Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化瓜蔞皮中總核苷和總氨基酸的提取工藝

吳雪，鄒純才，鄢海燕，劉靜雨，楊燕

(1. 皖南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，安徽 蕪湖 241002；2. 安徽省蕪湖市中醫(yī)醫(yī)院，安徽 蕪湖 241002)

瓜蔞皮是瓜蔞成熟干燥果皮，具寬胸散結(jié)、清熱化痰之功效，是中醫(yī)臨床治療“胸痹”“心痛”的經(jīng)典藥材[1-2]。瓜蔞皮中的化學(xué)成分及藥理活性物質(zhì)已經(jīng)取得相關(guān)的研究進(jìn)展[3-6]，如其中所含核苷類成分腺苷具有很強(qiáng)的抗血小板活性，而氨基酸是人體必需活性物質(zhì)，也是瓜蔞皮注射液[7-9]的質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)?，F(xiàn)已上市的瓜蔞皮注射液的提取工藝采用的是水提醇沉法對(duì)瓜蔞皮提取物進(jìn)行精制，為同時(shí)兼顧核苷類物質(zhì)和氨基酸這兩類成分并使二者都最大程度地保留，需要進(jìn)一步考察并優(yōu)化瓜蔞皮的水提醇沉提取工藝。為此，本研究采用紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定瓜蔞皮提取物的總核苷和總氨基酸含量[10-12]，并以總核苷和總氨基酸為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化法[13-17]優(yōu)化瓜蔞皮的水提醇沉提取工藝，為瓜蔞皮藥效成分的有效提取和利用提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 UV5100型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本株式會(huì)社日立高新技術(shù)科學(xué)那珂事業(yè)所)；AUW-220D型電子天平(日本島津公司)；Heidolph-LR4010/4011旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國(guó)海道爾夫公司)；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；DF-1集熱式磁力加熱攪拌器(常州容華儀器制造有限公司)；101-1-5型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司)；KNT-2-20科特寧純水機(jī)(合肥科寧特水處理設(shè)備有限公司)。

1.2 材料 瓜蔞皮(批號(hào)：20171202，河北安國(guó)市御顏坊中藥材有限公司)；乙醇(批號(hào)：20130513，天津市百世化工有限公司)；腺嘌呤核苷(腺苷，批號(hào)：N68291，山東西亞化學(xué)股份有限公司)；L-精氨酸(批號(hào)：20150528，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；水合三酮?dú)滠?茚三酮，批號(hào)：20200601，上海展云化工有限公司)；其余試劑為分析純，純化水(自制)。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 瓜蔞皮樣品溶液的制備 取瓜蔞皮10.00 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，按一定料液比加入水，按規(guī)定提取次數(shù)和提取時(shí)間超聲提取(功率200 W，超聲頻率40 Hz)，合并濾液并減壓濃縮至10 ml，得瓜蔞皮濃縮液。取瓜蔞皮濃縮液，按一定比例加95%乙醇至規(guī)定醇沉濃度，4 ℃醇沉至規(guī)定時(shí)間，取上清液，減壓濃縮后加水定容至10 ml，得瓜蔞皮樣品溶液，備用。

2.1.2 腺苷對(duì)照品溶液的制備 取腺苷對(duì)照品0.5013 g，精密稱定，置5 ml量瓶中，加水定容至刻度制得濃度為0.1003 g·ml-1的腺苷對(duì)照品溶液，備用。

2.1.3 L-精氨酸對(duì)照品溶液的制備 取L-精氨酸對(duì)照品0.5001 g，精密稱定，置5 ml量瓶中，加水定容至刻度制得濃度為0.1000 g·ml-1的L-精氨酸對(duì)照品溶液，備用。

2.1.4 茚三酮溶液 取茚三酮1.0005 g，精密稱定，置50 ml棕色量瓶中，以無(wú)水乙醇定容至刻度，即得。

2.2 總核苷和總氨基酸含量測(cè)定方法的建立

2.2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

2.2.1.1 核苷測(cè)定波長(zhǎng)的確定 精密量取“2.1.1”項(xiàng)下瓜蔞皮提取物樣品溶液一定量，并用水稀釋成一定濃度；另精密量取“2.1.2”項(xiàng)下腺苷對(duì)照品溶液0.5 ml置100 ml量瓶中加水定容至刻度，制得核苷對(duì)照品稀釋液。以水為空白對(duì)照，照紫外-可見(jiàn)分光光度法，于200～400 nm范圍內(nèi)掃描。結(jié)果表明，腺苷和瓜蔞皮樣品溶液在259 nm處均有最大吸收，因此選擇259 nm作為總核苷的測(cè)定波長(zhǎng)。見(jiàn)圖1。

注：1為瓜蔞皮樣品溶液，2為腺苷對(duì)照品。

2.2.1.2 總氨基酸測(cè)定波長(zhǎng)的確定 精密量取“2.1.1”項(xiàng)下瓜蔞皮樣品溶液0.1 ml置10 ml量瓶中，加水定容至刻度，得瓜蔞皮樣品稀釋溶液；精密量取“2.1.3”項(xiàng)下L-精氨酸對(duì)照品溶液0.1 ml置10 ml量瓶中，加水定容至刻度得L-精氨酸對(duì)照品稀釋溶液。取1 ml瓜蔞皮樣品稀釋溶液和L-精氨酸對(duì)照品稀釋溶液1 ml分別置10 ml量瓶中，加0.5 ml磷酸緩沖鹽(pH=6.86)、0.5 ml茚三酮溶液，水浴15 min，迅速冷卻至室溫后用水定容至刻度。同法做空白，照紫外-可見(jiàn)分光光度法，于400～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。結(jié)果表明，瓜蔞皮樣品稀釋溶液和L-氨基酸對(duì)照品稀釋溶液均在568 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，故選擇568 nm作為總氨基酸含量的測(cè)定波長(zhǎng)。見(jiàn)圖2。

注：1為瓜蔞皮樣品溶液，2為L(zhǎng)-精氨酸對(duì)照品。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

2.2.2.1 腺苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 精密量取“2.1.2”項(xiàng)下腺苷對(duì)照品溶液0.1 ml置100 ml量瓶中，用水定容至刻度，得腺苷對(duì)照品稀釋液，備用。分別精密量取腺苷對(duì)照品稀釋液0.2 ml、0.4 ml、0.8 ml、1.6 ml、3.2 ml置10 ml量瓶中，加水定容至刻度，在259 nm處分別測(cè)定其吸光度。以吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)(y)，以腺苷濃度(mg·ml-1)為橫坐標(biāo)(x)，建立回歸方程為：y=53.93x+0.0017，r=0.9995。結(jié)果表明腺苷在0.002～0.032 mg·ml-1線性關(guān)系良好。

2.2.2.2 L-精氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 精密量取“2.1.3”項(xiàng)下L-精氨酸對(duì)照品溶液0.1 ml置100 ml 量瓶中，用水定容至刻度，得L-精氨酸對(duì)照品稀釋液，備用。分別精密量取L-精氨酸對(duì)照品稀釋液0.25 ml、0.5 ml、1 ml、2 ml、4 ml置10 ml 量瓶中，加0.5 ml磷酸緩沖鹽(pH=6.86)、0.5 ml茚三酮溶液，水浴15 min，迅速冷卻至室溫后用水定容至刻度，同法做空白，于568 nm處分別測(cè)定吸光度。以吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)(y)，以濃度(mg·ml-1) 為橫坐標(biāo)(x)，建立回歸方程為：y=53.63x+0.0094，r=0.9997。結(jié)果表明L-氨基酸在0.0025～ 0.04 mg·ml-1線性關(guān)系良好。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 精密度試驗(yàn)

2.3.1.1 精密度試驗(yàn)(總核苷測(cè)定用) 取“2.1.1”項(xiàng)下瓜蔞皮樣品溶液，按“2.2.2.1”項(xiàng)下方法平行測(cè)定5次，記錄吸光度值。結(jié)果5次測(cè)定吸光度值的 RSD值為0.11% ，表明該方法精密度良好。

2.3.1.2 精密度試驗(yàn)(總氨基酸測(cè)定用) 取“2.1.1”項(xiàng)下瓜蔞皮樣品溶液，按“2.2.2.2”項(xiàng)下方法平行測(cè)定5次，記錄吸光度值。結(jié)果5次測(cè)定吸光度值的RSD值為0.34%，表明該方法精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.3.2.1 穩(wěn)定性試驗(yàn)(總核苷測(cè)定用) 取“2.1.2”項(xiàng)下瓜蔞皮樣品溶液7份，分別放置0 min、30 min、60 min、90 min、120 min、150 min、180 min，按“2.2.2.1”項(xiàng)下方法測(cè)其吸光度值A(chǔ)，計(jì)算RSD值為0.36%。結(jié)果表明該方法穩(wěn)定性良好。

2.3.2.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)(總氨基酸測(cè)定用) 取“2.1.1”項(xiàng)下瓜蔞皮樣品溶液7份，分別放置0 min、30 min、60 min、90 min、120 min、150 min、180 min，按“2.2.2.2”項(xiàng)下方法測(cè)其吸光度值A(chǔ)，計(jì)算RSD值為3.07% 。結(jié)果表明該方法穩(wěn)定性良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn)

2.3.3.1 重復(fù)性試驗(yàn)(總核苷測(cè)定用) 取瓜蔞皮(批號(hào)：20171202)5份，分別按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備瓜蔞皮樣品溶液，按“2.2.2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度值A(chǔ)，計(jì)算RSD值為0.61%。結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.3.2 重復(fù)性試驗(yàn)(總氨基酸測(cè)定用) 取瓜蔞皮(批號(hào)：20171202)5份，分別按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備瓜蔞皮樣品溶液，按“2.2.2.2”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度值A(chǔ)，計(jì)算RSD值為0.10%。結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.4 加樣回收率試驗(yàn)

2.3.4.1 加樣回收率(總核苷測(cè)定用) 取已知總核苷含量的樣品溶液9份，分別精密量取適量的核苷對(duì)照品溶液置于樣品溶液中(核苷質(zhì)量分別為所取樣品溶液中總核苷質(zhì)量的80%、100%和120%，各3份)，按“2.2.2.1”項(xiàng)下方法處理，記錄吸光度值A(chǔ)，計(jì)算樣品加樣回收率。見(jiàn)表1。結(jié)果表明該方法測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

表1 總核苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.3.4.2 加樣回收率(總氨基酸測(cè)定用) 取已知總氨基酸含量的樣品溶液9份，分別精密量取適量的L-精氨酸對(duì)照品溶液置于樣品溶液中(L-精氨酸質(zhì)量分別為所取樣品溶液中總氨基酸質(zhì)量的80%、100%和120%，各3份)，按“2.2.2.2”項(xiàng)下方法處理，記錄吸光度值A(chǔ)，計(jì)算樣品加樣回收率。見(jiàn)表2。結(jié)果表明該方法測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

表2 總氨基酸加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.4 提取工藝的優(yōu)化

2.4.1 單因素考察 主要考察料液比、提取次數(shù)、醇沉濃度、提取時(shí)間、靜置時(shí)間對(duì)總核苷和總氨基酸含量的影響。在前期預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，料液比(g·ml-1)定為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25；超聲提取次數(shù)定為1次、2次、3次、4次、5次；超聲提取時(shí)間定為25 min、35 min、45 min、55 min、65min；加入95%乙醇至醇沉濃度為50%、60%、70%、80%、90%；靜置時(shí)間為12 h、24 h、36 h、48 h、60 h。在各項(xiàng)考察條件中選一項(xiàng)最優(yōu)條件作為后續(xù)提取條件并為最后的響應(yīng)面提供依據(jù)。

2.4.2 料液比的單因素考察 按“2.1.1”項(xiàng)下提取方法，分別按料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25加入純水進(jìn)行超聲提取3次，提取時(shí)間為45 min，提取次數(shù)為3次，醇沉濃度為70%，靜置36 h，制備瓜蔞皮樣品溶液。按“2.2.2”項(xiàng)下方法測(cè)定不同料液比下的總核苷及總氨基酸吸光度值。不同料液比(g·ml-1)下總核苷和總氨基酸吸光度A，見(jiàn)圖3。由圖 3可知，在料液比為1∶15時(shí)，總核苷和總氨基酸吸光度較高且趨于平穩(wěn)，暫定料液比為1∶15。

圖3 料液比單因素考察

2.4.3 靜置時(shí)間單因素考察 按“2.1.1”項(xiàng)下提取方法，按料液比1∶15(g·ml-1)加水進(jìn)行超聲提取，提取次數(shù)為3次，提取時(shí)間為45 min，醇沉濃度為70%，分別靜置12 h、24 h、36 h、48 h、60 h，制備瓜蔞皮樣品溶液。按“2.2.2”項(xiàng)下方法測(cè)定不同靜置時(shí)間下的總核苷及總氨基酸吸光度值。不同靜置時(shí)間下總核苷和總氨基酸吸光度A，見(jiàn)圖 4。圖4可知，在靜置時(shí)間為36 h時(shí)，總核苷和總氨基酸吸光度較高，暫定靜置時(shí)間為36 h。

圖4 靜置時(shí)間單因素考察

2.4.4 提取次數(shù)單因素考察 按“2.1.1”項(xiàng)下提取方法，按料液比1∶15加入純水進(jìn)行超聲提取，提取次數(shù)分別為1次、2次、3次、4次、5次，提取時(shí)間為45 min，醇沉濃度為70%，靜置36 h，制備瓜蔞皮樣品溶液。按“2.2.2”項(xiàng)下方法測(cè)定不同提取次數(shù)的總核苷及總氨基酸吸光度值。不同提取次數(shù)下總核苷和總氨基酸吸光度A，見(jiàn)圖5。由圖5可知，在提取次數(shù)為4次時(shí)，總核苷和總氨基酸吸光度較高，暫定提取次數(shù)為4次。

圖5 提取次數(shù)單因素考察

2.4.5 醇沉濃度單因素考察 按“2.1.1”項(xiàng)下提取方法，按料液比1∶15加入純水進(jìn)行超聲提取，提取次數(shù)分別為4次，提取時(shí)間為45 min，醇沉濃度分別為50%、60%、70%、80%、90%，靜置36 h，制備瓜蔞皮樣品溶液。按“2.2.2”項(xiàng)下方法測(cè)定不同醇沉濃度下的總核苷及總氨基酸吸光度值。不同醇沉濃度下總核苷和總氨基酸吸光度A，見(jiàn)圖6。由圖6可知，在醇沉濃度為60%時(shí)，總核苷和總氨基酸吸光度較高，暫定醇沉濃度為60%。

圖6 醇沉濃度單因素考察

2.4.6 提取時(shí)間單因素考察 按“2.1.1”項(xiàng)下提取方法，按料液比1∶15加入純水進(jìn)行超聲提取，提取次數(shù)分別為4次，提取時(shí)間為25 min、35 min、45 min、55 min、65 min，醇沉濃度為60%，靜置36 h，制備瓜蔞皮樣品溶液。按“2.2.2”項(xiàng)下方法測(cè)定不同提取時(shí)間下的總核苷及總氨基酸吸光度值。不同提取時(shí)間下總核苷和總氨基酸吸光度A，見(jiàn)圖 7。由圖7可知，在提取時(shí)間為55 min，總核苷和總氨基酸吸光度較高，暫定提取時(shí)間為55 min。

2.5 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì) 將單因素中獲得的最優(yōu)條件為0條件代碼帶入Design-Expert 8.0.6軟件，選擇料液比(A)、提取時(shí)間(B)、醇沉百分比(C)、靜置時(shí)間(D)為考察因素，以總核苷和總氨基酸為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用四因素三水平L29(34)共計(jì)29組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，確定最佳提取工藝。

2.5.1 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Benhnken響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)原理進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選取影響總核苷和總氨基酸最大的4個(gè)因素：料液比(A)、提取時(shí)間(B)、醇沉濃度(C)、靜置時(shí)間(D)，并將這4個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)組合，響應(yīng)面分析因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表3。

表3 響應(yīng)面分析因素水平

2.5.2 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果 通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)，共進(jìn)行29組試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 Box-Behnken 試驗(yàn)安排及結(jié)果

2.5.3 響應(yīng)面回歸模型各項(xiàng)方差分析

2.5.3.1 總核苷響應(yīng)面回歸模型各項(xiàng)方差分析 使用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)Box-Behnken設(shè)計(jì)數(shù)據(jù)處理，以總核苷吸光度為指標(biāo)進(jìn)行線性、2FI、二項(xiàng)式、三項(xiàng)式方程擬合?？偤塑瘴舛纫远?xiàng)式回歸為最優(yōu)，其回歸方程分別為：總核苷=0.72-0.04A+0.10B-0.041C+8.917×10-3D+0.027AB-1.000×10-3AC-0.063AD+0.083BC-0.072BD+0.13CD-0.11A2-0.084B2-0.066C2-0.048D2。見(jiàn)表5。由表5方差分析和顯著性檢驗(yàn)結(jié)果可知，對(duì)于核苷模型F=2.5，P<0.05，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)采用的二次多項(xiàng)式回歸方程模型是顯著的；失擬項(xiàng)P=0.1324，無(wú)顯著性差異，說(shuō)明此回歸模型擬合程度較好，因此可通過(guò)這個(gè)模型來(lái)反映瓜蔞皮中總核苷的提取工藝中各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系。

表5 核苷響應(yīng)面回歸模型各項(xiàng)方差分析

2.5.3.2 總氨基酸響應(yīng)面回歸模型各項(xiàng)方差分析 使用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)Box-Behnken設(shè)計(jì)數(shù)據(jù)處理，以總氨基酸吸光度為指標(biāo)進(jìn)行線性、2FI、二項(xiàng)式、三項(xiàng)式方程擬合?？偘被嵛舛纫远?xiàng)式回歸為最優(yōu)，其回歸方程分別為：總氨基酸=1.17+0.013A+0.11B-0.2C-0.26D+0.22AB-0.099AC+0.025BC-0.14BD+0.33CD+0.027A2-0.040B2-0.019C2-3.883×10-3D2。見(jiàn)表6。由表 6 方差分析和顯著性檢驗(yàn)結(jié)果可知，對(duì)于氨基酸模型F=2.49，P<0.05，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)采用的二次多項(xiàng)式回歸方程模型是顯著的；失擬項(xiàng)P=0.1116，無(wú)顯著性差異，說(shuō)明此回歸模型擬合程度較好，因此可通過(guò)這個(gè)模型來(lái)反映瓜蔞皮中總氨基酸的提取工藝中各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系。

表6 氨基酸響應(yīng)面回歸模型各項(xiàng)方差分析

表6(續(xù)) 氨基酸響應(yīng)面回歸模型各項(xiàng)方差分析

2.5.4 響應(yīng)面分析與優(yōu)化 使用Design-Expert 8.0.6軟件，選擇對(duì)各指標(biāo)有顯著影響的2個(gè)因素，根據(jù)總核苷和總氨基酸模型回歸方程分別繪制料液比、提取時(shí)間、醇沉濃度、靜置時(shí)間對(duì)總核苷和總氨基酸吸光度值的響應(yīng)面圖。從圖8和圖9三維效應(yīng)圖可知各影響因素間的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響，曲面越陡說(shuō)明影響越大。從圖8可知總核苷吸光度值 A 受料液比和提取時(shí)間影響較大。從圖9可知總氨基酸吸光度值A(chǔ)受靜置時(shí)間和醇沉濃度影響較大。

圖8 各因素交互作用對(duì)總核苷的影響

圖9 各因素交互作用對(duì)總氨基酸的影響

2.6 優(yōu)選工藝的驗(yàn)證 采用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到的優(yōu)化工藝條件為A=1∶16.60，B=62.32 min，C=50%，D=24 h。根據(jù)實(shí)驗(yàn)的實(shí)際操作情況，確定最佳工藝條件為 A=1∶15，B=60 min，C=50%，D=24 h，即選擇料液比(g·ml-1)為1∶15，提取時(shí)間為60 min，醇沉濃度為50% ，靜置時(shí)間為24 h。根據(jù)該工藝條件，經(jīng)5次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，總核苷吸光度A平均值為0.785，RSD=0.42%，模型的預(yù)測(cè)結(jié)果為0.788，結(jié)果顯示實(shí)際測(cè)定結(jié)果與模型預(yù)測(cè)結(jié)果差值為0.003；總氨基酸吸光度A平均值為2.112，RSD=0.07%，模型的預(yù)測(cè)結(jié)果為2.168，結(jié)果顯示實(shí)際測(cè)定結(jié)果與模型預(yù)測(cè)結(jié)果差值為0.056，表明優(yōu)化后的提取工藝可行。

3 討論

瓜蔞皮注射液為瓜蔞皮經(jīng)水煎煮4次共計(jì)4 h后減壓濃縮并加入90%乙醇使含醇量為70%，靜置72 h后進(jìn)一步精制后制得的滅菌溶液。鑒于瓜蔞皮注射液用藥不便，本研究后期擬對(duì)瓜蔞皮注射液進(jìn)行劑型改進(jìn)制備瓜蔞皮緩釋微丸。鑒于瓜蔞皮中總核苷和總氨基酸的生理活性，本研究擬在瓜蔞皮提取的過(guò)程中，同時(shí)最大可能地保留總核苷和總氨基酸的含量。為此，對(duì)瓜蔞皮的提取工藝進(jìn)行了考察。課題組前期比較了回流提取和超聲提取對(duì)瓜蔞皮中總核苷和總氨基酸含量的影響，發(fā)現(xiàn)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但超聲提取法提取時(shí)間短、提取效率高，有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，為此，本研究采用了超聲提取法提取瓜蔞皮中總核苷和總氨基酸。

瓜蔞皮樣品溶液在 259 nm處的吸收峰不明顯，可能原因是瓜蔞皮中多種核苷類物質(zhì)在259 nm 附近的光譜疊加而致。結(jié)合課題組前期采用薄層色譜-紫外光譜聯(lián)用[18-20]對(duì)核苷的分離分析和本文的方法學(xué)驗(yàn)證可知，選擇259 nm作為總核苷的測(cè)定波長(zhǎng)方法可靠。瓜蔞皮中的氨基酸雖然較穩(wěn)定，但在測(cè)定過(guò)程中受水浴的影響，各組需要降至相同溫度后進(jìn)行定容，減小溫度波動(dòng)對(duì)量瓶體積的影響，降低測(cè)量誤差。在前期大量預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，先進(jìn)行了各影響因素較大梯度的考察，再進(jìn)行單因素考察并通過(guò) Design-Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化獲得最佳提取工藝。利用該提取工藝可最大程度地保留瓜蔞皮提取物中總核苷和總氨基酸的含量，為后期的瓜蔞皮提取物的深入研究和開(kāi)發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。