通路分析可知，在cGMP/cAMP 通路的作用機(jī)制或?yàn)橥ㄟ^(guò)神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路，通過(guò)神經(jīng)體液機(jī)制，調(diào)控β 腎上腺素受體激活，影響cGMP/cAMP 的水平，調(diào)整鈣離子內(nèi)流及PKA、PKG 的濃度，從而抑制心肌細(xì)胞凋亡。

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)發(fā)掘黃連生物堿治療心力衰竭的靶點(diǎn)，探討了黃連生物堿治療心力衰竭的機(jī)制，為心力衰竭的治療發(fā)展開(kāi)辟了新的思路，對(duì)未來(lái)的相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究提供了新的方向。本次研究仍有不足之處，未能對(duì)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)挖掘的黃連生物堿治療心力衰竭的靶點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)認(rèn)證。