基于超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱質譜的結直腸腺瘤患者血清代謝組學研究

楊 寶，梁運嘯，黃宗聲，涂 星，周昌園，胡澤華，文德鑒，張淇淞

（1.湖北民族大學 醫(yī)學部，湖北 恩施 445000；2.廣西大學 醫(yī)學院，廣西 南寧 530004；3.廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院 消化內科，廣西 南寧 530021；4.湖北民族大學 化學與環(huán)境工程學院，湖北 恩施 445000；5.湖北民族大學 武陵山中藥材檢驗檢測中心，湖北 恩施 445000）

結直腸癌是一種常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，是癌癥導致死亡的第二大原因［1］。隨著生活水平的提高和飲食習慣的改變，結直腸癌在我國的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢，且較多患者在確診時已處于中晚期，錯過了最佳的治療時間［1］。結直腸癌主要由“腺瘤-癌”途徑發(fā)展而來［2］。結直腸腺瘤發(fā)展成結直腸癌一般需要較長時間，大多數(shù)結直腸腺瘤的治愈率較高且預后良好［2］。因此，篩查結直腸腺瘤是降低結直腸癌死亡率的有效途徑。目前臨床上常用的“金標準”是結腸鏡檢，雖然準確度高，但患者對這種侵入性檢查的依從性差，且早期診斷較為困難，限制了其在篩查中的廣泛應用。相比較而言，單次采血檢測腫瘤標志物具有簡便和依從性好的優(yōu)勢，尤其是目前多種高靈敏度檢測技術的出現(xiàn)，促進了血液腫瘤標志物在早期篩查中的廣泛應用。

檢測內源性代謝物的水平能夠快速和準確地反映機體的狀態(tài)，目前已證實了腫瘤與機體異常代謝密切相關［3］。代謝組學是從整體和多角度研究機體的內源性代謝變化，闡明疾病發(fā)生發(fā)展過程的一種高通量技術［3-6］。代謝組學在腫瘤早期篩查中表現(xiàn)出巨大潛力，是近年來的研究熱點?；诖x組學的結直腸腺瘤篩查及診斷具有取樣簡單、非侵入性、依從性好、靈敏度高的特點，非常適合大規(guī)模應用［4，7］。目前，國內外學者主要集中于結直腸癌的代謝標志物研究，而對于結直腸腺瘤的研究比較少［8-10］。本課題組前期從代謝組學方法學角度報道了17 例結直腸腺瘤病人的血清內源性代謝特征［11］，但存在病例數(shù)少、代謝物檢測不全面的問題，尚不能較為全面地表征結直腸腺瘤患者的內源性代謝特征?；诖?，本文在擴大樣本量的基礎上，采用更高靈敏度的超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱質譜（UHPLC-Q Exactive-Orbitrap HRMS）較為全面地檢測了結直腸腺瘤患者的血清內源性代謝物，并采用多元統(tǒng)計方法篩選腫瘤標志物，以期為其早期篩查提供參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

UltiMate 3000 超高效液相色譜儀和四極桿-靜電場軌道阱質譜（美國賽默飛世爾科技公司）；高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗儀器有限公司）；密理博超純水系統(tǒng)（美國密理博公司）；乙腈（色譜純，德國默克集團有限公司）；甲酸（質譜純，美國賽默飛世爾科技有限公司）；D4-脫氧膽酸、他莫昔芬（美國Sigma-Aldrich公司）。

1.2 樣本來源及處理

46例結直腸腺瘤患者（年齡57.8±10.7歲）和45例健康人（年齡54.4±8.2歲）血清樣本收集于廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院，并經廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會批準（倫理號KY-DZX-202008），所有患者均簽署知情同意書。

吸取50 μL室溫下解凍的血清樣品，加入200 μL預冷卻的乙腈，渦旋3 min后于4 ℃下以13 000 r/min離心10 min，吸取全部上清液并真空干燥。用100 μL 75%乙腈-水（含0.5 μmol/L D4-脫氧膽酸和他莫昔芬）復溶，渦旋3 min 后于4 ℃下以13 000 r/min 離心20 min，吸取全部上清液用于血清代謝組學分析。各待測樣品吸取5 μL上清液混勻后作為質控樣本。

1.3 色譜與質譜條件

色譜條件：Waters Acquity UPLC HSS T3 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相：正離子模式為0.1%甲酸乙腈（A）-0.1%甲酸水（B），負離子模式為0.01%甲酸乙腈（A）-0.01%甲酸水（B）。洗脫程序為：0.0～2.0 min，2% A；2.0～13.0 min，2%～100% A；13.0～18.0 min，100% A；18.0～20.0 min，100%～2%A。柱溫為40 ℃，流速為0.4 mL/min；進樣量為5 μL。

質譜條件：電噴霧離子源，輔助氣流速為10 μL/min，鞘氣流速為40 μL/min，離子傳輸管溫度為320 ℃，霧化溫度為400 ℃，噴霧電壓為3.50 kV（正離子）或2.80 kV（負離子）；數(shù)據采集模式為full scan+ddms2，一級掃描范圍為m/z100～1 200，一級和二級質譜的分辨率分別為70 000和17 500。

1.4 質譜數(shù)據處理及代謝組學分析

采用Compound Discovery 3.1軟件對質譜數(shù)據進行峰對齊和歸一化處理，得到質荷比、保留時間和峰強度配對的數(shù)據文件。將數(shù)據文件導入Simca-P 14.0軟件中進行主成分分析（PCA），基于質控樣本聚合情況考察儀器方法的穩(wěn)定性，以及樣品的分布趨勢和異常點；隨后進行正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA），采用200 次置換檢驗考察模型的可靠性和適用性，以變量權重投影值（VIP）大于1.50、火山圖中變化倍數(shù)小于0.67或大于1.50且p＜0.05為標準篩選生物標志物。根據精確分子量、自帶數(shù)據庫（mzCloud）、HMDB 數(shù)據庫（https：//hmdb.ca/）鑒定生物標志物。采用MetaboAnalyst 軟件富集代謝通路，應用受試者工作特征曲線（ROC）對生物標志物進行最終篩選與評價。

2 結果與討論

2.1 血清的典型總離子流圖

在前期研究［11］基礎上，本實驗采用上述方法分析了健康對照和結直腸腺瘤患者的血清樣品，典型總離子流圖見圖1，可見分離度及響應較好。兩組的總離子流圖存在一定差別，推測在兩組中部分血清代謝產物的濃度存在差異。提取健康對照組、結直腸腺瘤組、質控組中D4-脫氧膽酸和他莫昔芬的保留時間和峰面積，計算相對標準偏差（RSD）分別小于3.0%和10%，表明整個測試過程中儀器的穩(wěn)定性良好。

圖1 健康對照組（A、C）和結直腸腺瘤組（B、D）血清樣品的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatograms of serum samples from healthy control（A，C）and colorectal adenoma（B，D）A and B：in positive ion mode；C and D：in negative ion mode

2.2 數(shù)據分析

2.2.1 主成分分析 對健康對照組（NG）、結直腸腺瘤組（CAG）、質控組（QC）在正、負離子模式下進行PCA 分析，并考察儀器方法的穩(wěn)定性和樣品的分布趨勢。由圖2A 和2B 可知，質控樣本的聚合情況良好，說明儀器方法的穩(wěn)定性良好，測試數(shù)據準確可靠，滿足進一步分析的要求。NG 和CAG 組分別位于得分圖兩側，區(qū)分較為明顯且無異常點，說明健康對照組和結直腸腺瘤組的血清代謝譜有顯著差異。

圖2 健康對照組（NG）、結直腸腺瘤組（CAG）、質控組（QC）的PCA得分圖（A、B），健康對照組和結直腸腺瘤組在正、負離子模式下的OPLS-DA得分圖（C、D）及置換檢驗圖（E、F）Fig.2 PCA score plots（A，B）for the NG，CAG and QC groups，OPLS-DA score plots（C，D）and corresponding permutation tests（E，F(xiàn)）between the NG and CAG groups A，C and E：in positive ion mode；B，D and F：in negative ion mode

2.2.2 正交偏最小二乘判別分析在PCA分析的基礎上對NG組和CAG組進行OPLS-DA分析，篩選生物標志物。OPLS-DA 得分圖見圖2C 和2D，NG 組和CAG 組的血清代謝譜差異顯著。正離子模式OPLS-DA 模型的R2X、R2Y、Q2 值分別為0.62、0.93、0.83；負離子模式的R2X、R2Y、Q2 值分別為0.55、0.94、0.81，說明所建立模型的數(shù)據描述和預測能力良好。正離子模式200 次置換檢驗（圖2E）R2和Q2的截距分別為0.50和-0.55，負離子模式（圖2F）的分別為0.63和-0.63，且200次置換檢驗的R2和Q2值均小于原始值，提示所建立模型的預測能力較好且未過擬合。

2.2.3 生物標志物的篩選與鑒定根據兩組間變化倍數(shù)和t檢驗統(tǒng)計值，制作上述標準化質譜數(shù)據的火山圖（圖3），篩選出變化倍數(shù)小于0.67 或大于1.50，且p＜0.05 的代謝物。在火山圖分析的基礎上結合VIP值大于1.50確定生物標志物，根據精確分子量、自帶數(shù)據庫、HMDB 數(shù)據庫鑒定出20個生物標志物，結果見表1。以正離子模式m/z132.076 7（tR= 0.69 min）和負離子模式m/z327.232 3（tR=13.22 min）為例說明生物標志物的鑒定過程（圖4），質譜圖中橫線上側為實測值，下側為儀器自帶數(shù)據庫理論值，兩者完全一致，2 個生物標志物分別確定為肌酸和二十二碳六烯酸，與標準品的質譜分析結果一致。其他生物標志物采用同法鑒定。生物標志物在2組中相對豐度的熱圖見圖5A。

圖3 健康對照組和結直腸腺瘤組在正（A）和負（B）離子模式下的火山圖Fig.3 Volcano plots of NG and CAG groups in positive（A）and negative（B）modesthe red，blue and gray dots represent that the metabolites are significantly up-regulated，significantly down-regulated，and not significantly changed in CAG group，respectively

表1 結直腸腺瘤患者的血清生物標志物及ROC分析結果Table 1 Biomarkers identified from patients with colorectal adenoma and the corresponding ROC analysis results

2.3 代謝通路富集及生物標志物分析

采用MetaboAnalyst 4.0 軟件富集代謝通路，以影響值大于0.1 為標準確定與結直腸腺瘤相關度最高的代謝通路（見圖5B）。結果顯示，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸合成，花生四烯酸代謝、α-亞麻酸代謝、亞油酸代謝、氨酰-tRNA 合成、鞘脂代謝、甘油磷脂代謝以及色氨酸代謝對結直腸腺瘤的影響較大。

圖5 健康對照組和結直腸腺瘤組中生物標志物的相對豐度熱圖（A）與代謝通路分析圖（B）Fig.5 Heat map of 2 groups to visualize the abundance of biomarkers（A）and summary of pathway analysis（B）a：valine，leucine and isoleucine biosynthesis（纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸合成）；b：arachidonic acid metabolism（花生四烯酸代謝）；c：α-linolenic acid metabolism（α-亞麻酸代謝）；d：linoleic acid metabolism（亞油酸代謝）；e：aminoacyl-tRNA biosynthesis（氨酰-tRNA合成）；f：sphingolipid metabolism（鞘脂代謝）；g：glycerophospholipid metabolism（甘油磷脂代謝）；h：tryptophan metabolism（色氨酸代謝）

正常和腫瘤細胞均需要大量的必須氨基酸維持基本生命活動，必需氨基酸不僅是合成核酸、蛋白質、脂質等生物大分子的原料，還是激活哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路的信號分子，而mTOR通路的異常激活與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉移密切相關［12］。另外，能量代謝異常是腫瘤細胞最顯著的特征之一，腫瘤細胞在快速增殖過程中需要大量的氨基酸來提供氮源和碳源維持其異常的能量代謝［12-13］。在本實驗中，結直腸腺瘤組血清中蘇氨酸、纈氨酸、亮氨酸、色氨酸的水平較健康對照組顯著降低，提示腫瘤細胞正處在快速增殖過程中，需要吸收大量的必須氨基酸維持其異常的能量代謝。大量臨床實驗證實了n-3 多不飽和脂肪酸在促進機體健康和治療部分疾病方面的特殊功效，與腫瘤細胞的增殖和凋亡以及緩解炎癥反應密切相關，且在癌癥患者中的水平顯著低于健康人［14］。相關研究報道，經常食用富含n-3 多不飽和脂肪酸食物的人群發(fā)生結直腸癌的概率明顯降低［15］。在本實驗中，結直腸腺瘤組血清中二十二碳六烯酸和α-亞麻酸的水平較健康對照組顯著降低，與文獻報道基本一致。鞘脂是真核細胞膜的主要成分，且能代謝產生多種重要的信號分子，參與細胞生長、分化、凋亡等生理活動。1-磷酸鞘氨醇是由磷酸化的鞘氨醇激酶催化鞘氨醇合成得到，其通過調控炎癥反應與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關［16-17］。在本實驗中結直腸腺瘤組血清中鞘氨醇的水平顯著降低，1-磷酸鞘氨醇的水平顯著升高，提示結直腸腺瘤患者自身大量合成了1-磷酸鞘氨醇，并可能通過調控炎癥反應緩解結直腸腺瘤的發(fā)展。磷脂是細胞膜結構的重要組成部分，LysoPC（20∶3）和PC（36∶4）在結直腸腺瘤組血清中的水平較健康對照組顯著降低，可能是由于腫瘤細胞正處在快速增殖過程中。膽汁酸的種類和水平與結直腸癌密切相關，部分膽汁酸可能通過誘導DNA 和蛋白質損傷以及粘膜細胞增殖和炎癥導致結直腸癌的發(fā)生［18］。一項569 例結直腸癌病例的前瞻性研究表明，膽酸、甘氨鵝脫氧膽酸、牛磺鵝脫氧膽酸的水平與結直腸癌的發(fā)病率顯著正相關［18］，本實驗中結直腸腺瘤組血清中上述3 種膽汁酸的水平顯著升高，與文獻報道基本一致。

本實驗還采用ROC曲線法考察了生物標志物對結直腸腺瘤的診斷效能（表1），結果表明16-羥基棕櫚酸、花生四烯酸、肌酸、纈氨酸、亮氨酸、色氨酸、α-亞麻酸、?；蛆Z脫氧膽酸、LysoPC（20∶3）的特異性與靈敏度較高，其ROC 曲線面積（AUC）均大于0.90，對于結直腸腺瘤篩查具有較高的診斷價值，但后期還需采用臨床大樣本的靶向代謝組學方法進行驗證。

3 結 論

篩查結直腸腺瘤是降低結直腸癌發(fā)病率和死亡率的有效途徑，代謝組學技術在腫瘤早期篩查中表現(xiàn)出巨大潛力。本文利用UHPLC-Q Exactive-Orbitrap HRMS 技術的高通量、高分辨率優(yōu)勢，結合多元統(tǒng)計分析從結直腸腺瘤患者血清中篩選了20 個生物標志物，包括必須氨基酸、不飽和脂肪酸、鞘脂、膽汁酸等。經過ROC 分析，篩選16-羥基棕櫚酸、花生四烯酸、肌酸、纈氨酸、亮氨酸、色氨酸、α-亞麻酸、牛磺鵝脫氧膽酸、LysoPC（20∶3）作為區(qū)分結直腸腺瘤患者和健康人的生物標志物。本實驗為深入研究結直腸腺瘤的代謝特征提供了基礎數(shù)據，對于結直腸腺瘤的臨床篩查具有較高的參考意義。