碳纖維超微電極負(fù)載金納米粒子高靈敏檢測木犀草素

施 敏，鮑昌昊，馬雯雯，程 寒，2*

（1.中南民族大學(xué) 藥學(xué)院，湖北 武漢 430074；2.中南民族大學(xué) 民族藥學(xué)國家級實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，湖北 武漢 430074）

木犀草素（Luteolin）是一類具有典型C6-C3-C6 結(jié)構(gòu)的天然黃酮類化合物，存在于金銀花、白毛夏枯、紫蘇葉、菊花、蓮花、芹菜、香菜、花生殼、胡蘿卜和石榴等植物材料中［1-4］。其主要藥理活性表現(xiàn)為抗菌、抗炎、抗過敏、抗癌、抗氧化、抗腫瘤［5-10］等方面，在臨床上廣泛應(yīng)用于止咳、祛痰、治療心血管系統(tǒng)、保護(hù)肝臟、促進(jìn)免疫調(diào)節(jié)和保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)［11］等。目前，木犀草素的測定方法主要有高效液相色譜法［12］、毛細(xì)管電泳法［13］及紫外分光光度法［14］等。上述方法可對木犀草素進(jìn)行含量測定，但普遍存在方法繁瑣、儀器昂貴、實(shí)驗(yàn)要求較高等問題。電化學(xué)分析法［15］具有靈敏度高、選擇性好、準(zhǔn)確度高、測量范圍廣、儀器設(shè)備簡單等特點(diǎn)，逐漸成為一種不可或缺的中藥有效成分測定的方法。

碳纖維超微電極（CFME）具有比表面積大、靈敏度高、制備成本低［16］等優(yōu)點(diǎn)，在神經(jīng)遞質(zhì)［17］、其他生物因子、金屬離子［18］、活細(xì)胞釋放H2O2［19］和生物活體檢測［20］等方面有著廣泛應(yīng)用?；瘜W(xué)修飾電極是當(dāng)前電化學(xué)和電分析化學(xué)領(lǐng)域非常活躍的研究熱點(diǎn)，在藥物分析領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。納米金為直徑1～100 nm 的微小金顆粒，其制備過程簡單，具有獨(dú)特的光電效應(yīng)，且具有比表面積大、生物相容性能優(yōu)良等特點(diǎn)［21］，其優(yōu)異的電導(dǎo)性和生物相容性能可提升CFME 電極表面的電子轉(zhuǎn)移速率，極大地改善了電極的電催化性能。楊莉莉等［22］制備了線狀納米金修飾碳纖維超微電極，用于蘆薈大黃素的電化學(xué)檢測，結(jié)果顯示修飾后的電極具有優(yōu)異的電催化活性，可用于實(shí)際樣品蘆薈汁中蘆薈大黃素的測定。

本研究采用化學(xué)還原法制備納米金顆粒，通過電沉積方法將納米金修飾在碳纖維超微電極上構(gòu)建電化學(xué)傳感器（AuNPs/CFME），建立了一種簡單、高效檢測木犀草素含量的新方法（如圖1），并成功應(yīng)用于實(shí)際樣品獨(dú)一味膠囊中木犀草素的含量測定。

圖1 基于AuNPs/CFME的木犀草素傳感器的檢測原理圖Fig.1 Principle of luteolin sensor based on AuNPs/CFME

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

XD-RFL 型倒置顯微鏡（寧波舜宇儀器有限公司）；CHI660D 型電化學(xué)工作站（上海辰華儀器有限公司）；SU8010 型場發(fā)射掃描電子顯微鏡（日本Hitachi）；TECNAI G2 F20 S-TWIN 型投射式電子顯微鏡（美國FEI 公司）；AR224CN 型分析天平（上海奧豪斯儀器有限公司）；雙電極系統(tǒng)（CFME 為工作電極，Ag/AgCl為參比電極）；PHS-3C型pH計（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）。

碳纖維（直徑5 μm，吉林市神舟碳纖維有限責(zé)任公司）；木犀草素（純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司）；氯金酸（AuCl3·HCl·4H2O，純度≥47.8%，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；檸檬酸三鈉、單寧酸、碳酸鉀、鐵氰化鉀、亞鐵氰化鉀（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；獨(dú)一味膠囊（康縣獨(dú)一味生物制藥有限公司）；AB 膠（廣東愛必達(dá)膠粘劑有限公司）；碳粉導(dǎo)電膠（自制）；PBS 緩沖溶液：Na2HPO4∶KH2PO4（6∶1）；以pH 1.0的PBS緩沖溶液為底液，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 AuNPs 及AuNPs/CFME 的制備AuNPs 的制備參考文獻(xiàn)［23］。將40 mL 水加熱至沸騰，邊攪拌邊加入500 μL 1%的氯金酸（HAuCl4）溶液。隨后快速加入900 μL 1%的檸檬酸三鈉（C6H5Na3O7）溶液，繼續(xù)加熱20 min，直至溶液呈酒紅色，冷卻至室溫，于4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

取10 mL AuNPs 溶膠置于50 mL 小燒杯中，將Ag/AgCl 參比電極與潔凈的CFME 置于AuNPs 溶膠中，采用恒電位電流-時間法，在1.5 V電位下進(jìn)行電沉積，即在CFME表面構(gòu)建納米金修飾層，制得AuNPs/CFME。

1.2.2 電化學(xué)測定電化學(xué)檢測均在CHI660D 型電化學(xué)工作站上進(jìn)行，采用雙電極體系：以AuNPs/CFME 為工作電極，Ag/AgCl 為參比電極。循環(huán)伏安法（CV）實(shí)驗(yàn)參數(shù)為：電位掃描范圍為-0.2～0.9 V；掃描速度0.1 V/s；采樣間隔0.01 V；靜置時間2 s。差分脈沖伏安法（DPV）實(shí)驗(yàn)參數(shù)為：電位掃描范圍為-0.2～0.6 V；振幅0.05 V；脈沖寬度0.05 s；脈沖時間0.2 s；靜置時間20 s。整個實(shí)驗(yàn)過程均在室溫下進(jìn)行。

1.2.3 樣品預(yù)處理將獨(dú)一味膠囊的外殼去除，取其內(nèi)容物置于缽體中，研磨成細(xì)粉后，精密稱取5.00 g 藥粉，用50 mL 無水乙醇溶解后，超聲振蕩1 h，過濾后取上層清液制得樣品溶液，于4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2 結(jié)果與討論

2.1 AuNPs/CFME的制備及表征

圖2A 是制備的AuNPs 的TEM 圖，圖中可見AuNPs 粒子大小均勻，其平均粒徑約為13 nm。圖2B為AuNPs 溶膠的紫外-可見吸收光譜圖，在520 nm 處出現(xiàn)1 個特征吸收峰，為AuNPs 的特征吸收峰［24］，表明AuNPs 制備成功。圖2C、D 分別為CFME、AuNPs/CFME 的SEM 圖。由圖可知，未修飾的CFME 表面光滑平整，經(jīng)AuNPs 修飾后的電極表面吸附大量球狀納米顆粒，電極直徑略有增加，比表面積增大，表明CFME表面已成功鍵合AuNPs。

圖2 AuNPs的透射電鏡圖（A）、AuNPs溶膠的紫外-可見吸收光譜圖（B），以及CFME（C）和AuNPs/CFME（D）的掃描電鏡圖Fig.2 TEM image of gold nanoparticles（A），UV-Vis absorption spectrum of gold nanosol（B），SEM images of CFME（C）and AuNPs/CFME（D）

圖3A 為0.01 Hz～100 kHz 頻率范圍內(nèi)，CFME 和AuNPs/CFME 在含0.1 mol/L KCl 的5 mmol/L［Fe（CN）6］3-/［Fe（CN）6］4-溶液中的電化學(xué)阻抗譜（EIS），由圖可知，CFME 的轉(zhuǎn)移阻抗值（Rct）較大，為3.378×105Ω，AuNPs/CFME 修飾電極的Rct 小于CFME，為3.601×104Ω。表明AuNPs 已成功修飾在電極表面，AuNPs 降低了CFME 的界面阻抗值，主要原因可能是納米金粒子的納米效應(yīng)及表面原子的空位效應(yīng)使其具有良好的電催化活性，從而提高了電極表面的電子轉(zhuǎn)移速率。采用DPV法于1 μmol/L木犀草素溶液中考察了修飾電極的電化學(xué)行為（圖3B），曲線a為CFME在1 μmol/L PBS（pH 7.0）溶液中的DPV 曲線，曲線b和c分別為CFME 和AuNPs/CFME 在1 μmol/L 木犀草素溶液中的DPV 曲線。從圖中可以看出，木犀草素在CFME 表面于0.1 V左右出現(xiàn)1個氧化還原峰，峰電流值為1.948 nA，經(jīng)AuNPs修飾后，木犀草素的氧化峰電位略有正移，且峰電流值增至4.519 nA，約為CFME 電化學(xué)響應(yīng)的2.3倍，表明AuNPs對木犀草素的氧化具有明顯的催化作用。

圖3 CFME和AuNPs/CFME在含0.1 mol/L KCl的5 mmol/L［Fe（CN）6］3-/［Fe（CN）6］4-溶液中的電化學(xué)阻抗譜（A）；CFME在1 μmol/L PBS（pH 7.0）緩沖溶液中的DPV曲線（a），以及CFME（b）和AuNPs/CFME（c）在1 μmol/L木犀草素溶液中的DPV曲線（B）Fig.3 Nyquist diagrams of CFME，AuNPs/CFME in 5 mmol/L［Fe（CN）6］3-/［Fe（CN）6］4-containing 0.1 mol/L KCl（A）；DPV curve of CFME in 1 μmol/L PBS（pH 7.0）buffer solution（a），DPV curves of CFME（b）and AuNPs/CFME（c）in 1 μmol/L luteolin（B）

2.2 AuNPs/CFME電化學(xué)沉積時間的優(yōu)化

采用恒電位時間-電流曲線法，保持初始電位為1.5 V，將潔凈的CFME 置于10 mL AuNPs 溶膠中依次電沉積10、20、30、40、50 min（n=3）。結(jié)果顯示，在1 μmol/L 木犀草素溶液中，當(dāng)AuNPs 的電沉積時間為30 min 時修飾電極的氧化峰電流達(dá)到最大，超過30 min 后，氧化峰電流略有下降?？赡苁怯捎陔S著電沉積時間的增加，AuNPs 在碳纖維電極表面不斷聚集，而時間過長則會導(dǎo)致電極表面修飾層脫落，從而降低其電催化活性。因此本實(shí)驗(yàn)選擇最佳AuNPs電沉積時間為30 min。

2.3 掃速和pH值對氧化峰電流的影響

為闡明木犀草素在AuNPs/CFME 電極上的反應(yīng)機(jī)理，以PBS 緩沖液（pH 7.0）為介質(zhì)，考察了1 μmol/L 木犀草素在不同掃速（10、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500 mV/s）下的循環(huán)伏安圖。如圖4A所示，木犀草素的氧化還原峰電流隨掃速的增加而增加，且氧化峰電位隨掃速的增加逐漸正移，還原峰電位逐漸負(fù)移，峰電位差逐漸增大，表明木犀草素在修飾電極表面的氧化還原反應(yīng)是一個準(zhǔn)可逆過程，且可逆性隨掃速的增加逐漸變差。從圖4B 可以看出，在10～500 mV/s 范圍內(nèi)，木犀草素的氧化還原峰電流（Ip）與掃描速率（v，mV/s）成正比，其線性回歸方程為：Ipa（nA）=-0.174 3-0.009 1v（mV/s），r2=0.997 3；Ipc（nA）=0.121 9+0.006 8v（mV/s），r2=0.999 3。結(jié)果表明，木犀草素在AuNPs/CFME 電極上的氧化還原反應(yīng)是吸附控制過程［25］。研究了峰值電流對數(shù)（logIp）與掃描速率對數(shù)（logv）之間的線性關(guān)系，得到線性方程為：logIp（nA）=-1.732+1.385 3 logv（mV/s），r2=0.992 6，斜率值為1.385 3，接近吸附控制的理論值1.0［26］。此外，考察了陽極（Epa）和陰極（Epc）峰值電位和掃描速率對數(shù)logv（mV/s）之間的線性關(guān)系，得到線性方程分別為：Epc（mV）= 195.7 × 10-3+50.858 × 10-3logv，r2= 0.996 0；Epa（mV）= 385.19 × 10-3-56.653 × 10-3logv，r2= 0.994 7。根據(jù)Laviron′s equation［27-28］，電子轉(zhuǎn)移系數(shù)（α）、電子轉(zhuǎn)移數(shù)（n）可通過下列方程計算：

圖4 AuNPs/CFME在1 μmol/L木犀草素溶液中于不同掃速下的CV圖（A），木犀草素的氧化還原峰電流與掃速的線性關(guān)系圖（B）Fig.4 Cyclic voltammograms of 1 μmol/L luteolin with AuNPs/CFME at different scan rate（A）；plot of the anodic and cathodic peak currents of luteolin versus the scan rate（B）

其中Eθ′、R、F 和T分別代表形式氧化還原電勢、理想氣體常數(shù)（8.314 J·mol-1·K-1）、法拉第常數(shù)（96 485 C·mol-1）、熱力學(xué)溫度（298 K）。根據(jù)上述方程可計算出α/（1-α）為0.9，接近于1，α和n的值分別為0.47和2.22，n值接近于2，表明木犀草素的電化學(xué)氧化過程有2個電子參與，與文獻(xiàn)報道的結(jié)果一致［29］?？紤]到掃速過快會使充電電流變大，從而使基線噪音增加，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)均在100 mV/s 掃速下進(jìn)行。

采用不同pH 值的PBS 溶液配制1 μmol/L 木犀草素溶液，在pH 1.0～8.0 范圍內(nèi)考察pH 值對AuNPs/CFME 電極響應(yīng)的影響。結(jié)果表明，pH 為1.0 時木犀草素的氧化還原峰值電流最大，因此選擇pH 1.0 的緩沖體系用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。由于質(zhì)子參與了木犀草素的電極反應(yīng)過程，隨著pH 值的增加，氧化峰電位負(fù)移，表明木犀草素的氧化是脫質(zhì)子反應(yīng)。木犀草素的氧化峰電位（Ep）與pH 值呈線性關(guān)系，線性回歸方程為Ep（mV）= 522.11-58.29pH，r2= 0.994 8?；貧w方程斜率與能斯特方程計算的理論值-59.2 mV/pH 接近，表明參與電極反應(yīng)的電子數(shù)和質(zhì)子數(shù)之比為1∶1，考慮到木犀草素的電子數(shù)n為2，因此木犀草素在AuNPs/CFME 上的電化學(xué)反應(yīng)是雙質(zhì)子雙電子準(zhǔn)可逆過程［30］。

結(jié)合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，木犀草素在AuNPs/CFME 上氧化還原反應(yīng)的可能機(jī)理如圖5 所示，即木犀草素苯環(huán)上的3′，4′-二羥基取代基被迅速氧化成鄰苯醌基團(tuán)，與文獻(xiàn)報道相符［31］。

圖5 木犀草素的氧化機(jī)理Fig.5 Mechanism of the oxidation of luteolin

2.4 AuNPs/CFME檢測木犀草素的線性關(guān)系與檢出限

最佳實(shí)驗(yàn)條件下，pH 為1.0 的PBS 緩沖溶液中不同濃度木犀草素的DPV 曲線如圖6A 所示，其線性關(guān)系如圖6B～C所示。結(jié)果表明，當(dāng)木犀草素的濃度在0.01～10 μmol/L范圍時，峰電流隨木犀草素濃度的增加而增加，且在0.01～0.10 μmol/L 和0.10～10 μmol/L 兩個范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程分別為：Ip（nA）= 0.990 1c（μmol/L）+ 1.610 5，r2= 0.994 4；Ip（nA）= 0.135 4c（μmol/L）+1.748 8，r2=0.995 1。檢出限（LOD，S/N=3）為1.58 nmol/L。

圖6 不同濃度木犀草素的DPV曲線（A），0.10～10 μmol/L（B）與0.01～0.10 μmol/L（C）范圍內(nèi)木犀草素的氧化峰電流與濃度的線性關(guān)系曲線Fig.6 DPV curves at AuNPs/CFME in the solution of luteolin（A），linear relationship between oxidation peak current and concentration of luteolin in the range of 0.10-10 μmol/L（B）and 0.01-0.10 μmol/L（C）concentration of luteolin（curve a-t）：0.01，0.02，0.04，0.06，0.08，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0 μmol/L

比較了AuNPs/CFME 與其他電化學(xué)傳感器對木犀草素檢測的線性范圍和檢出限，結(jié)果如表1所示，AuNPs/CFME具有較低的檢出限和較寬的線性范圍。

表1 不同修飾電極測定木犀草素的電化學(xué)性能比較Table 1 Comparison of the analytical performance of different modified electrodes for the determination of luteolin

2.5 干擾性與穩(wěn)定性

為了將AuNPs/CFME 應(yīng)用于實(shí)際樣品測定，考察了檢測中可能存在的各種干擾物質(zhì)的影響。在10 000 倍濃度的Na+、K+、Cl-和1 000 倍SO42-存在的情況下，測定AuNPs/CFME 在1 μmol/L 木犀草素中的DPV 響應(yīng)。結(jié)果顯示，Na+、K+、Cl-、SO42-的加入對木犀草素的檢測無明顯干擾（偏差＜5.0%），表明AuNPs/CFME 對木犀草素的測定具有良好的選擇性。采用新制的AuNPs/CFME 修飾電極連續(xù)10 次在1 μmol/L 木犀草素溶液中進(jìn)行差分脈沖掃描，木犀草素的電化學(xué)響應(yīng)降低＜5.0%。將修飾電極置于空氣中，連續(xù)10 d 進(jìn)行相同實(shí)驗(yàn)，木犀草素的氧化峰電流衰減較小，其氧化峰電流的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）降低＜5.0%，表明AuNPs/CFME修飾電極的電化學(xué)性能非常穩(wěn)定。

2.6 實(shí)際樣品分析

取10 μL獨(dú)一味樣品溶液，用pH 1.0的PBS緩沖溶液稀釋至10 mL，并向樣品溶液中添加一系列已知不同濃度的木犀草素標(biāo)樣進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。如表2所示，木犀草素的回收率為96.0%～104%，5次平行測定的RSD 均小于5.0%，表明該方法制備的AuNPs/CFME 修飾電極可用于實(shí)際樣品獨(dú)一味膠囊中木犀草素的檢測。

表2 獨(dú)一味膠囊中木犀草素的含量測定Table 2 Determination of luteolin in Kudo capsule samples

3 結(jié) 論

本文將納米金修飾在碳纖維超微電極表面構(gòu)建了AuNPs/CFME，用于木犀草素的檢測。在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，木犀草素的線性范圍為0.01～0.10 μmol/L 和0.10～10 μmol/L，檢出限為1.58 nmol/L，將其用于獨(dú)一味膠囊中木犀草素含量的測定，回收率為96.0%～104%。該傳感器靈敏度高、選擇性好、準(zhǔn)確度高、線性范圍寬，為木犀草素在醫(yī)藥、食品等工業(yè)中的開發(fā)利用和深入研究提供了理論依據(jù)。