雙酚A對PC12細胞HDACs和HATs基因表達的影響

范安妮,汪惠麗

(合肥工業(yè)大學 食品與生物工程學院,安徽 合肥 230601)

雙酚A是一種內(nèi)分泌干擾化學物質(zhì),主要用于聚碳酸酯樹脂和環(huán)氧樹脂的生產(chǎn)。因為其制成的合成聚合物具有良好的機械性能,所以廣泛用于生產(chǎn)各種產(chǎn)品,包括食品容器、水管、眼鏡、熱敏紙、牙科密封、膠油漆、黏合劑等[1]。當這些日常物品在高溫或酸堿性情況下發(fā)生水解反應,雙酚A能夠從中游離出來滲透到食物中從而被人體攝入,特別是罐頭食品[2](包括罐裝蔬菜水果、魚肉類罐頭、奶粉)。此外在日常生活環(huán)境(如空氣、土壤、水和灰塵)中雙酚A存在廣泛分布[3]。有研究表明,在不同國家和地區(qū)的普通人群中,超過90%的尿液樣本中檢測到雙酚A及其代謝物[4]。越來越多的流行病學研究表明,雙酚A暴露與患某些疾病的風險有關(guān),如生殖類疾病、免疫疾病、代謝疾病、癌癥[5-6],特別是雙酚A容易通過血腦屏障,對神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生不利影響。

文獻[7]表明雙酚A能夠影響包括組蛋白乙?；趦?nèi)的表觀遺傳機制。表觀遺傳是指在基因的核苷酸序列不發(fā)生改變的條件下,基因表達發(fā)生了可遺傳的變化,并最終導致表型的改變。表觀遺傳學主要包括DNA修飾、組蛋白修飾、非編碼RNA修飾等幾種機制[8]。其中,組蛋白修飾是一種重要的表觀遺傳機制,研究比較多的組蛋白修飾主要包括甲基化、乙酰化和泛素化等。組蛋白的乙?；山M蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶(HDACs)和組蛋白去乙?；?HATs)來調(diào)節(jié),兩者共同作用,調(diào)節(jié)組蛋白的乙?；潭瘸尸F(xiàn)動態(tài)平衡。組蛋白乙?；瘯r,染色質(zhì)呈疏松狀態(tài),有利于轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合,促進基因的轉(zhuǎn)錄;組蛋白去乙酰化時,染色質(zhì)呈致密狀態(tài),不利于轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合,抑制基因的轉(zhuǎn)錄[9]。本研究選擇大鼠腎上腺嗜鉻瘤(PC12)細胞為實驗模型,檢測雙酚A暴露對HDACs和HATs的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗儀器

SCO6AD二氧化碳細胞培養(yǎng)箱(SHELLAB),SG403A-HE-INT無菌生物安全柜(Qualer),CT14RD高速冷凍離心機(天美),Nano Drop 2000超微量分光光度計(Thermo),Veriti-DX聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)熱循環(huán)儀(ABI),LightCycler 96 實時熒光定量PCR儀(Roche)等。

1.1.2 主要試劑

雙酚A(Sigma),總RNA小量制備試劑盒(Axygen);反轉(zhuǎn)錄試劑盒First-Stand cDNA Synthesis SuperMix、2×EasyTaq PCR SuperMix、實時熒光定量PCR試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司);DMEM細胞培養(yǎng)基;胎牛血清FBS(四季青)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞的培養(yǎng)

實驗中所使用的PC12細胞購于中國科學院細胞生物學研究所。從液氮中迅速取出凍存的細胞,在37 ℃水浴鍋輕輕晃動,融化后立刻轉(zhuǎn)移到離心管中,離心機室溫下3 000 r/min離心3 min后棄去培養(yǎng)基,然后加入新鮮的培養(yǎng)基(DMEM、10% FBS、1% PS)重懸細胞,使細胞均勻地鋪滿細胞培養(yǎng)皿。在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,培養(yǎng)條件為溫度37 ℃、濕度95%、5%CO2。當細胞密度為80%～100%時,進行細胞傳代培養(yǎng)。棄去皿內(nèi)培養(yǎng)基,加入PBS緩沖液輕輕沖洗并棄去,加入胰蛋白酶在二氧化碳細胞培養(yǎng)箱中消化1 min,再加入新鮮的培養(yǎng)基終止消化過程。用離心機3 000 r/min離心3 min收集細胞,棄去上清液,加入新鮮培養(yǎng)基重懸并均勻鋪滿細胞培養(yǎng)皿。如此傳代培養(yǎng)3次后,細胞可用于實驗操作。實驗過程中,細胞培養(yǎng)24 h后密度達到60%～80%,此時加入雙酚A處理24 h后提取RNA樣品。雙酚A使用二甲基亞砜溶解,添加到細胞培養(yǎng)皿中與培養(yǎng)基混合均勻,使得終濃度為1 μmol/L。

1.2.2 RNA的提取

使用Axygen的總RNA小量制備試劑盒提取RNA。因為RNA易降解,所以所有操作都需在低溫下進行。從培養(yǎng)箱中取出細胞培養(yǎng)皿,棄去培養(yǎng)基,用PBS緩沖液輕輕沖洗2次。加入R1緩沖液裂解細胞并輕柔地刮下細胞,收集到離心管中。再向每個離心管中加入R2緩沖液終止反應,漩渦震蕩3次,每次震蕩10 s,并用離心機在4 ℃、2 000g離心5 min。將試劑盒中提供的吸附柱放進離心管中,收集離心的上清液于吸附柱中,緩慢地加入異丙醇,輕輕顛倒混勻,然后用離心機4 ℃、6 000g離心2 min。棄去離心濾液,將吸附柱放回離心管中,向吸附柱中加入W1A緩沖液,離心機4 ℃、12 000g離心2 min。離心后棄濾液,向吸附柱中加入W2緩沖液,離心機4 ℃、12 000g離心2 min。重復此步驟2次。離心后棄濾液,離心機4 ℃、12 000g離心2 min,空轉(zhuǎn)徹底除去W2緩沖液。將吸附柱放入新的離心管中,向吸附柱中滴加TE洗脫液,室溫下靜置2 min,離心機室溫下12 000g離心2 min收集RNA。利用Nano Drop 2000超微量分光光度計檢測RNA濃度和質(zhì)量,提取的RNA用于反轉(zhuǎn)錄實驗。

1.2.3 反轉(zhuǎn)錄

使用First-Stand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒進行RNA反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。RNA易降解,因此所有操作都需在低溫下進行。具體實驗反應體系和反應程序如下。

反應體(20 μL):提取的總RNA 需50 ng～5 μg,2×ES Reaction 10 μL,Anchored Oligo (dt) 1 μL,Easy Script RT/RI Enzyme MIX 1 μL,加入ddH2O 至總體積為20 μL。如上添加試劑后,輕輕吹打混勻,用微型離心機離心使反應試劑都置于EP管底,再將EP管放置于PCR儀中,設(shè)置逆轉(zhuǎn)錄程序。

反應程序為:42 ℃孵育15 min,85 ℃ 加熱5 min變性失活。反應結(jié)束后獲得cDNA直接稀釋到合適濃度,進行實時熒光定量PCR。

1.2.4 實時熒光定量PCR

實驗使用實時熒光定量PCR試劑盒在LightCycler 96 實時熒光定量PCR儀上進行實時熒光定量PCR。先將引物稀釋成10 μmol/L,再將之前反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA作為模板,加樣過程在低溫下進行。

反應體系(20 μL):SYBR premix dimer Eras (2×)10 μL,上游引物0.4 μL,下游引物0.4 μL,模板cDNA 2 μL,ddH2O 6.4 μL。如上添加試劑后,輕輕吹打混勻,用微型離心機離心使反應試劑都置于EP管底。實驗過程中保持EP管和儀器內(nèi)部的干凈。

反應的程序為:先預變性(95 ℃、30 s、1 個循環(huán)),PCR反應(95 ℃、10 s; 60 ℃、30 s、40個循環(huán)),然后進行溶解曲線分析(95 ℃、10 s; 65 ℃、60 s; 97 ℃、1 s; 0.5 ℃、1 s),最后冷卻(37 ℃、30 s)。實驗所用引物序列見表1所列。結(jié)束后,分析實驗結(jié)果。本實驗主要是用于檢測HDACs和HATs的基因水平。

表1 引物序列

1.3 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 8 軟件處理,實驗結(jié)果表示為(平均值±標準差),組間差異顯著性分析采用t檢驗和One-way ANOVA檢驗,顯著性水平取P<0.05(*),顯著相關(guān);P<0.01(**),明顯顯著相關(guān);P<0.001(***)，極顯著相關(guān)。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙酚A暴露對HDACs的基因表達影響

HDACs廣泛存在于各生物體內(nèi),目前發(fā)現(xiàn)共有18種,HDACs根據(jù)酵母同源性分析被分成4類。Ⅰ類HDACs常在細胞核中檢測到,由HDAC1、HDAC2、HDAC3和HDAC8組成,與酵母Rpd3蛋白具有同源性;Ⅱ類HDACs和Hda1有高度同源性,細分為Ⅱa類HDACs (HDAC4、 HDAC5、HDAC7、HDAC9)和Ⅱb類HDACs (HDAC6、HDAC10),可在細胞質(zhì)和細胞核之間穿梭;Ⅳ類HDAC的唯一成員是HDAC11,與Rpd3 和Hda1 都有同源性。這3類HADCs酶活性都依賴于鋅離子結(jié)構(gòu)域。而Ⅲ類HDACs是一類依賴于煙酰胺腺嘌呤核苷酸的去乙?；?與酵母Sir2同源。實時熒光定量PCR檢測PC12細胞中HDACs不同亞型的mRNA表達水平。雙酚A暴露后細胞中HDACs的mRNA水平變化如圖1所示。

蛋白(a) Ⅰ類HDACs

由圖1可知，與對照組相比,雙酚A暴露后,Ⅰ類組蛋白去乙?；窰DAC1和HDAC8的mRNA水平上升較明顯(P<0.01),HDAC2和HDAC3 的mRNA水平顯著上升(P<0.001),即雙酚A暴露后,4種Ⅰ類組蛋白去乙?；妇黠@上升；Ⅱ類組蛋白去乙?；窰DAC4的mRNA水平?jīng)]有明顯的變化趨勢，HDAC5 的mRNA水平上升較明顯(P<0.01),HDAC9的mRNA水平也明顯上升(P<0.05),即雙酚A暴露后,2種Ⅱ類組蛋白去乙?；妇黠@上升；Ⅳ類組蛋白去乙?；窰DAC11也顯著升高。

2.2 雙酚A暴露對HATs的基因表達影響

基于序列和結(jié)構(gòu)的相似性, HATs分為Gcn5/PCAF、MYST、P300/CBP 和Rtt109至少4個不同家族。Gcn5/PCAF 家族由Gcn5/PCAF 和相關(guān)蛋白組成;MYST家族從酵母到人類細胞中都是保守的,是HATs家族中最大的成員,調(diào)控許多生命活動過程;P300/CBP家族成員均為轉(zhuǎn)錄輔助因子,能乙?；M蛋白和非組蛋白;Rtt109家族與組蛋白分子伴侶Asf1和Vps75 相關(guān),在DNA 復制和基因組穩(wěn)定性維持中起重要作用。雙酚A暴露后細胞中HATs的mRNA水平變化如圖2所示。

圖2 HATs的相對mRNA表達水平

由圖2可知,與對照組相比,雙酚A暴露較對照組的組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶HAT1的mRNA水平顯著上升(P<0.001),組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶P300的mRNA水平也明顯上升(P<0.05),組蛋白乙酰化轉(zhuǎn)移酶MYST的mRNA水平?jīng)]有明顯的變化趨勢。MYST作為一個激活基因的表觀遺傳標志,主要負責H4K16的乙酰化,可能此處乙?；淖兓簧婕敖M蛋白H4賴氨酸16位點的乙?；?。

3 討 論

組蛋白乙?；趯W習和記憶過程中、神經(jīng)病理學(精神分裂癥、抑郁癥和藥物成癮)中、維持正常認知等方面都起著重要的作用。研究表明,進行各種學習訓練后嚙齒動物顯示出組蛋白乙?；乃矔r增加[10]。而用組蛋白去乙?；傅囊种苿┲委熀?野生型小鼠和大鼠的學習能力和突觸可塑性也得到了促進,這表明組蛋白乙?；黾邮怯洃浶纬傻闹匾獧C制。

HDAC1功能的喪失與神經(jīng)變性有關(guān)。在CK-p25快速神經(jīng)變性小鼠模型中,p25使HDAC1失活先于阿爾茲海默癥,導致雙鏈DNA斷裂,細胞周期蛋白表達異常和神經(jīng)元死亡。在腦卒中模型中,HDAC1的獲得同樣對缺血誘導的神經(jīng)元死亡具有保護作用[11]。HDAC1活性在亨廷頓舞蹈病的秀麗隱桿線蟲模型中被發(fā)現(xiàn)具有神經(jīng)保護作用。HDAC2在認知功能中的作用與HDAC1形成鮮明對比。在前腦神經(jīng)元中過表達HDAC1的小鼠在認知表型上無差異,而過表達HDAC2導致記憶形成和突觸可塑性的顯著損傷[12]。HDAC2是HDAC抑制劑增強記憶的主要(不是唯一)靶點,有數(shù)據(jù)顯示HDAC2在成年海馬神經(jīng)元突觸可塑性中起抑制作用[13]。還有一些證據(jù)表明,HDAC2依賴的機制與認知能力下降有關(guān)。因此,靶點HDAC2可能適用于與認知功能受損相關(guān)疾病的治療。HDAC3介導了與亨廷頓病相關(guān)的神經(jīng)毒性,在秀麗隱桿線蟲亨廷頓病模型中,HDAC3的缺失可以消除疾病[14]。在哺乳動物中,HDAC3似乎對心臟能量代謝特別重要,但其在神經(jīng)疾病中的作用尚未被探索。有關(guān)HDAC8在成人大腦中作用的研究并不多,僅文獻[15]報道HDAC8的表達與神經(jīng)母細胞瘤的發(fā)生顯著相關(guān)，可以通過遺傳和藥理手段靶向HDAC8抑制神經(jīng)母細胞瘤細胞的增殖,因此HDAC8被認為是神經(jīng)母細胞瘤的合適藥物靶點。綜上所述,以Ⅰ類HDACs為靶點是治療某些神經(jīng)退行性疾病的有效途徑。

然而,Ⅱ類HDACs在成人大腦中的作用尚不完全清楚。小腦顆粒神經(jīng)元中HDAC4過表達可促進神經(jīng)元細胞死亡,抑制HDAC4可能具有神經(jīng)保護作用。HDAC4的核移位與細胞凋亡和神經(jīng)元存活有關(guān)[16]。因此,HDAC4在周圍和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用,但其價值有待進一步研究。HDAC5對認知功能方面沒有明顯的調(diào)控作用。然而,HDAC5是慢性應激和可卡因攝入適應性反應的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[17]，因此HDAC5在成人大腦中的作用是微妙而重要的,可能需要對基因組環(huán)境相互作用進行微調(diào)。HDAC9在心臟和肌肉骨骼功能中起著至關(guān)重要的作用,但對其在大腦中的作用知之甚少。此外,HDAC9的CNVs被發(fā)現(xiàn)與精神分裂癥有關(guān)[18],使得對該蛋白的進一步研究變得非常重要。HDAC11在成人大腦中的作用仍有待研究。

改變HATs活性的小鼠模型顯示記憶障礙,這與通過學習增加海馬體中組蛋白乙?；陌l(fā)現(xiàn)一致。CREB結(jié)合蛋白(CBP/P300)的突變是魯本斯坦·泰比綜合征的大多數(shù)病例,這種疾病的特征是智力低下。文獻[19]表明,CBP的缺失會損害海馬組蛋白乙?；?并導致各種記憶測試(如新型物體識別和空間記憶)受損。即使CBP的CREB結(jié)合位點發(fā)生突變,在轉(zhuǎn)基因小鼠中也觀察到嚴重的學習障礙和組蛋白乙酰化缺陷。

4 結(jié) 論

本文對PC12細胞進行雙酚A暴露,探究雙酚A暴露對HDACs和HATs的影響。實驗發(fā)現(xiàn),與對照組相比,雙酚A暴露后4種Ⅰ類組蛋白去乙?；?HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8)的基因水平均明顯上升;2種 Ⅱ類組蛋白去乙?；?HDAC5、HDAC9)的基因水平也明顯上升,1種 Ⅱ類組蛋白去乙?；?HDAC4)沒有明顯的變化趨勢;Ⅳ類組蛋白去乙酰化酶(HDAC11)的基因水平也顯著升高。與對照組相比,雙酚A暴露組的組蛋白乙酰化轉(zhuǎn)移酶(HAT1、P300)的基因水平明顯上升,但組蛋白乙酰化轉(zhuǎn)移酶(MYST)的基因水平無明顯變化?？傮w來說,HDACs的上升趨勢比HATs明顯,這可能導致整體的組蛋白乙酰化修飾水平偏低,例如H3K9、H3K27乙酰化的降低等。而整體的組蛋白乙?；揎椝狡?使得染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變得緊密,抑制了基因的轉(zhuǎn)錄。

綜上所述,雙酚A能夠通過影響HDACs和HATs來影響表觀基因組編程,而這種組蛋白乙?；碛^遺傳機制可能與一些神經(jīng)障礙相關(guān)的疾病有關(guān)。