大鼠膈神經(jīng)移位修復前肢神經(jīng)叢下干后股△

黎 立，艾爾肯·熱合木吐拉，司 裕，周泓宇

（新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院骨三科，新疆烏魯木齊 830001）

臂叢神經(jīng)損傷是嚴重的、致殘率極高的神經(jīng)損傷，手的各項功能均喪失，目前治療方案有神經(jīng)移位術(shù)，神經(jīng)移位術(shù)后患者肩、肘功能恢復良好，手指屈曲活動也可部分恢復，但伸指活動恢復欠佳，分析原因可能是以往神經(jīng)移位將動力神經(jīng)移位至橈神經(jīng)主干，導致多數(shù)動力神經(jīng)錯配到感覺神經(jīng)或橈神經(jīng)伸肘伸腕肌支，作者考慮伸指功能來源與橈神經(jīng)深支-橈神經(jīng)-下干后股-C8T1節(jié)段脊髓，既往有研究嘗試將動力神經(jīng)移位至下干后股來恢復伸指功能，文獻報道該方法恢復伸指功能的結(jié)果不確定，即膈神經(jīng)移位下干后股不只恢復伸指功能也恢復伸肘功能，且伸肘功能恢復較理想［1］。其次既往膈神經(jīng)作為動力神經(jīng)修復臂叢神經(jīng)廣泛運用［2～5］，但也有研究表明膈神經(jīng)移位可導致膈肌麻痹并降低吸氣肌力，尤其是在老年人［6］，目前膈神經(jīng)功能越來越引起重視，在高位截癱導致的膈肌麻痹后使用臂叢神經(jīng)、迷走神經(jīng)、副神經(jīng)移位修復膈神經(jīng)也得到良好呼吸功能［7］，甚至也有膈神經(jīng)移位修復臂叢神經(jīng)后再通過肋間神經(jīng)修復膈神經(jīng)的相關(guān)研究［8］。對于有限的供體神經(jīng)來說端側(cè)移位無疑是最佳選擇，在一項獼猴的動物實驗中，修復高位損傷尺神經(jīng)同時用橈淺神經(jīng)端側(cè)移位修復腕部尺神經(jīng)，有效防止獼猴手內(nèi)在肌萎縮［9］。所以本研究設(shè)計動物試驗將膈神經(jīng)作為動力神經(jīng)通過端端及端側(cè)兩種方法選擇性移位至下干后股以驗證定向修復伸指功能，同時端側(cè)吻合避免膈神經(jīng)動力喪失，并且通過神經(jīng)示蹤技術(shù)觀察相應(yīng)脊髓節(jié)段陽性細胞數(shù)量，進一步明確移位有效性及斷端、端側(cè)修復優(yōu)劣性，同時對其安全性進行評估。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑材料

實驗動物：SD大鼠24只（體重200～220 g），實驗動物麻醉劑：1%戊巴比妥鈉溶液（0.5 ml/100 g），碘酊消毒液，75%酒精，逆向示蹤劑：熒光金，Prolene縫合線12-0，普通縫合絲線。

1.2 動物分組與處理

取 SD大鼠 24只（體重 200～220 g），分為四組，每組6只：分別為端側(cè)吻組、端端吻合組、原位吻合組及未修復組（圖1）。

圖1 四組動物手術(shù)處理示意圖 1a:端側(cè)吻合組 1b:端端吻合組 1c:原位吻合組 1d:未修復組

用1%戊巴比妥鈉溶液（0.5 ml/100 g）腹腔麻醉。仰臥位固定，碘酊消毒右頸部、胸部2次，酒精脫碘。取頸至胸部L形切口長約4 cm，鎖骨上探查找到膈神經(jīng)并標記備用。再在鎖骨下探查找到下干后股備用。取下肢內(nèi)側(cè)長約4 cm縱向切口，根據(jù)移植需要切取3 cm隱神經(jīng)備用。

端側(cè)吻合組：鎖骨上根部切斷C7/8、T1神經(jīng)根，將近斷端埋入斜角肌內(nèi)，在鎖骨下切口切斷的下干后股近端埋入附近肌肉內(nèi)，鎖骨上膈神經(jīng)與隱神經(jīng)移植物端側(cè)縫合，隱神移植物經(jīng)環(huán)繞膈神經(jīng)2圈再用12-0 Prolene線縫合固定，遠端與下干后股端端縫合。

端端吻合組：將鎖骨上膈神經(jīng)與隱神經(jīng)移植物端端縫合，遠端與下干后股端端縫合。

原位吻合組：在鎖骨下切口切斷下干后股，直接端端縫合修復。

未修復組：在鎖骨下切口切斷下干后股，不予以修復，斷端埋入肌肉組織內(nèi)。

沖洗后對皮縫合傷口，術(shù)后傷口涂苦味酸，防止互相舔傷口或撕咬。所有大鼠術(shù)前、術(shù)后均飼養(yǎng)在動物實驗室，術(shù)后第7周予以熒光示蹤及電生理檢查，第8周灌注取材。

1.3 評價指標

1.3.1 大體功能觀察

觀察各組大鼠存活情況，行走步態(tài)，前肢活動情況，呼吸運動變化情況，肢體感覺異常導致的潰瘍等。同時動態(tài)觀察修復后肢體功能恢復情況以及恢復時間。

1.3.2 神經(jīng)電生理檢測

在取材前1周行電生理檢查，大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉（1%，0.5 ml/100 g）麻醉，仰臥位固定至鼠板上。用Medtronic肌電誘發(fā)電位儀檢測趾總伸肌、膈肌的復合肌肉動作電位（compound muscle action potential,CMAP）的潛伏期和最大波幅。檢測中充分暴露大鼠雙側(cè)的膈神經(jīng)、臂叢下干、趾總伸肌、膈肌。將膈神經(jīng)（端側(cè)吻合組、端端吻合組）和臂叢下干（原位吻合組、未修復組）與周圍組織游離，用刺激電極挑起，再將接收電極分別插入趾總伸肌和膈?。p側(cè)的刺激電極和接收電極放置的部位相同），分別記錄趾總伸肌和膈肌CMAP的潛伏期和最大波幅。

1.3.3 神經(jīng)示蹤檢查

完成神經(jīng)電生理檢測后，顯露大鼠端側(cè)吻合組、端端吻合組右側(cè)肘部橈神經(jīng)深支、左側(cè)鎖骨下下干后股，原位吻合組、未修復組雙側(cè)橈神經(jīng)深支，在此適當游離后切斷備用。在微量器皿中加入2%熒光金混懸液，將已切斷的神經(jīng)近端浸泡于微量器皿中的熒光金混懸液30 min后生理鹽水沖洗，對皮并4-0縫線縫合關(guān)閉傷口。術(shù)區(qū)涂苦味酸防止相互舔傷口或撕咬。

1周后再次行腹腔麻醉后用4℃4%多聚甲醛溶液繼續(xù)灌注固定。切取C3～T1脊髓節(jié)段。標本放入4%的多聚甲醛溶液中后固定2 h后，依次轉(zhuǎn)入4℃10%、20%、30%蔗糖溶液中過夜梯度脫水，包埋，在冰凍切片機內(nèi)（-24℃）以20 μm厚度連續(xù)切片，在0.01 M磷酸緩沖液中漂片貼片，吸取周圍多余液體，轉(zhuǎn)熒光顯微鏡下觀察、抓圖后封片。

將連續(xù)切片置于Leica熒光顯微鏡（激發(fā)波長330～380 nm）下在放大40倍視野下觀察切片，脊髓前角外側(cè)核內(nèi)熒光金逆向染色的神經(jīng)元，熒光金呈黃色或黃白色，神經(jīng)元胞漿內(nèi)發(fā)光。使用配套的Leica QWin軟件進行圖像采集分析。根據(jù)每張切片內(nèi)神經(jīng)元數(shù)量及切片量計數(shù)脊髓節(jié)段神經(jīng)元數(shù)量，予以定量，脊髓前角運動神經(jīng)元直徑約40 μm，故每隔2張切片計數(shù)一張，最終合計為神經(jīng)元數(shù)量。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量數(shù)據(jù)以±s表示，資料呈正態(tài)分布時，兩組間比較單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法；資料呈非正態(tài)分布時，采用秩和檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大體功能觀察

端端吻合組大鼠術(shù)后均出現(xiàn)呼吸急促，端側(cè)吻合組術(shù)后出現(xiàn)輕度呼吸急促，術(shù)后第3 d開始恢復正常呼吸。至灌注取材時直視下觀察膈肌的運動情況，見端側(cè)吻合組膈肌運動良好，端端吻合組右側(cè)膈肌癱瘓，膈肌明顯抬高。

所有大鼠均存活并完成各項指標的觀察，在術(shù)后均出現(xiàn)相應(yīng)的功能障礙，各組大鼠伸趾功能喪失，端側(cè)吻合組、端端吻合組合并屈趾活動喪失，伸腕活動部分受限；原位吻合組、未修復組僅有伸趾活動受限，各組大鼠均出現(xiàn)手術(shù)側(cè)的跛行，觀察期間大鼠肢體未出現(xiàn)潰瘍。

伸趾活動出現(xiàn)時間，原位吻合組為23～29 d，平均（25.33±2.25） d，端端吻合組為 29～35 d，平均（32.00±2.76） d，端側(cè)吻合組為 31～39 d，平均（34.33±3.56）d，未修復組在最終隨訪結(jié)束前未出現(xiàn)伸趾活動。

2.2 神經(jīng)電生理檢測

電生理結(jié)果見表1，術(shù)后第7周，端側(cè)吻合組、端端吻合組刺激膈神經(jīng)在均可在伸趾總肌記錄到CMAP，兩組間CMAP的波幅、潛伏期差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；原位吻合組刺激下干后股可在伸趾總肌記錄到CMAP，其CMAP的波幅、潛伏期均顯著優(yōu)于端側(cè)吻合組和端端吻合組（P＜0.05）。端側(cè)吻合組、原位吻合組、未修復組刺激膈肌均可在膈肌記錄到CMAP，各組間比較波幅與潛伏期差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表1 術(shù)后第7周四組大鼠CMAP檢測結(jié)果（±s）與比較

表1 術(shù)后第7周四組大鼠CMAP檢測結(jié)果（±s）與比較

images/BZ_65_207_2797_551_2864.pngimages/BZ_65_551_2797_910_2864.pngimages/BZ_65_910_2797_1309_2864.pngimages/BZ_65_1309_2797_1695_2864.pngimages/BZ_65_1695_2797_2022_2864.pngimages/BZ_65_2022_2797_2274_2864.pngimages/BZ_65_207_2930_551_2996.pngimages/BZ_65_551_2930_910_2996.png3.63±0.23images/BZ_65_910_2930_1309_2996.png3.43±0.20images/BZ_65_1309_2930_1695_2996.png3.15±0.18images/BZ_65_1695_2930_2022_2996.png -images/BZ_65_2022_2930_2274_2996.png0.003images/BZ_65_207_3062_551_3128.pngimages/BZ_65_551_3062_910_3128.pngimages/BZ_65_910_3062_1309_3128.pngimages/BZ_65_1309_3062_1695_3128.pngimages/BZ_65_1695_3062_2022_3128.pngimages/BZ_65_2022_3062_2274_3128.pngimages/BZ_65_207_3194_551_3260.png趾總伸肌潛伏期（s）波幅（mV）images/BZ_65_551_3194_910_3260.png6.97±0.22images/BZ_65_910_3194_1309_3260.png- images/BZ_65_1309_3194_1695_3260.png7.05±0.23images/BZ_65_1695_3194_2022_3260.png7.03±0.23images/BZ_65_2022_3194_2274_3260.png0.797

2.3 神經(jīng)示蹤檢查

神經(jīng)示蹤檢測結(jié)果見表2、圖2。端側(cè)吻合組、端端吻合組手術(shù)側(cè)橈神經(jīng)深支示蹤后均可在C3/4脊髓節(jié)段前角發(fā)現(xiàn)陽性細胞，端端吻合組陽性細胞數(shù)量顯著多于端側(cè)吻合組（P＜0.05）。原位吻合組損傷側(cè)橈神經(jīng)深支示蹤至C8T1脊髓節(jié)段前角陽性細胞數(shù)量顯著多于端側(cè)吻合組、端端吻合組示蹤至損傷側(cè)C3/4脊髓節(jié)段的數(shù)量（P＜0.05）。端側(cè)吻合組、端端吻合組未損傷側(cè)下干后股示蹤至C8T1脊髓節(jié)段前角的陽性細胞數(shù)量顯著多于原位吻合組、未修復組（P＜0.05）。

表2 四組大鼠神經(jīng)示蹤染色陽性細胞計數(shù)結(jié)果（±s）與比較

表2 四組大鼠神經(jīng)示蹤染色陽性細胞計數(shù)結(jié)果（±s）與比較

images/BZ_66_207_738_551_804.pngimages/BZ_66_551_738_910_804.pngimages/BZ_66_910_738_1309_804.pngimages/BZ_66_1309_738_1695_804.pngimages/BZ_66_1695_738_2022_804.pngimages/BZ_66_2022_738_2274_804.pngimages/BZ_66_207_870_551_937.png損傷側(cè)C3/4前角未損傷側(cè)C8T1前角images/BZ_66_551_870_910_937.png118.17±17.51 433.33±39.83images/BZ_66_910_870_1309_937.png144.33±17.50 434.50±42.36images/BZ_66_1309_870_1695_937.png-223.82±39.48images/BZ_66_1695_870_2022_937.png- images/BZ_66_2022_870_2274_937.png221.17±37.77 0.027＜0.001

圖2 四組動物雙側(cè)脊髓前角神經(jīng)熒光示蹤陽性神經(jīng)元觀察（×40） 2a:端側(cè)吻合組C3/4前角示蹤陽性細胞：損傷側(cè)可見陽性神經(jīng)元 2b:端端吻合組C3/4前角示蹤陽性細胞：損傷側(cè)可見陽性神經(jīng)元 2c:原位吻合組C8T1前角示蹤陽性細胞：損傷側(cè)、未損傷側(cè)均可見陽性神經(jīng)元 2d:未修復組C8T1前角示蹤陽性細胞：未損傷側(cè)可見陽性神經(jīng)元

3 討論

臂叢神經(jīng)損傷是最嚴重的周圍神經(jīng)損傷［10］，也是周圍神經(jīng)研究領(lǐng)域中的重點和難點。隨著顯微外科技術(shù)的發(fā)展，多種神經(jīng)移位術(shù)運用到臂叢神經(jīng)的修復，目前全臂叢根性撕脫傷患者的肩肘功能和屈腕指功能能夠得到部分的恢復［11～14］，但伸指功能的治療療效仍然很差，使得患者手部功能恢復仍然遙遙無期。筆者認為手的抓握功能的前提是伸指，有很多神經(jīng)移位手術(shù)修復臂叢、橈神經(jīng)未能獲得較好的伸指功能的恢復［15，16］，考慮原因有神經(jīng)纖維錯配以及神經(jīng)纖維數(shù)量不夠，針對神經(jīng)纖維錯配，顧玉東等［17］先期通過顯微解剖學研究，明確了橈神經(jīng)前臂束組（即橈神經(jīng)支配伸腕指功能的纖維束組）在橈神經(jīng)主干中的定位。并且結(jié)合膈神經(jīng)端端移位的研究成果，在動物實驗和部分臨床病例中已經(jīng)證實此方法可以選擇性地恢復患者的伸腕指功能［17～19］。然而雖在尸體解剖實驗來看可將橈神經(jīng)深、淺支分離開來，但是在臨床上分離難度大，易損傷神經(jīng)纖維，而且長段神經(jīng)游離可能導致神經(jīng)缺血及瘢痕粘連。本研究旨在不分離橈神經(jīng)深淺支，在臂叢根、干、股、束部位精確定位伸指纖維的來源，從而定向恢復伸指功能，避免錯配。而對于供體神經(jīng)數(shù)量不足的情況，早在100年前，就出現(xiàn)了神經(jīng)端側(cè)縫合的概念［20］，即保留供體神經(jīng)原有功能的基礎(chǔ)上，產(chǎn)生額外的神經(jīng)纖維生長入受體神經(jīng)。

作者同樣認為膈神經(jīng)是最優(yōu)選擇，而端側(cè)縫合逐漸成為神經(jīng)修復研究熱點［21～23］，修復可保留供體神經(jīng)的前提下修復受體神經(jīng)［24］。同時進行膈神經(jīng)端端及端側(cè)縫合觀察其伸趾功能恢復情況，兩組大鼠均有伸趾功能恢復，但端側(cè)縫合恢復時間較端端縫合晚，在熒光示蹤實驗中相應(yīng)脊髓節(jié)段前角陽性神經(jīng)元來看，端端縫合組陽性神經(jīng)元數(shù)量較端側(cè)縫合組多，而原位吻合組可在實驗側(cè)C8T1脊髓節(jié)段可觀察到陽性神經(jīng)元，且神經(jīng)元數(shù)量高于端側(cè)吻合組及端端吻合組，這說明下干后股直接修復優(yōu)于神經(jīng)移植+移位。本研究同時發(fā)現(xiàn)正常側(cè)橈神經(jīng)深支示蹤至C8T1脊髓節(jié)段陽性神經(jīng)移數(shù)量較正常側(cè)下干后股示蹤至C8T1節(jié)段陽性神經(jīng)元數(shù)量少，這可能是下干后股除包含橈神經(jīng)深支以外還包含伸腕及伸肘分支的可能，這與楊劍云等［25］在動物實驗中發(fā)現(xiàn)膈神經(jīng)斷端移位下干后股可恢復部分伸趾功能，但同時也可恢復部分伸腕及伸肘功能的結(jié)果一致，同時該研究也用逆向示蹤技術(shù)發(fā)現(xiàn)下干后股示蹤一側(cè)脊髓前角陽性神經(jīng)元數(shù)量明顯多于橈神經(jīng)深支一側(cè)。

電生理檢查發(fā)現(xiàn)觀察結(jié)束時間點端端吻合組膈神經(jīng)完全支配下干后股至橈神經(jīng)深支，而端側(cè)吻合組膈神經(jīng)僅部分支配下干后股至橈神經(jīng)深支，即端端縫合功能出現(xiàn)早且波幅較端側(cè)縫合高，這與既往研究結(jié)果相符合［15，24，25］，將觀察隨訪時間適當延長可能端側(cè)吻合組端側(cè)縫合組也可得到較好的CMAP波幅。端側(cè)吻合組除了伸趾總肌外在膈肌也可記錄到CMAP，且端側(cè)吻組、原位吻合組、未修復組間膈肌CMAP潛伏期與波幅比較無明顯差異，這從解剖上證實膈肌運動功能保留良好，如果能通過大鼠呼吸功能檢查結(jié)果來說明供體膈神經(jīng)功能被保留將更有說服力。

綜上所述，膈神經(jīng)通過神經(jīng)移植端端、端側(cè)修復下干后股均可恢復伸趾功能，端側(cè)修復可保留膈神經(jīng)原有的功能，但有部分動力神經(jīng)去向伸腕、伸肘功能，如何精確修復伸趾功能還有待進一步研究。