水稻耐低氮基因OsTPP6的鑒定及功能分析

任秋韻,田云錄,劉曉嵐,余珺,唐偉杰,陳高明,林之希,李靜,王春明*,萬建民,2

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/江蘇省現(xiàn)代作物生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 南京 210095; 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所,北京 100081)

目前我國氮肥的施用量一直居高不下,但僅有30%～50%的氮肥能被水稻吸收,其余的以N2O的形式排放到大氣中,或者滲入水系統(tǒng)中造成水質(zhì)富營養(yǎng)化[1-2],對環(huán)境產(chǎn)生極為不利的影響。此外,過量的氮肥對水稻產(chǎn)生諸多不利的影響,如抗折力下降,節(jié)間抗倒伏能力降低[3],單穗籽粒數(shù)、結(jié)實(shí)率和千粒重下降,單產(chǎn)降低[4],稻瘟病[5]、紋枯病[6]發(fā)生增加等。因此,挖掘水稻高效利用氮肥的新基因具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

氮高效利用是一個(gè)復(fù)雜的數(shù)量性狀,由多基因以及環(huán)境因素共同控制[7]。目前,已有幾種硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因成功克隆并運(yùn)用于水稻氮高效利用性狀的改良[8-12]。海藻糖(trehalose)是一種穩(wěn)定的非還原性二糖,已知的海藻糖生物合成途徑至少有5種,但在植物中唯一存在的則是海藻糖 6-磷酸合成酶/海藻糖 6-磷酸磷酸酶(TPS/TPP)途徑,它涉及TPS和TPP催化的2個(gè)步驟,TPS催化葡萄糖從UDP-葡萄糖(UDP-glucose)轉(zhuǎn)移到葡萄糖6-磷酸(glucose 6-phosphate,G6P)形成海藻糖6-磷酸(T6P),然后TPP將T6P去磷酸化形成海藻糖[13]。植物中的TPP家族高度保守,對TPP功能的研究較少,主要與逆境脅迫相關(guān)[14-16]。擬南芥中的TPP被證明與硝態(tài)氮有關(guān),在低氮和無氮脅迫下,AtTPPB、AtTPPJ、AtTPPF、AtTPPG、AtTPPH的表達(dá)均明顯下調(diào)[17-20]。擬南芥中過表達(dá)TPP基因降低了植株體內(nèi)T6P的水平,葉片中的AGPase氧化還原激活下降,淀粉含量下降[21]。但是,T6P不是通過影響AGPase來調(diào)節(jié)淀粉的合成和分解,而是通過調(diào)節(jié)植物的生物鐘進(jìn)行的[22],關(guān)于T6P影響淀粉代謝的機(jī)制尚不明晰。

為了發(fā)掘自然群體中影響水稻氮高效利用的優(yōu)異等位基因,本研究通過全基因組關(guān)聯(lián)分析和單倍型分析,鑒定了一個(gè)水稻氮素利用相關(guān)基因OsTPP6。OsTPP6響應(yīng)硝態(tài)氮信號,影響硝態(tài)氮的吸收,該基因的突變增加了籽粒堊白率,使得淀粉合成相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)。研究該基因功能為提高氮素利用效率改良籽粒品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存的117個(gè)不同來源的對氮素響應(yīng)差異顯著的水稻地方品種為材料,通過全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome wide association study,GWAS)挖掘氮素相關(guān)基因。117個(gè)品種包括55個(gè)粳稻、48個(gè)秈稻以及14個(gè)中間型材料,其中包括已報(bào)道的氮敏感品種‘南京 6號’和耐低氮品種‘千重浪2號’。所有供試材料于2019和2020年種植于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)土橋水稻育種基地,分正常氮田與低氮田種植,采用完全隨機(jī)田間分組設(shè)計(jì),正常田與低氮田各2組重復(fù),每組每個(gè)地方品種種植4行,每行10株;T-DNA插入突變體種植野生型‘Dongjin’作為對照,正常田與低氮田各5組重復(fù),每組種植4行,每行10株。正常田的基礎(chǔ)氮水平為全氮1.86 g·kg-1,低氮田的全氮為1.40 g·kg-1。施用氮肥量正常田為300 kg·hm-2,低氮田為0 kg·hm-2,所有試驗(yàn)田的鉀肥和磷肥的施用量均為100 kg·hm-2。OsTPP6基因T-DNA插入突變體由韓國慶熙大學(xué)作物生物技術(shù)研究所和基因工程實(shí)驗(yàn)室(https://orygenesdb.cirad.fr/cgi-bin/gbrowse/odb_japonica/)創(chuàng)制,插入的受體材料為‘Dongjin’(粳稻)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 田間表型觀測在水稻成熟期調(diào)查株高、有效分蘗數(shù),去除邊際效應(yīng)植株,每組15株重復(fù)。通過計(jì)算低氮和高氮條件下的株高、有效分蘗數(shù),將水稻生長發(fā)育的關(guān)鍵決定因素株高比(plant height ratio,PHR)和有效分蘗數(shù)比(effective panicle number ratio,EPNR)作為低氮耐受性指標(biāo)。水稻收割后,考察穗長、粒長、粒寬、結(jié)實(shí)率、千粒重等農(nóng)藝性狀,每株3穗重復(fù)。

1.2.2 幼苗培養(yǎng)采用水培法,在人工氣候室進(jìn)行(16 h光照,30 ℃;8 h黑暗,20 ℃)。全營養(yǎng)素培養(yǎng)(包括硝酸鹽和銨鹽)至2葉1心期,在0、0.25、1.44、2.50 mmol·L-1KNO3營養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)10 d左右;取‘Dongjin’和OsTPP6T-DNA插入家系各15株,測量苗期的株高、地上部鮮重、地上部干重(鮮樣置于 50 ℃烘箱1周烘干后測量)。其中用以氮饑餓轉(zhuǎn)錄組分析的幼苗,以尿素作為唯一的氮源培養(yǎng)2周后,將一半的幼苗置于無氮營養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)21 d后,取樣。

1.2.3OsTPP6單倍型分析采用DNAsecure Plant Kit(版本號:DP171206)提取DNA。設(shè)計(jì)OsTPP6全長基因引物,在117個(gè)地方品種中擴(kuò)增OsTPP6基因的全長序列。PCR產(chǎn)物測序結(jié)果通過Sequencher 5.4.5軟件進(jìn)行比對分析,得到117個(gè)地方品種中OsTPP6編碼區(qū)的SNP,利用GraphPad Prism 8軟件繪圖。

1.2.4OsTPP6T-DNA插入片段檢測采用CTAB法提取DNA,其中T-DNA檢測的引物一端設(shè)計(jì)在基因上,另一端設(shè)計(jì)在插入片段上,用10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.5 RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄、實(shí)時(shí)熒光定量PCR用RNAprep Pure Plant Kit提取水稻根系RNA(淀粉相關(guān)基因定量提取花后18 d的籽粒RNA)。采用TaKaRa(大連)公司的反轉(zhuǎn)錄試劑進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,得到 cDNA。用SYBR GREENProTaqHS預(yù)混型qPCR試劑盒,在ABI 7500定量PCR儀上進(jìn)行基因的定量檢測,以Actin(水稻微管合成蛋白基因)作為內(nèi)參基因。所用引物見表1。

表1 檢測、測序及定量所用的引物Table 1 Primers used in detection,sequencing and quantification

1.2.615N-KNO3吸收速率分析水稻幼苗在全營養(yǎng)素營養(yǎng)液中培養(yǎng)20 d后,在無氮營養(yǎng)液中饑餓培養(yǎng)3 d,然后轉(zhuǎn)移至0.1 mmol·L-1CaSO4溶液中培養(yǎng)1 min,分別用0.25和2.50 mmol·L-1Ca(15NO3)處理 10 min,處理結(jié)束后放入0.1 mmol·L-1CaSO4溶液中培養(yǎng)1 min,最后置于50 ℃烘箱1周,完全烘干后磨樣過0.28 mm篩,使用穩(wěn)定同位素質(zhì)譜儀 Delta V Advantage(Thermo Fisher ScientificTM)測定地上部、地下部的15N 含量。

1.2.7 籽粒直鏈淀粉含量的測定水稻成熟籽粒去殼后,使用球磨儀磨成精米粉(過0.25 mm孔徑的篩),按照《米質(zhì)測定方法:NY 147—1988》測定直鏈淀粉含量。

1.2.8 籽粒尿素膨脹體積的定性分析配制不同濃度的尿素溶液(0、1、2、3、4、5、6、7、8、9 mol·L-1),稱取20.0 mg精米粉置于1.5 mL的離心管中,分別加入不同濃度的尿素溶液1 mL,25 ℃培養(yǎng)24 h,多次振蕩混勻,待精米粉徹底溶解后8 000g離心30 min,靜置30 min后觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 OsTPP6的鑒定

對117個(gè)地方品種進(jìn)行大田氮高效相關(guān)性狀的全基因組關(guān)聯(lián)分析,2015和2016年分別對EPNR和PHR這 2個(gè)水稻耐低氮品種的表型與分子數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,在8號染色體上檢測到1個(gè)重復(fù)的位點(diǎn)。EPNR和PHR分別與S8_19349877(-lgP=3.35,R2=0.132)和S8 1917_3413(-lgP=4.30,R2=0.111)關(guān)聯(lián),該候選區(qū)間為897 kb,包含49個(gè)基因,294個(gè)導(dǎo)致氨基酸變異的SNP位點(diǎn)(圖1-A)。候選區(qū)間內(nèi)基因中僅有Os08g0400300、Os08g0409100、Os08g0410900和Os08g04146004個(gè)基因響應(yīng)氮饑餓,Os08g0400300和Os08g0410900均被注釋為編碼假定蛋白的基因,Os08g0414600被注釋為編碼含有TolB類似結(jié)構(gòu)域蛋白的基因,TolB結(jié)構(gòu)域在革蘭氏陰性菌中極度保守,在植物中尚未有報(bào)道。Os08g0409100被注釋為編碼海藻糖 6-磷酸磷酸酶基因6(OsTPP6),因此將OsTPP6作為氮素利用相關(guān)的候選基因(圖1-B)。

圖1 OsTPP6的鑒定Fig.1 Identification of OsTPP6 A.關(guān)聯(lián)位點(diǎn)及LD block分析;B. LD block內(nèi)基因的轉(zhuǎn)錄水平對低氮脅迫的響應(yīng)。EPNR:有效分蘗數(shù)比;PHR:株高比。A.The associated sites and analysis of LD block;B. Transcription level of genes in LD block responded to low nitrogen stress. EPNR:Effective panicle number ratio;PHR:Plant height ratio.

2.2 OsTPP6單倍型分析

候選基因OsTPP6CDS區(qū)內(nèi)存在3個(gè)SNP位點(diǎn),分別是19578943 C/G、19578964 G/A、19579049 T/C,并且導(dǎo)致編碼的氨基酸發(fā)生變化,第8位亮氨酸(Leu)變?yōu)槔i氨酸(Val),第15位纈氨酸變?yōu)榧琢虬彼?Met),第43位纈氨酸變?yōu)楸彼?Ala)(圖2-A),根據(jù)這3個(gè)SNP將關(guān)聯(lián)群體分為2種單倍型(HapA、HapB)。HapA包括‘水原264’‘IR36’和‘JC92’等品種,HapB包括‘越光’‘小蔥稻’和‘嘉花1號’等品種。HapA的株高比、有效分蘗比均顯著高于HapB(圖2-B),即HapA為一種優(yōu)勢單倍型。

圖2 OsTPP6的2種單倍型HapA和HapB分析Fig.2 The two haplotypes HapA and HapB analysis of OsTPP6 A. OsTPP6兩種單倍型的SNP差異;B. OsTPP6兩種單倍型的表型。差異顯著性分析采用t測驗(yàn)。下同。A. The SNP differences between the two haplotypes of OsTPP6;B. Phenotype of the two haplotypes of OsTPP6. The significance analysis of the difference adopts the t test. The same below.

2.3 OsTPP6 T-DNA插入片段的驗(yàn)證

在野生型中可以擴(kuò)增出OsTPP6基因全長的片段,但不能擴(kuò)增出T-DNA插入部分片段,而在T-DNA插入突變體中,既可以擴(kuò)增出T-DNA插入片段的部分片段,也可以擴(kuò)增出OsTPP6基因上的片段(圖3-A、B),推測該T-DNA插入突變體為雜合植株。T-DNA插入突變體中OsTPP6的表達(dá)水平相較于野生型顯著下降(圖3-C)。

圖3 OsTPP6 T-DNA插入片段的驗(yàn)證Fig.3 Verification of OsTPP6 T-DNA insert A. T-DNA的插入位點(diǎn)和引物的設(shè)計(jì);B. T-DNA插入位點(diǎn)的PCR檢測;C.野生型和T-DNA插入突變體中OsTPP6轉(zhuǎn)錄水平。*P<0.05。A. T-DNA insertion site and primer design;B. PCR detection of T-DNA insertion site;C. Transcription level of OsTPP6 in wild type and T-DNA mutation.*P<0.05.

2.4 OsTPP6對氮素的響應(yīng)分析

通過檢測野生型與T-DNA插入突變體中氮素相關(guān)基因表達(dá)水平發(fā)現(xiàn),銨態(tài)氮吸收利用相關(guān)的基因OsAMT1;2、OsAMT2;1、OsAMT2;2、OsAMT2;3、OsAMT3;1、OsAMT3;2(銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因)、OsGDH1、OsGDH3(谷氨酸脫氫酶基因)、OsGOGAT2(谷氨酸合酶基因)、OsGS1;1、OsGS1;2(谷氨酰胺合成酶基因)的表達(dá)水平在野生型和 T-DNA 插入突變體中無明顯差異,但與硝態(tài)氮利用相關(guān)的基因OsNIA2(硝酸還原酶基因)、OsNRT1.1、OsNRT2.1、OsNRT2.2(硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因)的表達(dá)量在T-DNA插入突變體中均顯著上調(diào)(圖4-A),表明基因OsTPP6可能與硝態(tài)氮利用相關(guān)。

圖4 野生型和OsTPP6 T-DNA插入突變體對硝酸鹽的響應(yīng)Fig.4 Wild type and OsTPP6 T-DNA mutation response to nitrate*P<0.05,**P<0.01. The same below.

在低濃度硝酸鹽處理下,OsTPP6在處理2 h表達(dá)量顯著上升(圖4-B),而在高濃度硝酸鹽處理下,OsTPP6在處理32 h表達(dá)量顯著上升(圖4-C)。表明低濃度硝態(tài)氮能迅速誘導(dǎo)OsTPP6表達(dá)。

2.5 OsTPP6 T-DNA插入突變體15N吸收速率分析

圖處理10 min后野生型和OsTPP6 T-DNA插入突變體15N吸收速率分析Fig.5 Analysis of 15N uptake rates in wild type and OsTPP6 T-DNA mutation treatment for 10 min

2.6 OsTPP6 T-DNA插入突變體苗期表型分析

用0、0.25、1.44、2.50 mmol·L-1KNO3分別處理野生型和T-DNA插入突變體,在1.44 mmol·L-1KNO3處理?xiàng)l件下,野生型和T-DNA插入突變體長勢最佳、均有最大生物量,且T-DNA插入突變體地上部生物量顯著高于野生型;在較低濃度(0、0.25 mmol·L-1)硝酸鹽處理時(shí),T-DNA插入突變體的株高相較于野生型顯著降低,但地上部生物量無明顯變化;在高濃度(2.50 mmol L-1)硝酸鹽處理時(shí),野生型和T-DNA插入突變體的株高和地上部生物量均無差異(表2)。此外,在4種處理?xiàng)l件下,T-DNA插入突變體中OsNIA2的表達(dá)量均較野生型顯著上調(diào)(圖6)。以上結(jié)果進(jìn)一步表明OsTPP6響應(yīng)硝態(tài)氮信號,且負(fù)調(diào)控硝酸還原酶基因的表達(dá)。

圖6 不同硝酸鹽濃度處理?xiàng)l件下野生型和OsTPP6 T-DNA插入突變體的相對表達(dá)水平Fig.6 Relative expression level of wild type and OsTPP6 T-DNA mutation under different nitrate concentration treatments

表2 4種硝酸鹽濃度處理下野生型和T-DNA插入突變體苗期表型Table 2 Phenotypes of wild type and T-DNA mutation under treatment with four nitrate concentrations in seedling stage

用野生型和T-DNA插入突變體不同濃度和零濃度硝酸根處理?xiàng)l件下中不同性狀(株高、地上部鮮重、地上部干重)差值與零濃度硝酸根處理時(shí)各生理指標(biāo)的比值(HN-LN/LN),來表征對氮素響應(yīng)程度,反映氮素利用效率。發(fā)現(xiàn)在0.25和2.50 mmol·L-1KNO3處理中,T-DNA插入突變體對硝酸鹽的響應(yīng)均顯著高于野生型,說明氮素利用效率提高,在1.44 mmol· L-1KNO3時(shí),T-DNA插入突變體對硝酸鹽的響應(yīng)達(dá)到最大值(圖7),表明OsTPP6負(fù)調(diào)控水稻對硝態(tài)氮的利用。

圖7 野生型和T-DNA插入突變體的苗期生長指標(biāo)對不同濃度硝酸鹽的利用差距Fig.7 The difference in the utilization of nitrate at different concentrations of wild-type and T-DNA mutation seedling phenotype (HN-LN)/LN=(某硝酸鹽濃度下的生長指標(biāo)-零硝酸鹽濃度下的生長指標(biāo))/零硝酸鹽濃度下的生長指標(biāo)。PH:株高;SFW:地上部鮮重;SDW:地上部干重。(HN-LN)/LN=(growth index under a certain nitrate concentration-growth index under zero nitrate concentration)/growth index under zero nitrate concentration. PH:Plant height;SFW:Shoot fresh weight;SDW:Shoot dry weight.

2.7 OsTPP6 T-DNA插入突變體大田表型分析

2.7.1OsTPP6T-DNA插入突變體在正常田中的表型分析在正常田中,T-DNA插入突變體的株高、有效分蘗數(shù)、穗長、粒長、千粒重、結(jié)實(shí)率相較于野生型均減小,粒寬則無明顯差異(圖8,表3)。在低氮田中,相比于野生型,T-DNA插入突變體也表現(xiàn)出株高、有效分蘗數(shù)、穗長、粒長、千粒重、結(jié)實(shí)率降低(圖9,表3)。

圖8 OsTPP6 T-DNA插入突變體在正常田的表型Fig.8 Phenotypes of OsTPP6 T-DNA mutation in normal field

表3 野生型和T-DNA插入突變體農(nóng)藝性狀Table 3 Agronomic traits of wild type and T-DNA mutation

圖9 OsTPP6 T-DNA插入突變體在低氮田的表型Fig.9 Phenotypes of OsTPP6 T-DNA mutation in low nitrogen field

通過分析野生型和T-DNA插入突變體在正常田和低氮田中的表型,發(fā)現(xiàn)T-DNA插入突變體對氮素的響應(yīng)比野生型強(qiáng)烈(圖10),說明T-DNA插入突變體具有更高的氮素利用效率,與苗期結(jié)果基本一致(圖7)。綜上所述,OsTPP6的缺失增強(qiáng)了水稻對氮素的利用,提高氮素利用效率,但同樣會影響水稻的生長和發(fā)育,多項(xiàng)農(nóng)藝性狀指標(biāo)與野生型相比降低。

圖10 野生型和T-DNA插入突變體對氮素的響應(yīng)Fig.10 Responses of wild-type and T-DNA mutation to nitrogen (HN-LN)/LN=(正常田的性狀-低氮田的性狀)/低氮田的性狀。(HN-LN)/LN=Calculation of the response of different phenotypes to nitrogen=(traits under normal field-traits under low nitrogen field)/traits under low nitrogen field.PH:株高 Plant height;EPN:有效分蘗數(shù) Effective panicle number;TGW:千粒重 Thousand grain weight;SSR:結(jié)實(shí)率 Seed setting rate.

2.8 OsTPP6 T-DNA插入突變體籽粒的表型、理化性質(zhì)分析及淀粉代謝相關(guān)基因的差異表達(dá)

與野生型相比,T-DNA插入突變體的堊白明顯增多,籽粒胚乳呈粉質(zhì)、不透明狀,而野生型籽粒胚乳則呈現(xiàn)透明狀(圖11-A)。T-DNA插入突變體的直鏈淀粉含量相較于野生型極顯著降低(圖11-B);當(dāng)尿素濃度為5 mol·L-1時(shí),野生型籽粒中的淀粉發(fā)生明顯膨脹,而T-DNA插入突變體則無明顯變化(圖11-C),表明OsTPP6的缺失改變了成熟籽粒中淀粉相關(guān)的理化性質(zhì)。此外,淀粉代謝相關(guān)基因OsAGPL、OsAGPS(ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因)、OsGBSS(直鏈淀粉合成酶基因)、OsTPT(磷酸丙糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因)、OsISA(異淀粉酶基因)、OsGWD(葡聚糖水合二激酶基因)在T-DNA插入突變體中均顯著上調(diào)(圖11-D),表明OsTPP6參與淀粉代謝,進(jìn)而影響籽粒的品質(zhì)。

圖11 OsTPP6 T-DNA插入突變體籽粒的表型、理化性質(zhì)及淀粉代謝相關(guān)基因的差異表達(dá)分析Fig.11 The analysis of phenotype,physical and chemical properties grains and differential expression analysis of genes related to starch metabolism in OsTPP6 mutation A.野生型及T-DNA插入突變體外觀表型;B. 野生型和T-DNA插入突變體籽粒中直鏈淀粉的含量;C.野生型和T-DNA插入突變體籽粒淀粉在不同濃度尿素中的膨脹體積,紅框表示尿素濃度為5 mol·L-1;D.野生型和T-DNA插入突變體中淀粉代謝相關(guān)基因的表達(dá)情況。A. Grain appearance of wild type and T-DNA mutation;B. Amylose content of wild type and T-DNA mutation;C. The starch expansion volume of wild type and T-DNA mutation in different concentrations of urea,the red box indicates the 5 mol·L-1 urea concentration;D. Expression level of genes related to starch metabolism in wild type and T-DNA mutation.

3 討論

TPP作為海藻糖生物合成途徑中的關(guān)鍵酶,目前在水稻中的相關(guān)研究主要圍繞干旱、寒冷、厭氧等逆境脅迫展開[23-26]。同時(shí)水稻中關(guān)于氮素利用效率(nitrogen-use efficiency,NUE)的研究大多集中在雙親本QTL的檢測和同源基因的克隆。并且發(fā)現(xiàn)Aus and Aromatic稻中存在的OsTCP19-H是調(diào)控水稻分蘗響應(yīng)氮素的關(guān)鍵基因[27]。本研究中基于全基因組關(guān)聯(lián)分析,利用2年的大田表型數(shù)據(jù)鑒定了一個(gè)海藻糖 6-磷酸磷酸酶基因(OsTPP6),作為NUE的候選基因。通過分析野生型和T-DNA插入突變體中氮素利用相關(guān)基因的表達(dá)差異、15N吸收速率差異,明確了該基因?qū)ο鯌B(tài)氮的響應(yīng),表明OsTPP6參與水稻硝態(tài)氮利用的相關(guān)途徑。

本研究通過比較野生型和T-DNA插入突變體對不同濃度硝態(tài)氮的利用差異,發(fā)現(xiàn)T-DNA插入突變體對硝態(tài)氮的利用水平顯著高于野生型。連續(xù)2年的大田試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn),在施用相同氮肥的條件下,T-DNA插入突變體的株高、有效分蘗數(shù)、千粒重的增加量均顯著高于野生型,OsTPP6的缺失增加了水稻對氮素的利用,具有提高NUE的潛力。

T6P可能是通過激活A(yù)DP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)的氧化還原活性來調(diào)節(jié)淀粉的合成[21],它是植物體內(nèi)一種重要的生長調(diào)節(jié)物質(zhì),在白天T6P通過調(diào)控PEP羧化酶翻譯后修飾影響光合同化物在蔗糖、有機(jī)質(zhì)和氨基酸之間的分配;而在夜晚調(diào)控葉片(源)中瞬時(shí)淀粉的降解,以及種子等(庫)中淀粉的合成、降解及轉(zhuǎn)運(yùn)以滿足植物生長對蔗糖的需求[28]。本研究發(fā)現(xiàn),OsTPP6T-DNA插入突變體籽粒胚乳呈粉質(zhì)、不透明狀,堊白增多。堊白的形成與淀粉的代謝異常有關(guān),通過分析淀粉代謝相關(guān)基因表達(dá)水平發(fā)現(xiàn),在T-DNA插入突變體中,OsAGPL、OsAGPS、OsGBSS、OsISA和OsGWD的表達(dá)均顯著上調(diào),表明OsTPP6的缺失導(dǎo)致淀粉代謝途徑相關(guān)基因的表達(dá)紊亂,淀粉代謝異常。同時(shí),直鏈淀粉含量和尿素膨脹體積的差異也表明淀粉代謝異常,導(dǎo)致水稻米粉的理化性質(zhì)出現(xiàn)了差異。OsTPP6的缺失影響了水稻籽粒中淀粉的正常代謝。

本研究通過對野生型和OsTPP6T-DNA插入突變體硝酸鹽15N吸收速率分析以及NRT家族表達(dá)水平的測定,發(fā)現(xiàn)OsTPP6負(fù)調(diào)控水稻對硝態(tài)氮的吸收。在不施硝酸鹽條件下OsTPP6T-DNA插入突變體表現(xiàn)出明顯生長缺陷的表型(株高變矮,地上部干重減少),而隨著硝酸鹽的加入,可以彌補(bǔ)OsTPP6缺失導(dǎo)致的生長缺陷表型,并且在高濃度硝酸鹽時(shí)生長狀態(tài)要優(yōu)于野生型的表型。而田間條件復(fù)雜,OsTPP6的缺失導(dǎo)致T6P的代謝紊亂,使OsTPP6T-DNA插入突變體的農(nóng)藝性狀都較野生型差。

綜上所述,OsTPP6作為一個(gè)海藻糖 6-磷酸磷酸酶,參與水稻硝態(tài)氮利用相關(guān)途徑和籽粒淀粉代謝相關(guān)途徑,對研究水稻高效利用氮素、籽粒品質(zhì)改良具有一定的應(yīng)用價(jià)值。