小麥TaKLU基因調(diào)控植物株型的研究

周夢(mèng)蝶，李夢(mèng)瑤，吳林楠，郭利建，王 倩,2，馬 猛,2

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.旱區(qū)作物逆境分子生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌712100)

作物株型受株高、分枝數(shù)目、分枝角度等因素的影響，是決定作物產(chǎn)量的關(guān)鍵因素之一。其中，分枝數(shù)目是影響株型的主要因素，一般與株高呈負(fù)相關(guān)。在表現(xiàn)形式上，作物通常有兩種分枝狀態(tài)，分別為分枝少而株高高與分枝多而株高矮，表現(xiàn)為頂端優(yōu)勢(shì)的加強(qiáng)與弱化。因此，作物的分枝數(shù)目及株型在很大程度上受到頂端優(yōu)勢(shì)的影響，進(jìn)而決定作物產(chǎn)量形成。不同作物對(duì)頂端優(yōu)勢(shì)的利用存在很大差異。如玉米通過加強(qiáng)頂端優(yōu)勢(shì)、減少分枝來增加產(chǎn)量，而水稻則通過增加分枝數(shù)目、弱化頂端優(yōu)勢(shì)來提高產(chǎn)量。因此，改良作物株型是成功培育高產(chǎn)作物新品種的關(guān)鍵途徑之一，但調(diào)控小麥株型的分子機(jī)制尚不明了。

基因家族是一類只存在于植物體內(nèi)的P450亞家族，對(duì)作物的性狀改良育種具有重要的意義。前人對(duì)家族基因的研究多集中在單個(gè)器官發(fā)育上，尤其是對(duì)籽粒大小的調(diào)控。擬南芥中，5()基因正調(diào)控生殖器官大小，過表達(dá)該基因會(huì)導(dǎo)致花序和種子增大；和雙突變體表現(xiàn)為育性降低和籽粒變小，導(dǎo)致產(chǎn)量降低。水稻中，()基因通過調(diào)節(jié)胚和胚乳的比例，影響籽粒大小和產(chǎn)量；()基因是擬南芥基因的直系同源基因，通過調(diào)節(jié)葉原基細(xì)胞的增殖影響葉片發(fā)育，突變體表現(xiàn)為葉片起始速率加快、葉片變小。玉米中，()基因調(diào)控器官大小、株高和產(chǎn)量，并且涉及生長素代謝，暗示基因的調(diào)控作用可能不僅僅局限于單個(gè)器官，甚至于影響整個(gè)植株的發(fā)育。目前研究者普遍認(rèn)為，家族基因以非細(xì)胞自主的方式，通過調(diào)控下游的促生因子來促進(jìn)植株發(fā)育，即類似于植物激素的作用模式。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，小麥基因家族包含四個(gè)成員，分別為、(以下用表示)、和，其中，和基因?qū)ψ蚜４笮『蜕称鞴侔l(fā)育具有顯著調(diào)控作用。然而植物中關(guān)于家族基因調(diào)控株型的研究鮮有報(bào)道。本研究通過綜合調(diào)查小麥對(duì)擬南芥分枝數(shù)目、頂端優(yōu)勢(shì)的影響，初步明確基因與株型的關(guān)系，以期為進(jìn)一步揭示基因調(diào)控植物株型的功能和機(jī)制奠定基礎(chǔ)，為小麥株型改良育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究所用小麥材料為小偃6號(hào)，擬南芥材料為哥倫比亞野生型(Columbia-0)。擬南芥功能缺失突變體(Salk_024697C)購自Biological Resource Center(https://abrc.osu.edu/)。

LB：左邊界；35S T PolyA：35S(CaMV35S)終止子；Bar：抗除草劑基因；CaMV35S/35S：花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子；pKLU：擬南芥KLU基因啟動(dòng)子；pINO：擬南芥胚珠特異啟動(dòng)子；NOS T：NOS基因終止子；RB：右邊界。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 陽性植株的篩選

利用RNA提取試劑盒(百泰克，中國)提取小麥苗期葉片總RNA，并用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(艾科瑞，中國)反轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用特異性引物TaKLU-cDNA-F/R對(duì)基因編碼區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。選用pCAMBIA3301表達(dá)載體(含有35S啟動(dòng)子和Basta除草劑抗性)進(jìn)行載體構(gòu)建，通過I和II限制性酶切位點(diǎn)將基因的編碼區(qū)序列連接到pCAMBIA3301載體的35S啟動(dòng)子，獲得35S::過表達(dá)載體(圖1A)，并將其導(dǎo)入野生型擬南芥中，獲得3個(gè)轉(zhuǎn)基因擬南芥株系(35S::-1、35S::-3和35S::-5)。利用特異性引物pKLU-F/R擴(kuò)增擬南芥基因(AT1G13710)上游2 229 bp的啟動(dòng)子序列，通過R I和I限制性酶切位點(diǎn)將擴(kuò)增得到的pKLU啟動(dòng)子序列替換表達(dá)載體p35S::中的35S啟動(dòng)子序列，獲得表達(dá)載體pKLU::(圖1B)；利用特異性引物pINO-F/R擴(kuò)增擬南芥基因 (AT1G23420)啟動(dòng)子序列，通過R I和I限制性酶切位點(diǎn)將擴(kuò)增得到的pINO啟動(dòng)子序列替換35S::中的35S啟動(dòng)子序列，獲得表達(dá)載體pINO::(圖1C)。具體引物序列見表1。上述構(gòu)建的表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105中，并通過花序侵染法導(dǎo)入擬南芥突變體中進(jìn)行回補(bǔ)試驗(yàn)，獲得pKLU::;、pINO::;和35S::;回補(bǔ)轉(zhuǎn)基因株系，以驗(yàn)證基因在調(diào)控株型和器官發(fā)育方面的功能。

表1 本研究使用的引物信息Table 1 Primers used in the study

將上述T代轉(zhuǎn)基因擬南芥株系、野生型以及突變體材料的種子種植在蛭石和營養(yǎng)土的混合 (1∶2)土壤中，在溫室(16 h光照/8 h黑暗)中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為22 ℃，直至全部角果成熟。

基于陽性轉(zhuǎn)基因擬南芥能夠獲得除草劑Basta(含20%草銨膦)的抗性，本研究通過對(duì)擬南芥葉片(2片真葉時(shí))噴施200 mg·L的Basta溶液對(duì)陽性植株進(jìn)行初步篩選；用CTAB法提取轉(zhuǎn)基因陽性植株、野生型和突變體的葉片DNA，以野生型和突變體的葉片DNA為對(duì)照，進(jìn)一步利用TaKLU-F/R引物(表1)對(duì)Basta篩選的陽性植株進(jìn)行PCR鑒定；最后綜合Basta篩選和PCR鑒定結(jié)果，確定下一步試驗(yàn)的陽性植株。PCR反應(yīng)體系為20 μL，包括2×Rapid Tap Master Mix(諾唯贊，中國)10 μL，模板DNA(60 ng·μL)1 μL，上下游引物(10 μmol·μL)各0.5 μL，HO 8 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，68 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，29 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。

為了進(jìn)一步檢測(cè)回補(bǔ)轉(zhuǎn)基因擬南芥中的基因是否正常表達(dá)，收集轉(zhuǎn)基因擬南芥和對(duì)照植株組織的樣品[其中pINO啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株以及野生型和突變體在生殖生長期(發(fā)芽后6周)取花序作為檢測(cè)樣品，其他啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)基因擬南芥在發(fā)芽后3周取葉片作為檢測(cè)樣品]，利用RNA提取試劑盒(百泰克，中國)提取上述樣品總RNA，并用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(艾科瑞，中國)反轉(zhuǎn)錄為cDNA；以TaKLU-RT-F/R為引物，利用qRT-PCR檢測(cè)基因的轉(zhuǎn)錄水平。以cDNA為模板，PCR反應(yīng)體系同上。PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)。

1.2.2 轉(zhuǎn)基因擬南芥的形態(tài)學(xué)觀察

以野生擬南芥為對(duì)照，對(duì)35S::、pKLU::;、35S::;和pINO::;轉(zhuǎn)基因株系的分枝數(shù)目和頂端優(yōu)勢(shì)進(jìn)行觀察，并在萌發(fā)后10周統(tǒng)計(jì)不同株系的總分枝數(shù)目，用數(shù)碼相機(jī)記錄表型，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 轉(zhuǎn)基因擬南芥的產(chǎn)量性狀統(tǒng)計(jì)

為了測(cè)量準(zhǔn)確，一個(gè)小盆種一株擬南芥。待野生型、35S::轉(zhuǎn)基因植株和突變體植株開始有角果成熟時(shí)，以單株為單位，每隔1 d收集一次成熟且干黃的角果，直至所有角果成熟。最后將所有種子置于37 ℃烘箱中放置一周，完全干燥后用于測(cè)定單株產(chǎn)量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2013對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行平均值、檢驗(yàn)和標(biāo)準(zhǔn)誤的分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因擬南芥的陽性鑒定結(jié)果

T代轉(zhuǎn)基因擬南芥的種子在混合營養(yǎng)土中萌發(fā)后，經(jīng)過Basta溶液噴施篩選后，挑選陽性幼苗移栽到小盆中進(jìn)行下一步的檢測(cè)和觀察。待發(fā)芽后3周，提取35S::、pINO::;、pKLU::;、35S::;轉(zhuǎn)基因擬南芥以及野生型和突變體的葉片DNA，并用特異性引物TaKLU-F/R進(jìn)行進(jìn)一步的陽性鑒定。結(jié)果(圖2A)顯示，具有Basta抗性的轉(zhuǎn)基因擬南芥均含有外源目的基因。

為更進(jìn)一步檢測(cè)外源目的基因在擬南芥中的表達(dá)水平，在發(fā)芽后3周收集35S::、pKLU::;和35S::;轉(zhuǎn)基因擬南芥以及野生型和突變體的葉片，在發(fā)芽后6周收集pINO::;轉(zhuǎn)基因擬南芥以及野生型和突變體的花序，提取樣品的總RNA，并利用qRT-PCR檢測(cè)目的基因的表達(dá)模式。結(jié)果(圖2B和2C)顯示，35S::、pKLU::;、35S::;和pINO::;轉(zhuǎn)基因擬南芥中均能檢測(cè)到外源目的基因的表達(dá)，而野生型和突變體中未檢測(cè)到基因的表達(dá)，各植株中內(nèi)參基因的表達(dá)模式相擬，表明上述轉(zhuǎn)基因植株均為陽性植株，可用于后續(xù)的表型觀察。

A：不同株系中外源目的基因TaKLU的PCR檢測(cè)；B：qRT-PCR檢測(cè)不同株系葉片中TaKLU的表達(dá)；C：qRT-PCR檢測(cè)不同株系花序中TaKLU的表達(dá)；M：250 bp DNA Ladder Marker；1：野生型擬南芥；2：35S::TaKLU-1；3：35S::TaKLU-3；4：35S::TaKLU-5；5：pKLU::TaKLU;klu；6：35S::TaKLU;klu；7：pINO::TaKLU;klu；8：klu突變體；9：水；Actin：內(nèi)參基因。

2.2 KLU基因缺失對(duì)擬南芥形態(tài)的影響

結(jié)果(圖3)發(fā)現(xiàn)，與野生型擬南芥相比，突變體株高降低，花序和葉片變小，但分枝數(shù)目顯著增加，增幅約為70%。此外，突變體主莖與分枝的高度幾乎無明顯差異，表現(xiàn)為頂端優(yōu)勢(shì)的弱化。因此，推測(cè)基因能夠調(diào)控株型，影響植株的頂端優(yōu)勢(shì)。

A：野生型擬南芥與klu突變體的植株形態(tài)比較；1：野生型；2～5：klu突變體。B：野生型擬南芥與klu突變體的分枝數(shù)目統(tǒng)計(jì)(n>18)；WT：野生型；klu：klu突變體。圖4和圖5同。**表示野生型擬南芥與klu突變體的分枝數(shù)目在0.01水平上差異顯著。

2.3 TaKLU基因過表達(dá)對(duì)擬南芥頂端優(yōu)勢(shì)的 影響

對(duì)野生型擬南芥和35S::轉(zhuǎn)基因擬南芥(以株系35S::-1為研究對(duì)象)的株型進(jìn)行比較，結(jié)果(圖4A)發(fā)現(xiàn)，35S::轉(zhuǎn)基因擬南芥的株高明顯高于野生型擬南芥，且主莖遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于分枝，表現(xiàn)為頂端優(yōu)勢(shì)的加強(qiáng)。此外，基因過表達(dá)還會(huì)抑制分枝的產(chǎn)生，即分枝數(shù)目明顯減少(圖4B)。進(jìn)一步比較野生型擬南芥、35S::轉(zhuǎn)基因擬南芥和突變體的總分枝數(shù)目，結(jié)果顯示，與野生型擬南芥相比，35S::轉(zhuǎn)基因擬南芥的分枝數(shù)目顯著降低(除株系35S::-3與野生型差異不顯著)，降幅約為14%～34%，進(jìn)一步說明了基因過表達(dá)可使頂端優(yōu)勢(shì)加強(qiáng)(圖4B和4C)。綜合以上結(jié)果表明，過表達(dá)小麥基因能夠增強(qiáng)擬南芥的頂端優(yōu)勢(shì)，減少擬南芥的分枝數(shù)目。

A：TaKLU基因過表達(dá)對(duì)擬南芥頂端優(yōu)勢(shì)的影響；B和C：不同株系的分枝情況(B)以及分枝數(shù)目的統(tǒng)計(jì)(C，n>17)。*和**分別表示該株系與野生型擬南芥的分枝數(shù)目在0.05和0.01水平上差異顯著。

2.4 不同啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)小麥TaKLU回補(bǔ)klu突變體后擬南芥的形態(tài)

鑒于小麥基因過表達(dá)和擬南芥基因功能缺失后，擬南芥的株型呈相反的效應(yīng)，即分別表現(xiàn)為頂端優(yōu)勢(shì)的加強(qiáng)和減弱，推測(cè)基因可能在調(diào)控植物株型方面功能保守。為了驗(yàn)證這個(gè)推測(cè)，利用不同啟動(dòng)模式的啟動(dòng)子回補(bǔ)突變體，獲得擬南芥pKLU::;、35S::;、pINO::;回補(bǔ)株系，并以野生型擬南芥和突變體為對(duì)照進(jìn)行表型觀察。結(jié)果(圖5)顯示，由擬南芥基因自身啟動(dòng)子pKLU驅(qū)動(dòng)小麥基因在突變體中表達(dá)，能夠恢復(fù)突變體的表型，表現(xiàn)為pKLU::;回補(bǔ)株系的株高、分枝數(shù)目、葉片和花序大小與野生型擬南芥無明顯差異。與突變體相比，由強(qiáng)啟動(dòng)子35S和特異啟動(dòng)子pINO驅(qū)動(dòng)基因在突變體中表達(dá)的35S::;和pINO::;回補(bǔ)株系均表現(xiàn)為株高明顯升高，與野生型擬南芥相比，分枝數(shù)目有所增加，分別為野生型的1.4和2.6倍，其中pINO::;回補(bǔ)株系與野生型擬南芥之間的分枝數(shù)目差異達(dá)到極顯著水平。所有基因回補(bǔ)株系的頂端優(yōu)勢(shì)都得到了加強(qiáng)，其中pINO::;回補(bǔ)株系的頂端優(yōu)勢(shì)加強(qiáng)的效應(yīng)最為顯著，其主分枝較其他分枝明顯伸長(圖5A)，這也進(jìn)一步支持了過表達(dá)基因能夠加強(qiáng)頂端優(yōu)勢(shì)的結(jié)論。以上結(jié)果表明，和基因在調(diào)控株型上功能保守，均具有正調(diào)控植株頂端優(yōu)勢(shì)的功能。

A：不同啟動(dòng)模式下小麥TaKLU回補(bǔ)klu突變體的表型；1：野生型；2：pKLU::TaKLU;klu；3：35S::TaKLU;klu；4：pINO::TaKLU;klu；5：klu突變體。B：不同株系的分枝數(shù)目(n=6)。**表示該株系與野生型擬南芥的分枝數(shù)目在0.01水平上差異顯著。

2.5 KLU基因?qū)M南芥產(chǎn)量的影響

通過對(duì)野生型擬南芥、35S::轉(zhuǎn)基因擬南芥以及突變體的單株產(chǎn)量進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果(表2)發(fā)現(xiàn)，與野生型擬南芥相比，35S::轉(zhuǎn)基因擬南芥的單株產(chǎn)量與野生型無顯著差異，而突變體的單株產(chǎn)量極顯著下降，降幅為 50.8%。這說明基因不僅影響植物株型，還影響擬南芥的單株產(chǎn)量。

表2 TaKLU基因過表達(dá)對(duì)擬南芥產(chǎn)量的影響Table 2 Effect of TaKLU gene overexpression on Arabidopsis yield

3 討 論

在被子植物中，頂端優(yōu)勢(shì)和分枝數(shù)目在很大程度上決定了植物的株型，并影響植物的營養(yǎng)分配、株高、產(chǎn)量等。作物的馴化也常常涉及株型和頂端優(yōu)勢(shì)的變化，通過選擇抑制或促進(jìn)芽的形成來減少或增加分枝數(shù)目，進(jìn)而改變作物的株型和頂端優(yōu)勢(shì)。擬南芥基因具有調(diào)控葉片和花序生長與發(fā)育的功能，其突變體表現(xiàn)為葉片和花序變小，本研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥基因的功能缺失導(dǎo)致植株株高降低和頂端優(yōu)勢(shì)弱化、分枝數(shù)目增加、器官變??；相反地，采用組成型強(qiáng)啟動(dòng)子35S驅(qū)動(dòng)小麥基因在擬南芥中過表達(dá)，可使擬南芥株高增加和頂端優(yōu)勢(shì)增強(qiáng)，分枝數(shù)目減少、器官增大(數(shù)據(jù)未展示)，表明基因?qū)χ参镏晷途哂姓{(diào)控作用。本研究通過回補(bǔ)試驗(yàn)，觀察分析了pKLU::;、35S::;、pINO::;回補(bǔ)株系與野生型擬南芥和突變體的表型差異，發(fā)現(xiàn)所有基因回補(bǔ)株系的頂端優(yōu)勢(shì)都得到了加強(qiáng)，其中pINO::;回補(bǔ)株系的頂端優(yōu)勢(shì)加強(qiáng)的效應(yīng)最為顯著，其主分枝較其他分枝明顯伸長，進(jìn)一步證實(shí)了基因在調(diào)控植株株型和頂端優(yōu)勢(shì)方面功能保守，為基因在作物株型遺傳改良方面奠定基礎(chǔ)。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，基因具有正調(diào)控種子大小的功能，而擬南芥基因缺失導(dǎo)致種子大小和結(jié)實(shí)率顯著降低，暗示盡管過表達(dá)基因會(huì)引起種子增大，但過表達(dá)基因還會(huì)導(dǎo)致頂端優(yōu)勢(shì)加劇、分枝數(shù)目降低，很可能抵消種子增大對(duì)產(chǎn)量增加的正效應(yīng)，本研究中35S::轉(zhuǎn)基因擬南芥的單株產(chǎn)量較野生型無明顯差異，可能就是以上原因造成的。相反，盡管突變體表現(xiàn)為分枝數(shù)目增加，但籽粒變小、結(jié)實(shí)率和頂端優(yōu)勢(shì)降低對(duì)產(chǎn)量降低具有更強(qiáng)的負(fù)效應(yīng)，本研究中突變體的單株產(chǎn)量較野生型降低了50.8%，推測(cè)可能也是這個(gè)原因造成的。Adamski等研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)擬南芥中基因進(jìn)行過表達(dá)和敲除，均會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)量顯著降低。因此，適當(dāng)?shù)捻敹藘?yōu)勢(shì)和合適的分枝數(shù)目才有利于作物產(chǎn)量的提高。鑒于此，Guo等對(duì)小麥基因的利用提出了新的策略，即在小麥籽粒發(fā)育階段通過局部過表達(dá)基因，達(dá)到在不影響小麥株型的前提下增加粒重，實(shí)現(xiàn)了單株產(chǎn)量顯著增加的目的。但該研究并未實(shí)現(xiàn)基因在株型改良上的應(yīng)用。綜上，基因作為一種在單子葉和雙子葉植物中功能保守的株型調(diào)控因子，在作物株型遺傳改良育種中仍需要進(jìn)一步的探索。

目前，研究者普遍認(rèn)為，頂端優(yōu)勢(shì)和分枝數(shù)目受激素水平調(diào)控。例如，基因編碼一種色氨酸轉(zhuǎn)氨酶，水稻突變體由于內(nèi)源生長素分泌減少，導(dǎo)致頂端優(yōu)勢(shì)減弱。基因編碼脫落酸生物合成酶，過表達(dá)水稻基因可通過參與獨(dú)腳金內(nèi)酯對(duì)腋芽的調(diào)控，從而減少水稻分蘗，調(diào)控植株形態(tài)。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，小麥基因在調(diào)控器官發(fā)育過程中可影響生長素代謝通路，改變生長素的積累，推測(cè)基因調(diào)控植物頂端優(yōu)勢(shì)和分枝數(shù)目與激素調(diào)控也有關(guān)系，但相關(guān)機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。