金蘭柚資源的遺傳多樣性及其親緣關(guān)系分析

湯雨晴，閆承璞，楊惠棟，王雨亭，尹 峰，戴明輝，李樂寶，胡鐘東，朱方紅*

（1.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 園藝研究所，江西 南昌 330200；2.安?？h農(nóng)業(yè)農(nóng)村產(chǎn)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，江西 吉安 343000）

柚［Citrus maxima （Burm） Merr.］為蕓香科柑橘屬喬木，在我國(guó)南方地區(qū)廣泛種植，其產(chǎn)業(yè)在地方經(jīng)濟(jì)發(fā)展中占據(jù)重要地位。金蘭柚、金沙柚和桃溪蜜柚合稱為井岡蜜柚［1］。金蘭柚果肉脆嫩、味甜少酸、豐產(chǎn)性好，并且極耐儲(chǔ)存［2］，被譽(yù)為“井岡蜜柚”之王，在江西省安福縣廣泛種植。金蘭柚果實(shí)為卵圓形，果基部有短頸［3］，但在安?？h栽培的金蘭柚卻存在近圓形、長(zhǎng)橢圓形、葫蘆形和扁圓形等果形，形態(tài)學(xué)差異很大。果農(nóng)對(duì)其栽種的各種果形金蘭柚來源并不清楚，是否存在同名異物或近似品種的情況也不得而知。

分子標(biāo)記是在DNA分子水平上進(jìn)行檢測(cè)，不受生育階段、外界環(huán)境等因子的影響，能客觀、真實(shí)地反映品種間的差異。目前，分子標(biāo)記技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于柚類種質(zhì)資源分析與親緣關(guān)系鑒別。劉勇等［4］以33對(duì)SSR引物對(duì)110份柚資源和12份柚類近緣種進(jìn)行遺傳多樣性分析，將金蘭柚歸類在沙田柚品系，且與金沙柚親緣關(guān)系較近。陳巍等［5］利用SRAP標(biāo)記對(duì)13份浙南柚類地方資源和琯溪蜜柚及芽變進(jìn)行遺傳多樣性分析和鑒定。李先信等［6］采用形態(tài)學(xué)標(biāo)記與SRAP分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)分布于湖南特定生態(tài)條件下的47份地方柚類種質(zhì)資源的遺傳多樣性及親緣關(guān)系進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)形態(tài)學(xué)標(biāo)記與SRAP分子標(biāo)記都能很好地將柚類品種進(jìn)行分類，但SRAP標(biāo)記所揭示的柚類種質(zhì)間的遺傳差異更準(zhǔn)確。劉召亮等［7］針對(duì)江西省內(nèi)不同來源的金沙柚種質(zhì)及其近緣種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析。目前，針對(duì)金蘭柚果實(shí)形態(tài)差異對(duì)其進(jìn)行分子層面解析的研究還沒有。本試驗(yàn)收集安?？h不同果形金蘭柚，進(jìn)行葉片形態(tài)觀察和果實(shí)品質(zhì)的測(cè)定，并開展分子標(biāo)記鑒定，探究了不同果實(shí)形態(tài)下金蘭柚生理品質(zhì)和分子水平差異性，以期為安福縣金蘭柚品種鑒定提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及處理

14份金蘭柚材料采集自安福縣，桃溪蜜柚和金沙柚采集自江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所橫崗基地（表1）。本試驗(yàn)所有樣品采集后立即帶回實(shí)驗(yàn)室，用雙蒸水洗凈后放入-80 ℃超低溫冰箱中保存。

表1 所采集柚材料的來源信息

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 葉片形態(tài)的觀察 選擇成熟的葉片采集回實(shí)驗(yàn)室，觀察葉片的葉形、葉尖、葉基和翼葉形狀。

1.2.2 果實(shí)品質(zhì)的測(cè)定 用電子天平稱量果實(shí)重量，游標(biāo)卡尺測(cè)定果皮厚度和果實(shí)橫縱經(jīng)，果形指數(shù)=果實(shí)縱徑（mm）/果實(shí)橫徑（mm），用手持?jǐn)?shù)字折射儀測(cè)定可溶性固形物含量。所有數(shù)據(jù)均錄入到Excel 2003軟件，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，借助SPSS 19.0軟件利用鄧肯氏新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

1.2.3 基因組DNA的提取 采用改良CTAB法提取樣品DNA［8］，用NanoDrop 2000分光光度計(jì)測(cè)量其DNA濃度并統(tǒng)一稀釋至50 ng/μg備用，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性。

1.2.4 InDel引物合成 根據(jù)金蘭柚重測(cè)序數(shù)據(jù)，比對(duì)到晚白柚（website：http：//citrus.hzau.edu.cn/orange/download/index.php）參考基因組，篩選出27對(duì)擴(kuò)增條帶清晰，位點(diǎn)雜合的InDel（Insertion-deletion）引物，引物序列見表2。

1.2.5 PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳 PCR反應(yīng)體系為15 μL：7 mL的Mix液，0.3 μL 10 mmol/L的正向引物，0.3 μL 10 mmol/L的反向引物，1.5 μL 100 ng/μL模板DNA和6 μL ddH2O。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，Tm 55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，反應(yīng)進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃再延伸5 min。瓊脂糖凝膠電泳采用1.5%~2.0%質(zhì)量百分比的瓊脂糖凝膠，電壓120 V，電泳15~20 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 表型性狀分析

2.1.1 葉片特征 安?？h14份柚材料葉片特征如圖1所示。14份柚材料葉片均有淺波狀起伏，葉形從橢圓形至卵圓形到披針形，葉尖漸尖或鈍形，葉基圓形或楔形，翼葉心形或狹長(zhǎng)，總體而言，形態(tài)差異較大。雖然這14份樣品葉形有差異，但均為單出復(fù)葉。

圖1 安福縣14份柚材料的葉片特征

2.1.2 果實(shí)品質(zhì)特征 14份柚材料果實(shí)形狀見圖2。大部分樣品果形為卵圓形（S6、S7、S9、S11），但也有部分樣品果形為葫蘆形（S2、S5）、近圓形（S3、S10、S14）等，果形差異很大。表2為14份柚樣品果實(shí)品質(zhì)分析結(jié)果。從表2可以看出，這14份柚樣品在單果重、果實(shí)橫徑、果實(shí)縱徑、果皮厚度、可溶性固形物含量上均存在顯著差異。單果重為333.75~1020 g不等；果形指數(shù)最小的接近1，近似于圓形，最大的可達(dá)到1.22；果皮厚度最薄只有10 mm，但最厚的可達(dá)到15.99 mm?？扇苄怨绦挝锖吭?1.45~15.00之間，不同果園采摘的柚果實(shí)可溶性固形物含量差異較大，同一果園采摘的柚果實(shí)可溶性固形物含量差異也很大。

圖2 安?？h14份柚材料的果實(shí)特征

表2 27對(duì)InDel標(biāo)記引物序列

2.2 16份柚材料遺傳多樣性分析

27對(duì)引物擴(kuò)增結(jié)果見圖3。結(jié)果顯示，試驗(yàn)所用27對(duì)引物共擴(kuò)增出54個(gè)清晰可辨的位點(diǎn)，平均條帶數(shù)為2，InDel標(biāo)記片段的分子量主要集中在250~500 bp。這27個(gè)標(biāo)記中，22個(gè)標(biāo)記表現(xiàn)出位點(diǎn)多態(tài)性，多態(tài)率達(dá)到81.48%。這22對(duì)標(biāo)記能明顯區(qū)分金蘭柚、桃溪蜜柚和金沙柚，但安?？h采集的14份柚材料在所有標(biāo)記擴(kuò)增條帶中均無差異。

圖3 InDel引物在16份柚材料中的PCR擴(kuò)增結(jié)果

3 討論

分子標(biāo)記技術(shù)是以個(gè)體間核苷酸序列差異為基礎(chǔ)的標(biāo)記，在植物遺傳多樣性的研究當(dāng)中，目前已有SRAP［5-6］、SSR［4，7］、RAPD［9］、ISSR［10］等分子標(biāo)記技術(shù)得到了成功的應(yīng)用。InDel標(biāo)記在柑橘種屬分類中已有應(yīng)用［11］，但在柚類種質(zhì)資源遺傳分析中尚未應(yīng)用。劉勇等［12］發(fā)現(xiàn)江西的柚類資源主要由沙田柚品種群、果實(shí)梨形或卵形的金蘭柚及其后代等品種群、雜種柚品種群組成，遺傳多樣性非常豐富。

本研究采用InDel標(biāo)記分析安?？h14份金蘭柚樣品，并以桃溪蜜柚、金沙柚為對(duì)照，結(jié)果顯示：14份金蘭柚材料幾乎無遺傳學(xué)上的差異，但與金沙柚、桃溪蜜柚存在顯著差異。從分子水平上看，這14份樣品應(yīng)均為金蘭柚。樣品S9為安?？h第一批金蘭柚樹，當(dāng)?shù)厝朔Q之為金蘭柚母樹，已栽培近40年，安?？h大規(guī)模發(fā)展金蘭柚時(shí)曾經(jīng)作為優(yōu)良母株提供接穗。S9果形為卵圓形，果基部有短頸，符合文獻(xiàn)上對(duì)金蘭柚的描述［3］，S10與S9采摘自同一果園，果形為近圓形，但分子標(biāo)記未顯示出差異性，推測(cè)S10應(yīng)為S9的芽變，但只是發(fā)生了點(diǎn)突變，使用分子標(biāo)記很難將其區(qū)分，應(yīng)開發(fā)更加精確的分子標(biāo)記或者對(duì)其基因組測(cè)序以準(zhǔn)確判斷堿基突變位點(diǎn)。

本研究選擇安?？h6個(gè)具有代表性果園進(jìn)行樣品采集，共收集金蘭柚樣品14份。果實(shí)品質(zhì)分析結(jié)果顯示，不同果園金蘭柚果實(shí)大小和單果重差異較大，但同一果園差異較小，這一性狀受果園栽培管理措施的影響較大，可能與栽培者管理水平有關(guān)［13］?？扇苄怨绦挝锖吭诓煌麍@間存在差異，在同一果園內(nèi)，如安?？h橫龍鎮(zhèn)樂谷村鼎盛生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司采摘的2個(gè)樣品S5、S6可溶性固形物含量差異較大，這可能與采摘樣品環(huán)境（山上、山下）或者管理水平不一致有關(guān)［14］。果形性狀為受多基因控制的數(shù)量性狀［15］，屬于較穩(wěn)定的遺傳性狀，一般受環(huán)境等影響較小，本試驗(yàn)證明金蘭柚在分子水平上無明顯差異，但形態(tài)學(xué)相關(guān)分析可將14份金蘭柚材料粗分為梨形和偏圓形2種果形，可能由于表觀因素影響，需要進(jìn)一步研究。本研究采用形態(tài)學(xué)標(biāo)記和分子標(biāo)記對(duì)14份金蘭柚進(jìn)行遺傳多樣性分析，探究了不同果實(shí)形態(tài)下金蘭柚品質(zhì)和分子差異，得出卵圓形和近圓形果形均為金蘭柚，本研究為安?？h金蘭柚品種鑒定提供了一定參考。

表3 安?？h14份柚材料果實(shí)的品質(zhì)分析