線粒體ATP敏感性鉀離子通道開放劑對大鼠冠狀動脈硬化斑塊及血脂代謝的影響*

彭穎靜,劉麗敏,姚 健,張金盈

(沈陽醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院心血管內科 110016)

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病是由于冠狀動脈發(fā)生粥樣硬化引起血管狹窄或閉塞,導致心肌缺血、缺氧、壞死的一種心臟病[1]。隨著我國人口老齡化加劇及飲食結構的改變,冠狀動脈粥樣硬化性心臟病發(fā)病率逐年升高,已成為臨床最為常見的心血管疾病之一[2]。

臨床研究顯示,冠狀動脈粥樣硬化性心臟病患者多伴有嚴重的血脂異常,故目前臨床除采用血管擴張藥物控制病情外,調節(jié)血脂也成為治療重點[3]。線粒體ATP敏感性鉀離子通道(mitochondrial ATP sensitive potassium channels,mitoKATP)主要分布于心肌和血管平滑肌細胞線粒體內膜上,mitoKATP開放是細胞內產生ATP的重要步驟[4]。二氮嗪屬于mitoKATP開放劑,目前已被證實對缺血缺氧性心肌損傷及冠狀動脈粥樣硬化性心臟病有顯著改善作用[5],但二氮嗪對冠狀動脈粥樣硬化性心臟病血脂代謝的影響及機制報道較少。本研究旨在探討二氮嗪對冠狀動脈粥樣硬化性心臟病脂質代謝的影響及機制,為治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

50只健康雄性SPF級SD大鼠,6周齡,體質量(200±20)g,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[許可證號SCXK(京)2017-0011],動物實驗符合3R原則,所有操作遵循國家實驗動物管理條例及國家實驗動物管理實施細則。

1.2 儀器與試劑

過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator activated receptor γ,PPARγ)抑制劑GW9662(上海碧云天生物技術有限公司),維生素D3(VitD3,哈爾濱三馬獸藥業(yè)有限公司),高脂飼料、普通飼料(南通特洛菲飼料科技有限公司),腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor - α,TNF-α)、白細胞介素-1β(interleukin-1 β,IL-1β)、基質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9,MMP9)ELISA試劑盒(南京福麥斯生物技術有限公司),逆轉錄試劑盒(日本TaKaRa公司),BCA蛋白定量分析試劑盒(美國Thermo公司),兔抗大鼠PPARγ、核因子-κB p65(nuclear factor-κB,NF-κB p65)及NF-κB p-p65單抗(一抗,美國Abcam公司),辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG單抗(二抗,北京中杉金橋生物技術有限公司)。7500實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司),CheniDoc XRS化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司),JEM-1010透射電子顯微鏡(日本電子株式會社)。

1.3 方法

1.3.1實驗分組及干預

50只大鼠分為對照組、模型組、二氮嗪組、GW9662組、二氮嗪+GW9662組,各10只,除對照組外,其余各組采用高脂飼料喂養(yǎng)、腹腔注射VitD3法建立冠狀動脈粥樣硬化性心臟病大鼠模型,對照組采用普通飼料喂養(yǎng)、腹腔注射生理鹽水。二氮嗪組以3 mg/kg二氮嗪灌胃,GW9662組以1 mg/kg GW9662灌胃,二氮嗪+GW9662組同時以3 mg/kg二氮嗪和1 mg/kg GW9662灌胃,對照組和模型組以生理鹽水灌胃,每天1次,連續(xù)14 d。

1.3.2動物模型建立

參照文獻[6]建立冠狀動脈粥樣硬化性心臟病大鼠模型：高脂飼料喂養(yǎng)12周,在喂養(yǎng)開始時腹腔注射VitD32 mL/kg,分3次連續(xù)3 d注射完畢。對照組僅喂養(yǎng)普通飼料,在喂養(yǎng)開始時腹腔注射生理鹽水2 mL/kg,分3次連續(xù)3 d注射完畢。所有實驗完畢后處死大鼠,病理檢查顯示有斑塊形成證實建模成功,建模未成功的大鼠數據全部剔除。模型組、二氮嗪組、GW9662組、二氮嗪+GW9662組分別有10、9、8、9只大鼠建模成功。

1.3.3標本采集

給藥結束后2 h,用眼球摘除法取血樣5 mL,室溫靜置分層后,3 000 r/min離心15 min(離心半徑10 cm),取上清液備用；采血結束后處死各組大鼠,打開胸腔,剪取3 cm胸主動脈標本,一部分(4只大鼠)置于10%中性甲醛中常溫固定48 h用于染色用,一部分(4只大鼠)置于2.5%戊二醛中4 ℃固定2 h用于線粒體超微結構觀察,每組另4只標本置于-80 ℃保存用于mRNA和蛋白表達的檢測。

1.3.4血脂指標及血清炎癥因子水平檢測

取血清樣本,于全自動生化分析儀檢測總膽固醇(total cholesterol,TC)、三酰甘油(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)水平；參照ELISA試劑盒說明書,檢測炎癥因子IL-1β、TNF-α、MMP9水平。

1.3.5主動脈弓血管壁脂質沉淀檢測

取固定于中性甲醛中的4只大鼠主動脈組織標本,乙醇梯度脫水,石蠟包埋,制作厚度為4 μm連續(xù)切片。每個標本取4張切片,60%異丙醇浸洗,加入油紅O染色液,室溫染色10 min,置于顯微鏡下用60%異丙醇調色,蒸餾水沖洗3次,Mayer蘇木精染液復染30 s,自來水沖洗3 min,蒸餾水浸洗,晾干后用甘油明膠封片,于光學顯微鏡下觀察拍照。

1.3.6主動脈弓血管內皮細胞線粒體超微結構觀察

取4只大鼠以2.5%戊二醛固定的主動脈組織標本,PBS沖洗干凈后,用1%鋨酸室溫固定2 h,再次沖洗,用2%醋酸鈾染色2 h,然后進行丙酮逐級脫水,包埋劑包埋后于超薄切片機上切片,醋酸鈾和枸櫞酸鈉染色,于透射電子顯微鏡下觀察。

1.3.7PPARγ、NF-κB mRNA表達量檢測

取4只大鼠在-80 ℃保存的主動脈組織,用組織剪剪碎后,以Trizol法提取總RNA,逆轉錄試劑盒獲得互補鏈cDNA,調整cDNA濃度,以之為模板進行實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR),參照試劑盒設置20 μL反應體系20,反應參數為95 ℃預變性5 min；94 ℃變性20 s,58 ℃退火40 s,40個循環(huán),72 ℃再延伸60 s。以β-actin為內參對照,以2-ΔΔCT計算目的基因相對表達量。PPARγ引物序列F:5′-TGCTAGCCAATGTGCTAGC-3′,R:5′-CCAGTACGTAGCTGATGCA-3′;NF-κB引物序列F:5′-TACGACTGCGATGCTGCT-3′,R:5′-AATGCTGATGCTGATCAT-3′；β-actin引物序列F:5′-ACTGATGCTGAACGTGAC-3′,R:5′-CCTGATGCTGATGCTGAG-3′。

1.3.8PPARγ、NF-κB p65、NF-κB p-p65蛋白表達量檢測

取4只大鼠在-80 ℃保存的主動脈組織,液氮研磨后加入細胞裂解液,于冰上孵育20 min,離心收集上清液,檢測上清液中總蛋白含量,然后進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳,經電轉、封閉后,加入稀釋一抗(1∶500),4 ℃搖床孵育過夜,TBST緩沖液洗滌3次×10 min,加入稀釋二抗(1∶2 000),常溫孵育2 h,加入電化學發(fā)光液,暗室中曝光、顯影,凝膠成像系統(tǒng)掃描拍照,用Image J圖像分析軟件進行灰度值分析,蛋白相對表達量以PPARγ、NF-κB p65、NF-κB p-p65與內參β-actin灰度值比值表示。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 各組血脂指標檢測結果

與對照組比較,模型組、GW9662組、二氮嗪組、二氮嗪+GW9662組TC、TG、LDL-C水平均較高,其中GW9662組>模型組>二氮嗪+GW9662組>二氮嗪組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表1。

表1 各組血脂指標比較

2.2 各組血清炎癥因子水平檢測結果

與對照組比較,模型組、GW9662組、二氮嗪組、二氮嗪+GW9662組血清IL-1β、TNF-α、MMP9水平均較高,其中GW9662組>模型組>二氮嗪+GW9662組>二氮嗪組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表2。

表2 各組血清炎癥因子水平比較

2.3 主動脈弓血管壁脂質沉淀檢測結果

主動脈弓油紅O染色顯示,對照組無脂質沉淀,模型組大量成片脂滴沉淀,GW9662組較模型組脂滴沉淀更多,二氮嗪組較模型組脂滴沉淀減少,而二氮嗪+GW9662組較二氮嗪組脂滴沉淀增多,見圖1。

A：對照組;B：模型組;C：GW9662組;D：二氮嗪組;E：二氮嗪+GW9662組。

2.4 各組主動脈弓線粒體超微結構改變

主動脈弓透射電子顯微鏡觀察顯示,對照組主動脈弓內皮細胞線粒體雙層膜結構清晰、完整；模型組線粒體雙層膜結構不連續(xù),線粒體嵴斷裂或模糊,呈現腫脹和空泡化現象；GW9662組較模型組線粒體嵴斷裂明顯,部分僅留殘端,腫脹和空泡化嚴重；二氮嗪組較模型組雙層膜結構相對完整,線粒體嵴清晰,腫脹和空泡化減輕；而二氮嗪+GW9662組較二氮嗪組嵴稍模糊,腫脹和空泡化稍加重,見圖2。

A：對照組;B：模型組;C：GW9662組;D：二氮嗪組;E：二氮嗪+GW9662組;N:細胞核；箭頭：線粒體。

2.5 各組主動脈PPARγ、NF-κB mRNA相對表達量檢測結果

NF-κB p65 mRNA相對表達量組間比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與對照組比較,模型組、GW9662組、二氮嗪組、二氮嗪+GW9662組PPARγ mRNA相對表達量降低,其中GW9662組<模型組<二氮嗪+GW9662組<二氮嗪組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表3。

表3 各組主動脈PPARγ、NF-κB mRNA相對表達量比較

續(xù)表3 各組主動脈PPARγ、NF-κB mRNA相對表達量比較

2.6 各組主動脈PPARγ、NF-κB p65、NF-κB p-p65蛋白相對表達量檢測結果

NF-κB p65蛋白相對表達量組間比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與對照組比較,模型組、GW9662組、二氮嗪組、二氮嗪+GW9662組PPARγ蛋白相對表達量降低,其中GW9662組<模型組<二氮嗪+GW9662組<二氮嗪組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與對照組比較,模型組、GW9662組、二氮嗪組、二氮嗪+GW9662組NF-κB p-p65蛋白相對表達量升高,其中GW9662組>模型組>二氮嗪+GW9662組>二氮嗪組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖3。

1：對照組;2：二氮嗪組;3：二氮嗪+GW9662組;4：模型組;5：GW9662組；*:P<0.05,與對照組比較；#:P<0.05,與模型組比較；△:P<0.05,與GW9662組比較；▲:P<0.05,與二氮嗪組比較。

3 討 論

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病是臨床最常見的心血管疾病之一,嚴重危害人類的生命健康。冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的病理基礎為動脈粥樣硬化,其發(fā)病危險因素較多,如高齡、吸煙、血脂代謝異常、炎癥、遺傳等[7-8]。研究表明,血脂代謝異常是誘發(fā)冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的危險因素,血脂代謝長期異常可破壞冠狀動脈血管完整性,引起血小板和血脂長期聚集于血管破損處,形成動脈粥樣硬化斑塊,最終導致血管狹窄甚至閉塞,心血管事件發(fā)生風險增加[9-10]。mitoKATP存在于心肌和血管平滑肌細胞線粒體內膜,是線粒體損傷、細胞死亡的關鍵,開放mitoKATP可激活內源性心肌保護機制[11],但其對血脂代謝的影響的研究較少。

臨床研究顯示,高甘油三酯血癥是冠狀動脈粥樣硬化性心臟病發(fā)病的獨立危險因素,TC、TG、LDL-C長期處于高水平可促進粥樣硬化斑塊形成,加之炎癥因子作用可加速易損性斑塊形成,從而導致心血管事件發(fā)生風險增加[12-13]。炎性反應參與冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的發(fā)生、發(fā)展的各個環(huán)節(jié),IL-1β、TNF-α可加速血栓及動脈斑塊形成等病理改變,膽固醇結晶可激活炎癥小體，促進IL-1β的合成和分泌；TNF-α促進黏附分子釋放誘發(fā)斑塊形成；MMP9選擇性地結合細胞外基質，加速易損性斑塊形成[14-15]。本研究發(fā)現,模型組血脂指標TC、TG、LDL-C水平及血清炎癥因子IL-1β、TNF-α、MMP9水平較對照組升高,主動脈弓大量成片脂滴沉淀、主動脈內皮細胞線粒體損傷嚴重,應用二氮嗪干預后,血脂指標及血清炎癥因子水平較模型組均降低,脂滴沉淀減少,內皮細胞線粒體損傷減輕,提示二氮嗪可有效減輕大鼠冠狀動脈硬化斑塊病變程度,改善血脂代謝,抑制炎性反應。

PPARγ主要參與脂肪細胞分化、葡萄糖代謝及炎性反應等,PPARγ信號通路在脂質代謝中發(fā)揮重要調控作用,已成為肥胖及糖尿病等糖脂代謝紊亂疾病治療的重要靶分子之一[16]。PPARγ、NF-κB p65均屬于核受體,適量脂質可激活PPARγ穩(wěn)定脂質代謝,過多的脂質則抑制PPARγ，從而使NF-κB p65磷酸化激活,促進炎性反應[17]。本研究發(fā)現,模型組PPARγ mRNA和蛋白表達量較對照組降低,NF-κB p65 mRNA和磷酸化蛋白表達量升高；應用二氮嗪干預后,主動脈PPARγ mRNA和蛋白表達量升高,NF-κB p65 mRNA和磷酸化蛋白表達量降低,提示二氮嗪可上調冠狀動脈粥樣硬化性心臟病大鼠主動脈中PPARγ表達,抑制NF-κB p65磷酸化水平,從而抑制血管內皮損傷和動脈粥樣硬化斑塊形成。本研究在二氮嗪基礎上進一步應用PPARγ抑制劑GW9662干預后,PPARγ mRNA和蛋白表達量較二氮嗪組降低,NF-κB p65 mRNA和磷酸化蛋白表達量升高,且血脂指標、線粒體損傷程度及血清炎癥因子水平均有所改善,從而證實二氮嗪是通過上調PPARγ、抑制NF-κB p65磷酸化調控冠狀動脈粥樣硬化性心臟病大鼠血脂代謝。除PPARγ外,PPAR還包括PPARα和PPARβ/δ亞型,二氮嗪除通過PPARγ抑制動脈粥樣硬化斑塊及改善血脂代謝外,能否通過其他亞型發(fā)揮代償作用,仍需進一步研究。

綜上所述,線粒體ATP敏感性鉀離子通道開放劑二氮嗪可有效減輕大鼠冠狀動脈硬化斑塊病變程度,改善血脂代謝,其機制為通過調控PPARγ通路發(fā)揮作用,為臨床冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的防治提供理論參考,但具體機制仍需進一步探討。