矮抗58×蘇隆128的DH遺傳群體創(chuàng)建

劉 洋，劉高祥，丁子俊，司宇佳，盛路寧，方 舟，趙維萍，蔡 華

單倍體是指具有配子染色體數(shù)的個(gè)體，經(jīng)染色體加倍后，在一個(gè)世代中即可獲得純合的二倍體群體，再根據(jù)育種目標(biāo)從群體中選擇優(yōu)良的純系，其后代不會(huì)發(fā)生性狀分離，表型整齊一致。與常規(guī)育種相比，單倍體育種能夠極大程度地縮短育種年限，在小麥、水稻、煙草等作物育種中得到了廣泛應(yīng)用[1]。在小麥單倍體育種過(guò)程中，獲得單倍體最常見(jiàn)的途徑是球莖大麥法、花藥培養(yǎng)法和玉米雜交法。

早在1984年，Zenkteler就首次報(bào)道了以小麥做母本玉米做父本進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交獲得球形胚的研究[2]。隨后，Laurie等初次從細(xì)胞學(xué)角度證明小麥與玉米雜交所得是雜種胚，研究發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)緣雜交后來(lái)自玉米花粉的染色體在最初的三次細(xì)胞分裂中會(huì)被逐漸地完全排除掉，最后只剩下小麥母本的21條染色體，即產(chǎn)生了小麥單倍體胚[3]。自1988年Laurie等利用小穗培養(yǎng)法首次獲得小麥與玉米遠(yuǎn)緣雜交產(chǎn)生的單倍體植株后[4]，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者均進(jìn)行了有關(guān)理論研究和技術(shù)改良，并應(yīng)用于小麥育種實(shí)踐中[5-6]。利用小麥×玉米誘導(dǎo)小麥產(chǎn)生單倍體的技術(shù)具有單倍體誘導(dǎo)效率高、對(duì)小麥基因型無(wú)嚴(yán)格的選擇性、不產(chǎn)生白化苗、誘導(dǎo)產(chǎn)生的單倍體遺傳穩(wěn)定性高和雜交結(jié)實(shí)率較高等優(yōu)點(diǎn)[7-10]。本課題組前期以5E008 ×寧麥9號(hào)的F1與玉米遠(yuǎn)緣雜交誘導(dǎo)小麥單倍體，再經(jīng)染色體加倍獲得了DH系，并從中選育出了小麥新品種蘇隆128[11]。陳新民等也利用小麥與玉米雜交創(chuàng)制小麥DH群體技術(shù)選育出了小麥新品種中麥533[12]。

本研究將矮抗58×蘇隆128的F1代小麥植株在開(kāi)花時(shí)與甜玉米雜交，產(chǎn)生單倍體植株，再將單倍體植株進(jìn)行染色體加倍獲得可以穩(wěn)定遺傳的純合群體，并希望可以獲得高抗倒伏，飽滿度好，成穗率高，商品性好且高抗赤霉病的遺傳群體。

1 材料與方法

1.1 親本材料

以高抗倒伏、抗凍性強(qiáng)、分蘗多的半冬性中熟品種矮抗58為母本，以抗赤霉病、籽粒優(yōu)良的春性品種蘇隆128為父本進(jìn)行雜交得到F1代。再以F1為母本，以甜玉米(購(gòu)自滁州市當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場(chǎng))為父本進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交。

1.2 小麥種子人工春化及分期播種甜玉米

由于F1的母本矮抗58是一個(gè)半冬性品種，其需要低溫春化才能正常開(kāi)花結(jié)實(shí)。所以為了保證小麥與玉米花期相遇，并保證F1代小麥正常開(kāi)花結(jié)實(shí)，于2016年7月先對(duì)F1代小麥進(jìn)行人工春化(4℃低溫處理3周左右)，然后從8月起分期播種甜玉米(每周播種1次，連續(xù)播種6次)，小麥材料于8月初春化完成后移栽至人工氣候室。

1.3 小麥去雄及授粉

2016年9月～11月進(jìn)行人工去雄與授粉。在小麥開(kāi)花前2 d～3 d進(jìn)行人工去雄并套袋隔離；去雄后3 d～5 d內(nèi)及時(shí)授予新鮮甜玉米花粉，甜玉米花粉量充足時(shí)可采用“滾粉”法授粉[13]，授粉后仍然需要進(jìn)行套袋隔離。

1.4 割穗離體培養(yǎng)及田間培養(yǎng)

割穗離體培養(yǎng)法：先按照表1配制混合培養(yǎng)液5 L。在授粉24 h后，齊根部將雜交后的麥穗剪下，將穗的根部插入配制好的混合培養(yǎng)液中，于組培室培養(yǎng)14 d(白天溫度 22℃～23 ℃、夜間 16℃～17 ℃、濕度70 %左右、光照為自然散射光)，每天更換培養(yǎng)液1次[14]。

表1 溶質(zhì)濃度

田間常規(guī)雜交法：授粉5 h后在雜交穗最上部莖節(jié)內(nèi)注射約0.5 mL的100 mg/L 2,4-D溶液，24 h后重復(fù)注射一次。在授粉后第12d～16d每天采取部分雜交穗[15]。

1.5 胚拯救與幼苗培養(yǎng)

在離體培養(yǎng)(或田間自然生長(zhǎng))14 d后開(kāi)始進(jìn)行胚拯救，具體過(guò)程如下：①每個(gè)膨大的子房用75%的乙醇進(jìn)行消毒30 s，再用0.1%氯化汞溶液表面滅菌15 min，最后用無(wú)菌水沖洗3次；②在潔凈工作臺(tái)內(nèi)的解剖鏡下進(jìn)行剝胚，將獲得的雜交幼胚接種到1/2 MS培養(yǎng)基中。

將接種的幼胚置于4℃冰箱中冷藏2 d，然后移到25℃組培室中遮光培養(yǎng)12d左右，待單倍體幼胚分化出根和莖以后，按每天光照12 h進(jìn)行培養(yǎng)，直到幼苗長(zhǎng)至5cm～8 cm高后移栽至花盆內(nèi)，并噴灑生長(zhǎng)素吲哚乙酸和多效唑[15]。

1.6 單倍體苗的染色體人工加倍

單倍體苗達(dá)3個(gè)以上分蘗節(jié)時(shí)，從花盆中取出幼苗，洗凈根部，剪去須根，置25 ℃的20 mL/L二甲基亞砜+ 0.05 %的秋水仙素溶液中處理7 h并持續(xù)給O2。然后用流動(dòng)水沖洗12 h后，移栽至田間土壤中。在抽穗后開(kāi)花前對(duì)所有植株逐穗套袋，并觀察植株結(jié)實(shí)情況，最終收獲加倍單倍體(Double Haploid，簡(jiǎn)稱DH)種子。

2 結(jié)果與分析

2.1 花期調(diào)節(jié)

為了保證甜玉米與F1代小麥能夠花期相遇，本試驗(yàn)分期種植甜玉米，每隔一周種植一批，總共種植6期。表2記錄了花期調(diào)控的結(jié)果，結(jié)果表明：8月初人工春化完成后移栽入田間的小麥可與某幾個(gè)播種期的甜玉米的花期相遇；8月2日播種的甜玉米較8月4日移栽入田間的小麥晚開(kāi)花4天；10月份的持續(xù)陰雨天氣導(dǎo)致了玉米開(kāi)花時(shí)間推遲。

表2 花期調(diào)節(jié)試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)表

2.2 割穗離體培養(yǎng)與田間自然生長(zhǎng)條件下子房的比較

從圖1可以看出，割穗離體培養(yǎng)1 d時(shí)雜交后的小麥子房就已開(kāi)始發(fā)育，離體培養(yǎng)14 d后小麥子房膨大至可進(jìn)行胚拯救的狀態(tài)；而田間自然生長(zhǎng)14 d后雜交子房膨大情況仍不甚理想，且多數(shù)被霉菌感染，這可能是由于套袋引起子房周圍濕度過(guò)高導(dǎo)致霉菌生長(zhǎng)。從小麥穗取下雜交子房后可以看出無(wú)效子房、雜交子房與自花授粉子房有明顯差異，無(wú)效子房癟小，雜交子房較飽滿，自花授粉子房非常飽滿(圖1)。

(a)離體培養(yǎng)1 d的子房；(b)離體培養(yǎng)14 d的子房；(c)田間自然生長(zhǎng)14 d的子房；(d)上：無(wú)效子房；中：雜交子房；下：自花授粉子房

3.3 單倍體胚與自花授粉胚的比較

小麥與玉米遠(yuǎn)緣雜交產(chǎn)生的單倍體子房?jī)?nèi)會(huì)出現(xiàn)胚乳敗亡，僅剩單倍體胚的現(xiàn)象[3]。本試驗(yàn)雜交子房?jī)?nèi)就表現(xiàn)出無(wú)胚乳，且僅有較小的胚(圖2)。而正常情況下，小麥自花授粉的子房既有胚又有胚乳，且胚較大(圖2)。

(a)無(wú)胚乳的單倍體胚；(b)有胚乳的自花授粉的胚

3.4 單倍體幼苗與自花授粉幼苗的比較

單倍體幼苗一般比較纖弱，生長(zhǎng)緩慢，高度不育，無(wú)法形成種子，本試驗(yàn)研究與其一致。如圖3所示，遠(yuǎn)緣雜交產(chǎn)生的單倍體幼苗較自花授粉幼苗生長(zhǎng)緩慢且弱小，相同培養(yǎng)條件下，在培養(yǎng)30d時(shí)，單倍體幼苗也僅長(zhǎng)出一片葉，而自花授粉幼苗生已長(zhǎng)成5～6片葉(圖3)。

(a)光照培養(yǎng)2 d的單倍體胚(箭頭所示);(b)光照培養(yǎng)30 d的單倍體幼苗;(c)光照培養(yǎng)2 d的自花授粉幼苗;(d)光照培養(yǎng)30 d的自花授粉幼苗

3.5 得果率、得胚率、胚成苗率和加倍成功率

雜交穗割穗離體培養(yǎng)和自然生長(zhǎng)條件下的得果率、得胚率、胚成苗率和加倍成功率結(jié)果如表3所示。表3結(jié)果表明，割穗離體培養(yǎng)處理在得果率、得胚率、胚成苗率和加倍成功率上均要明顯高于自然條件下生長(zhǎng)的雜交穗，前者的平均得果率比后者高出8.5%，并且后者沒(méi)有得到單倍體胚和幼苗，這就表明室內(nèi)割穗離體培養(yǎng)的條件更加有利于單倍體胚的形成和生長(zhǎng)發(fā)育。最終本試驗(yàn)通過(guò)割穗離體培養(yǎng)法獲得156株雙單倍體植株(圖4)。通過(guò)統(tǒng)計(jì)計(jì)算得出總得果率=80.56%,總得胚率=3.28%，總胚成苗率=7.50%，總加倍成功率=66.67%。

表3 得果率、得胚率、胚成苗率和加倍成功率統(tǒng)計(jì)表

圖4 雙單倍體遺傳群體

3 討論

在正常的栽培條件下，小麥和玉米的花期總是不遇的。小麥一般在冬季播種，次年春季開(kāi)花，而冬春季節(jié)種植的玉米一般植株比較矮小，花粉量少，育性也較差；玉米一般在夏秋季播種、開(kāi)花，此時(shí)種植小麥會(huì)因不能春化而無(wú)法抽穗開(kāi)花，即無(wú)法進(jìn)行授粉。胡冬梅為使小麥與玉米花期相遇，采用玉米溫床育苗培養(yǎng)、大田移栽，小麥分期播種的方法來(lái)調(diào)節(jié)花期[16]。本試驗(yàn)采用的則是人工春化小麥然后移栽和分期播種玉米的方法來(lái)使小麥與玉米花期相遇。因此，分期播種并配合適當(dāng)?shù)拇胧┦巧a(chǎn)上調(diào)節(jié)花期常用的方法。

小麥與玉米遠(yuǎn)緣雜交后雜交穗的培養(yǎng)一般有兩種方法：一種是割穗離體培養(yǎng)法，另一種是田間自然生長(zhǎng)培養(yǎng)法。顧堅(jiān)等在研究?jī)煞N方法下的單倍體胚誘導(dǎo)效果時(shí)發(fā)現(xiàn)割穗離體培養(yǎng)處理得胚率要明顯高于田間自然生長(zhǎng)條件下的雜交穗，前者是后者的3.29倍；前者的穎殼結(jié)實(shí)率也比后者高出20%，且離體培養(yǎng)的穎果要比自然生長(zhǎng)條件下的穎果飽滿；另外，離體培養(yǎng)形成的單倍體胚要比自然生長(zhǎng)形成的單倍體胚大，這都表明室內(nèi)割穗離體培養(yǎng)更有利于單倍體胚的形成和生長(zhǎng)發(fā)育[14]。本試驗(yàn)同樣采用了上述兩種方法，結(jié)果與之類似，雜交后14d割穗離體培養(yǎng)子房的膨大程度要高于田間自然生長(zhǎng)，并且割穗離體培養(yǎng)處理在得果率、得胚率、胚成苗率和加倍成功率上均要明顯高于自然條件下生長(zhǎng)的雜交穗，最后只在離體培養(yǎng)法中得到了單倍體胚和幼苗。離體培養(yǎng)法比田間自然生長(zhǎng)法得胚率高，可能與室外溫度變幅較大，而室內(nèi)溫度變幅較小、濕度較穩(wěn)定有關(guān)。而且田間自然生長(zhǎng)條件下需要對(duì)雜交穗套袋，袋內(nèi)濕度過(guò)高時(shí)會(huì)導(dǎo)致子房多被霉菌包圍，這也會(huì)降低得胚率。本試驗(yàn)田間自然生長(zhǎng)條件下未剝出單倍體胚，可能就是由于田間生長(zhǎng)時(shí)長(zhǎng)期套袋且不通風(fēng)使得麥穗濕度過(guò)大，麥穗大部分滋生霉菌，子房未正常發(fā)育所致。

培養(yǎng)液中的成分也是影響雜交穗離體培養(yǎng)效果的一個(gè)重要因素。本試驗(yàn)中離體培養(yǎng)A、B、C和D四個(gè)批次的平均得果率為僅為42.91%，比田間自然生長(zhǎng)條件下的平均得果率低23.36%，后期經(jīng)檢查發(fā)現(xiàn)這四個(gè)批次培養(yǎng)液所用的亞硫酸過(guò)期失效，換掉失效的亞硫酸后，離體培養(yǎng)H、I等批次的得果率和得胚率明顯上升。所以亞硫酸的失效可能是導(dǎo)致得果率較低且幼胚發(fā)育不完全、幼胚較小、大部分未正常發(fā)育為幼苗的原因，但還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

利用小麥與玉米進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交誘導(dǎo)產(chǎn)生單倍體植株，在自然條件下其染色體不能加倍，必須經(jīng)過(guò)人工染色體加倍后才能獲得育種上可利用的純合雙單倍體小麥，從而穩(wěn)定地遺傳下去。通常利用秋水仙素對(duì)小麥的根部進(jìn)行處理的方法來(lái)誘導(dǎo)染色體加倍，但秋水仙素使用濃度過(guò)高時(shí)會(huì)產(chǎn)生毒害，導(dǎo)致?tīng)€根現(xiàn)象，進(jìn)而會(huì)降低植株的成活率。陳新民等用濃度分別為500mg/L、750mg/L和1000mg/L的秋水仙素溶液(含20mg/L DMSO)處理已有2～3個(gè)分蘗的單倍體小麥植株5h，并且給予光照、溫度控制在23℃～25℃，后期測(cè)得三個(gè)濃度下的加倍率分別為89.6%、76.05%和73.3%，該研究還認(rèn)為培育壯苗是提高染色體加倍效率的重要因素[17]。本課題組前期研究表明，用750mg/L的秋水仙素溶液(含20mg/L DMSO)處理單倍體小麥苗5h的加倍效果最好(86.4%)，并且處理時(shí)持續(xù)供應(yīng)O2能夠提高加倍率及加倍處理效率[18]。本試驗(yàn)就是用750mg/L的秋水仙素溶液(含20mg/L DMSO)并持續(xù)通O27h處理離體培養(yǎng)獲得的200多棵單倍體小麥植株，最終獲得156棵染色體成功加倍的小麥雙單倍體植株。