桃紅四物湯對骨性關(guān)節(jié)炎模型大鼠軟骨細胞自噬的影響

馬一鳴 吳瑞吉 胡 炯 鄭 杰 王昌興

骨性關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種臨床常見且復(fù)雜的退行性骨關(guān)節(jié)疾病。其發(fā)病機制復(fù)雜，通常認為OA 的發(fā)病與老齡、機械損傷、代謝、肥胖等多種因素有關(guān)[1-2]?；ぱ?、軟骨破裂、骨贅產(chǎn)生和軟骨下骨硬化等是OA 最常見的病理改變，上述病理改變進行性發(fā)展，最終影響整個關(guān)節(jié)和關(guān)節(jié)周圍組織的結(jié)構(gòu)、功能和代謝[3]，因此對OA 的防治尤為重要。桃紅四物湯最早出現(xiàn)于《醫(yī)宗金鑒》，是活血養(yǎng)血的經(jīng)典名方，臨床用以O(shè)A 手術(shù)后的輔助治療及OA 的保守治療，卓有成效[4-5]。然而關(guān)于桃紅四物湯治療OA 的機制研究鮮有報道。自噬是一種通過清除損傷細胞器來維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的生理過程，已有研究報道通過激活軟骨細胞自噬可以顯著改善OA 癥狀[6-7]。本研究通過碘乙酸誘導(dǎo)建立OA 模型大鼠，并使用桃紅四物湯灌胃干預(yù)，探究桃紅四物湯治療OA 的潛在機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 24 只雄性SPF 級SD 大鼠，體質(zhì)量（200±15）g，由上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供【SCXK（滬）2017-0005】，并由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心[SYXK（浙）2021-0012]飼養(yǎng)。飼養(yǎng)室溫度控制在（23±2）℃并保持60%濕度，12h 循環(huán)燈光，各組大鼠均飼喂標(biāo)準(zhǔn)鼠糧。所有實驗操作遵循《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》，并符合實驗動物倫理學(xué)要求（倫理審批號：IACUC-20190909-26）。

1.2 藥 物 桃紅四物湯方中所有藥材均購買自浙江中醫(yī)院大學(xué)名中醫(yī)館，具體組成為：紅花、桃仁各15g，赤芍、熟地黃、川芎、當(dāng)歸各10g。所有藥材在10倍體積純水中浸泡60min 后，煮沸2 次，每次持續(xù)約1h，將兩次煮沸的水提液合并后濃縮至濃度為1g（生藥）/mL，并于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試 劑 生理鹽水（杭州正伯生物科技有限公司，規(guī)格：500mL，批號7732-18-5），碘乙酸（杭州邦易化工有限公司，規(guī)格：25g，批號64-69-7），水合氯醛（石家莊西默科技有限公司，規(guī)格：1kg，批號302-17-0），4%多聚甲醛（杭州諾森德生物技術(shù)有限公司，規(guī)格：500mL，批號BL539A），EDTA 脫鈣液（石家莊西默科技有限公司，規(guī)格：100mL，批號E1135-100），Bax 抗體（杭州華安生物技術(shù)有限公司，規(guī)格：50μL，批號ER0907），Beclin 1 抗體（杭州華安生物技術(shù)有限公司，規(guī)格：50μL，批號R1509-1），LC3 抗體（杭州華安生物技術(shù)有限公司，規(guī)格：50μL，批號RT1359）。

1.4 主要儀器 電子機械痛儀（安徽省淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司，型號：YLS－3E）、大鼠抓力儀（北京冀諾泰科技發(fā)展有限公司，型號：ZS000012）、微量注射器：（Hamilton，US，型號：Model 710 N SYR）、熒光倒置顯微鏡（ZEISS，Germany，型號：AXiovert200）、足底熱輻射測痛儀（UGO BASILE，Italy，型號：37370）。

2 實驗方法

2.1 模型建立及藥物干預(yù) 所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按照隨機數(shù)字表法分為對照組、模型組、治療組，每組8 只。參照文獻[8]建立的造模方法，使用10%的水合氯醛溶液對大鼠實施腹腔注射進行麻醉，注射劑量為0.3mL/100g。麻醉后使用微量注射器將碘乙酸溶液（3mg/50μL）注入模型組及治療組大鼠雙側(cè)膝關(guān)節(jié)腔，每側(cè)50μL。對照組大鼠雙側(cè)膝關(guān)節(jié)各注射50μL 生理鹽水。造模后第2d 治療組大鼠給予桃紅四物湯灌胃治療，劑量為1.35g/（kg·d），灌胃劑量根據(jù)體表面積-劑量換算法計算得出，對照組及模型組大鼠給予等量生理鹽水灌胃，連續(xù)灌胃8 周。

2.2 機械痛閾值測量 造模前及灌胃8 周后測定各組大鼠機械痛閾值，抓取大鼠并將其足背置于電子機械痛儀的壓頭下，當(dāng)大鼠停止掙扎保持安靜后開始檢測，當(dāng)壓頭下壓至大鼠因疼痛出現(xiàn)鳴叫或掙扎時停止下壓，此時所顯示的壓力值即為此動物的痛閾值。測3 次取平均值，測量間隔5min。

2.3 熱痛閾值測量 造模前及灌胃8 周后測定各組大鼠熱痛閾值。將大鼠置于足底熱輻射測痛儀的玻璃板上，將玻璃板擦拭干凈，保證玻璃干燥，將熱痛儀上的“十”字形定位標(biāo)記置于大鼠后足底中央并避開足墊，待大鼠安靜后開始測試計時，待大鼠舔足或移位時，熱痛儀將自動記錄時間。該時間即為熱痛閾值。測量3 次取平均值，測量間隔5s。熱痛儀參數(shù)設(shè)定為時間上限20s，溫度上限35℃。

2.4 病理觀察 大鼠經(jīng)CO2窒息處死后截斷一側(cè)脛骨、股骨中部，用10%中性甲醛固定48h，隨后使用EDTA 脫鈣液脫鈣4 周，常規(guī)脫水包埋后沿膝關(guān)節(jié)矢狀面做縱軸方向作切片，切片厚度未5μm，常規(guī)SO染色后封片，置于光鏡進行觀察、拍照，并參照Mankin 關(guān)節(jié)軟骨病理評分標(biāo)準(zhǔn)[9]進行積分統(tǒng)計（見表1）。另一側(cè)去除關(guān)節(jié)周圍軟組織，-80℃保存用于Western blot 檢測。

表1 Mankin 評分

2.5 Western blot 檢測自噬相關(guān)蛋白 -80℃保存的膝關(guān)節(jié)解凍后取關(guān)節(jié)軟骨，在研缽中加入液氮研磨成粉末，加入RIPA（RIPA∶PMSF=100∶1）裂解液于冰上裂解后12000r/min 4℃離心15min 并使用BCA 法測定蛋白濃度，加入5×蛋白上樣緩沖液在金屬浴中變性10min，溫度設(shè)置為95℃。將蛋白使用10%及12%的SDSPAGE 凝膠電泳分離，電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，用5%的脫脂奶粉（TBST 配置）在室溫下封閉1h，TBST 洗膜3 次后加入相應(yīng)一抗（LC3，Beclin 1，p62）4℃孵育過夜；第二天用TBST 洗去一抗，并加入對應(yīng)種屬的二抗，在室溫下孵育1h，TBST 洗膜3 次，用ODYSSEY 雙色紅外激光成像系統(tǒng)掃膜，并使用Image Studio Ver 2.0 軟件處理實驗結(jié)果。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0 軟件分析數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布計量資料，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用獨立樣本t 檢驗，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠機械痛閾值比較 各組大鼠機械痛閾值在造模前比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。灌胃8 周后，模型組大鼠機械痛閾值顯著低于對照組（P＜0.01），經(jīng)桃紅四物湯灌胃治療后，治療組大鼠機械痛閾值顯著高于模型組（P＜0.01），見表2。

表2 各組大鼠機械痛閾值改變（g，）

表2 各組大鼠機械痛閾值改變（g，）

注：正常組大鼠為生理鹽水對照造模用生理鹽水灌胃；模型組大鼠為碘乙酸造模后生理鹽水灌胃；治療組大鼠為碘乙酸造模后桃紅四物湯灌胃；與對照組灌胃后比較，aP<0.01；與模型組灌胃后比較，bP<0.01

3.2 各組大鼠熱痛閾值比較 各組大鼠熱痛閾值在造模前差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。灌胃8 周后，模型組大鼠熱閾值顯著低于對照組（P＜0.01），經(jīng)桃紅四物湯灌胃治療后，治療組大鼠機械痛閾值高于模型組（P＜0.01），見表3。

表3 各組大鼠熱痛閾值比較（s，）

表3 各組大鼠熱痛閾值比較（s，）

注：正常組大鼠為生理鹽水對照造模后生理鹽水灌胃；模型組大鼠為碘乙酸造模后生理鹽水灌胃；治療組大鼠為碘乙酸造模后桃紅四物湯灌胃；與對照組灌胃后比較，aP<0.01；與模型組灌胃后比較，bP<0.01

3.3 各組大鼠膝關(guān)節(jié)病理改變 各組大鼠膝關(guān)節(jié)病理改變情況圖1 所示，對照組大鼠膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨細胞在光鏡下分布均勻，排列整齊，各層次清晰，無細胞缺失，未見肥大軟骨細胞，無明顯細胞簇集現(xiàn)象，潮線下骨小梁無斷裂減少；模型組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細胞明顯缺失并伴有局灶性侵蝕和裂隙關(guān)節(jié)軟骨淺表區(qū)，軟骨細胞肥大增生；治療組大鼠膝關(guān)節(jié)可見軟骨底層少量軟骨細胞肥大，軟骨細胞輕度增生，軟骨細胞也有明顯改善。

圖1 各組大鼠膝關(guān)節(jié)病理切片（SO 染色，50×）

3.4 各組大鼠Mankin 評分比較 模型組大鼠膝關(guān)節(jié)病理切片Mankin 評分顯著高于對照組（P＜0.01）；經(jīng)桃紅四物湯治療后，治療組與模型組Mankin 評分比較，顯著降低（P＜0.01）。見表4。

表4 各組大鼠膝關(guān)節(jié)切片Mankin 評分比較（分，）

表4 各組大鼠膝關(guān)節(jié)切片Mankin 評分比較（分，）

注：正常組大鼠為生理鹽水對照造模生理鹽水灌胃，模型組大鼠為碘乙酸造模后生理鹽水灌胃，治療組大鼠為碘乙酸造模后桃紅四物湯灌胃；與對照組灌胃后比較，aP<0.01；與模型組灌胃后比較，bP<0.01

3.5 各組大鼠Western blot 檢測結(jié)果 模型組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織自噬相關(guān)蛋白Beclin 1、LC3 表達水平與對照組比較顯著下降（P<0.01），p62 表達明顯提高（P<0.01）；與模型組比較，治療組Beclin 1、LC3 表達水平明顯提高（P<0.01），p62 表達明顯下降（P<0.01）。見圖2、表5。

圖2 大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織自噬相關(guān)蛋白表達水平

表5 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織自噬相關(guān)蛋白相對表達量比（）

表5 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織自噬相關(guān)蛋白相對表達量比（）

注：正常組大鼠為生理鹽水對照造模后生理鹽水灌胃；模型組大鼠為碘乙酸造模后生理鹽水灌胃；治療組大鼠為碘乙酸造模后桃紅四物湯灌胃；p62 為核孔糖蛋白62；Beclin1 為自噬關(guān)鍵調(diào)控蛋白復(fù)合物；LC3 為微管相關(guān)蛋白1A/1B-輕鏈3；與對照組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01

3 討論

OA 是骨科常見的慢性疾病，中醫(yī)認為OA 屬“痹證”“骨痹”的范疇，常因肝、脾、腎虧虛，氣血不足，或因感受風(fēng)寒濕外邪而閉阻經(jīng)絡(luò)血脈瘀阻，不能榮養(yǎng)關(guān)節(jié)所致，故因治以補肝益腎、活血祛瘀[5，10-11]。桃紅四物湯最初用于調(diào)經(jīng)，因其藥味均有補血活血之功效，契合OA 病因病機，故用作OA 治療之選[12]。大量臨床數(shù)據(jù)表明，桃紅四物湯對OA 有較好的功效，能顯著減輕患者關(guān)節(jié)腫脹、疼痛，增強運動功能[13]。然而關(guān)于桃紅四物湯治療OA 的機制研究鮮有報道，本研究通過大鼠膝關(guān)節(jié)腔注射碘乙酸建立OA模型，并使用桃紅四物湯灌胃干預(yù)以探究桃紅四物湯治療OA 的潛在機制。

本研究發(fā)現(xiàn)，桃紅四物湯能明顯提高OA 模型大鼠壓痛及熱刺激痛閾值，說明桃紅四物湯確實能改善OA 的癥狀；通過病理檢測發(fā)現(xiàn)OA 模型大鼠的膝關(guān)節(jié)病理改變也有了明顯恢復(fù)。自噬的過程包括吞噬泡的形成及擴張、自噬體形成、自噬溶酶體形成、被吞噬底物降解等，其中LC3 是自噬核心蛋白，對于自噬小體的融合與成熟必不可少，其數(shù)量可反應(yīng)自噬小體的數(shù)量，因此LC3 的表達量反應(yīng)了自噬的活躍程度；而Beclin1 蛋白則是促進自噬囊泡形成重要蛋白，對促進自噬也具有十分重要意義；p62 作為自噬降解底物蛋白，抵抗自噬激活[14-15]。在本研究中經(jīng)桃紅四物湯治療后的OA 模型大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織內(nèi)LC3、Beclin 1 等促自噬蛋白表達升高，抗自噬蛋白p62 表達顯著下降，結(jié)果表明了自噬的激活。自噬激活形成的大量自噬小體通過吞噬衰老、受損的細胞，調(diào)節(jié)炎癥等多方面作用改善癥狀治療OA[16]。

綜上所述，桃紅四物湯可能通過激活軟骨細胞自噬治療碘乙酸誘導(dǎo)的OA 模型大鼠。