碘乙酸鈉鼠爪炎性痛模型的建立及TRPV1介導(dǎo)的痛敏機(jī)制的研究

南麗婷，吳丹，李莎莎，余雙全

(1. 右江民族醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，廣西 百色 533000；2. 右江民族醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，廣西 百色 533000)

刺激性化學(xué)物質(zhì)注射法是建立炎性痛模型廣泛采用的方法之一，其中鼠爪注射引起炎性痛的物質(zhì)包括福爾馬林[1]、角叉菜膠[2]、完全弗式佐劑[3]、蜜蜂毒[4]、松節(jié)油[5]等；膝關(guān)節(jié)部位注射引起炎性痛的物質(zhì)包括碘乙酸鈉(sodium monoiodoacetate，MIA)[6]、木瓜蛋白酶[7]等。鑒于骨關(guān)節(jié)腔注射碘乙酸鈉可成功誘導(dǎo)骨關(guān)節(jié)炎痛的發(fā)生，我們推想，鼠爪注射碘乙酸鈉是否能誘導(dǎo)鼠爪產(chǎn)生炎癥和炎性痛？如果出現(xiàn)炎癥和炎性痛，該痛敏狀態(tài)持續(xù)時(shí)間多久？這種炎性痛模型與現(xiàn)有的其他鼠爪炎性痛模型相比有何特點(diǎn)？該炎性痛模型痛敏產(chǎn)生及維持的機(jī)制是什么？

瞬時(shí)受體電位香草酸亞型1(transient receptor potential vanilloid type 1，TRPV1)是一種非選擇性陽(yáng)離子通道[8]，參與慢性疼痛的發(fā)生發(fā)展[9-10]。已有報(bào)道表明TRPV1介導(dǎo)福爾馬林誘導(dǎo)的炎性痛[11]、角叉菜膠誘導(dǎo)的炎性痛[12]、完全弗式佐劑誘導(dǎo)的炎性痛[13]。由此我們提出假設(shè)，TRPV1有可能參與介導(dǎo)碘乙酸鈉誘導(dǎo)鼠爪部位炎性痛的痛覺過敏。我們將通過給予TRPV1的拮抗劑辣椒平和激動(dòng)劑辣椒素，研究TRPV1在碘乙酸鈉模型痛敏中的作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)雄性Wistar大鼠144只，體重210～250 g，購(gòu)自長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司。動(dòng)物自由飲食，控制溫度23～26 ℃和濕度50%～60%。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均遵守相關(guān)倫理審批要求。

1.2 試劑 碘乙酸鈉(上海聯(lián)碩生物科技有限公司，批號(hào)：64-69-7)，辣椒素(MCE公司，批號(hào)：HY-10448)，辣椒平(MCE公司，批號(hào)：HY-15640)。

1.3 碘乙酸鈉溶液注射創(chuàng)建新型炎癥疼痛動(dòng)物模型 對(duì)大鼠使用4%異氟烷誘導(dǎo)麻醉，之后用2%異氟烷維持麻醉，在麻醉狀態(tài)下給大鼠左后爪足底皮下注射3個(gè)濃度的碘乙酸鈉溶液，注射體積都是100 μl，注射液中分別含碘乙酸鈉0.11 mg、0.33 mg和1 mg。對(duì)照組左后爪足底皮下注射100 μl生理鹽水。

1.4 動(dòng)物分組 用于造模實(shí)驗(yàn)的大鼠分成低劑量MIA組(MIA 0.11 mg/100 μl)、中劑量MIA組(MIA 0.33 mg/100 μl)、高劑量MIA組(MIA 1 mg/100 μl)和對(duì)照組(生理鹽水100 μl)等4組，每組8只，共32只。MIA注射方法是大鼠左后爪足底皮下注射MIA。造模實(shí)驗(yàn)中每只大鼠均測(cè)量其熱痛、機(jī)械痛、足負(fù)重和爪體積。用于辣椒平(capsazepine，CPZ)實(shí)驗(yàn)的大鼠分成低劑量CPZ組(MIA 1 mg/100 μl + CPZ 3 μg/100 μl)、中劑量CPZ組(MIA 1 mg/100 μl + CPZ 10 μg/100 μl)、高劑量CPZ組(MIA 1 mg/100 μl + CPZ 30 μg/100 μl)和對(duì)照組(MIA 1 mg/100 μl + 生理鹽水100 μl)等4組，即3種指標(biāo)4個(gè)劑量，每組8只，共96只。CPZ注射方法是在大鼠左后爪足底皮下注射高劑量碘乙酸鈉(1 mg/100 μl)后第2天，大鼠左后爪足底皮下注射CPZ。辣椒平實(shí)驗(yàn)使用不同大鼠分別測(cè)量其熱痛、機(jī)械痛、足負(fù)重。用于辣椒素實(shí)驗(yàn)的大鼠分成碘乙酸鈉組(MIA 1 mg/100 μl)和對(duì)照組(生理鹽水100 μl)等2組，每組8只。辣椒素注射方法是在大鼠左后爪足底皮下注射高劑量碘乙酸鈉(1 mg/100 μl)后第2天，大鼠左后爪足底皮下注射辣椒素。

1.5 鼠爪容積測(cè)量 造模后第2天用足趾容積測(cè)量?jī)x(成都泰盟軟件有限公司,型號(hào)：PV-200)測(cè)量鼠爪容積，3次測(cè)量的平均值作為測(cè)量值。

1.6 熱刺激縮爪潛伏期(paw withdrawal latency to radiant heat)測(cè)定 采用足底熱輻射測(cè)痛儀(Ugo Basile，型號(hào)：37370)測(cè)量大鼠后爪熱刺激縮爪反應(yīng)潛伏期，反映熱痛。將大鼠置于透明觀察箱內(nèi)，大鼠安靜后，儀器發(fā)射紅外光，經(jīng)玻璃板直接照射大鼠后足底，記錄從開始照射至出現(xiàn)逃避性縮爪反應(yīng)的時(shí)間，作為熱痛閾(s)。測(cè)試前連續(xù)3 d適應(yīng)性訓(xùn)練。測(cè)試時(shí)，取3次測(cè)量(間隔5 min)的平均值作為熱痛閾值。

1.7 機(jī)械刺激縮爪反射閾值(paw withdrawal threshold to mechanical force)測(cè)定 采用動(dòng)態(tài)足底測(cè)痛儀(Ugo Basile，型號(hào)：37400)測(cè)量大鼠后爪機(jī)械刺激縮爪反應(yīng)閾值，反映機(jī)械痛。將大鼠置于底部為鐵絲網(wǎng)的透明觀察箱內(nèi)，大鼠安靜后，用纖絲刺激大鼠后爪足底，刺激強(qiáng)度逐漸增大，記錄大鼠出現(xiàn)逃避性縮爪反應(yīng)的刺激強(qiáng)度，作為機(jī)械痛閾(g)。測(cè)試前連續(xù)3 d適應(yīng)性訓(xùn)練。測(cè)試時(shí)，取3次測(cè)量(間隔5 min)的平均值作為機(jī)械痛閾值。

1.8 足負(fù)重試驗(yàn)(dynamic weight bearing) 采用雙足平衡測(cè)痛儀(成都泰盟，型號(hào)：PH-200)測(cè)量大鼠足負(fù)重，反映自發(fā)性疼痛。將大鼠放入黑色有機(jī)玻璃測(cè)試盒中，大鼠雙足分別立在壓力傳感器面板上。采集大鼠5 s內(nèi)的左、右足各自承重值。測(cè)試前連續(xù)3 d適應(yīng)性訓(xùn)練。測(cè)試時(shí)，取3次測(cè)量(間隔5 min)的平均值，換算成致炎測(cè)后肢承重占雙后肢全部承重的百分比(足負(fù)重值，% weight on ipsilateral hindpaw)。

1.9 辣椒素誘導(dǎo)的保衛(wèi)性行為(guarding behavior)的觀察 大鼠鼠爪足底皮下注射辣椒素(4.5 μg/50 μl)后立即放入透明觀察箱中，讓其自由活動(dòng)，記錄大鼠5 min內(nèi)的保衛(wèi)性行為(持續(xù)抬爪、舔爪、快速抬爪放爪)持續(xù)時(shí)間，大鼠每次快速抬爪放爪換算成抬爪時(shí)間0.5 s。

2 結(jié)果

2.1 大鼠爪內(nèi)注射碘乙酸鈉產(chǎn)生熱痛敏 與對(duì)照組(注射生理鹽水100 μl)相比，低、中、高劑量碘乙酸鈉組的熱痛閾值均出現(xiàn)降低，此降低效應(yīng)呈劑量依賴關(guān)系。熱痛閾降低在低劑量碘乙酸鈉組維持1 d：注射MIA后第1天，低MIA組(5.97±0.41) s vs 對(duì)照組(7.05±0.17) s(P<0.05)；熱痛閾降低在中劑量碘乙酸鈉組維持2 d：注射MIA后第1天和第2天，中MIA組 vs 對(duì)照組分別是(3.73±0.54) s vs (7.05±0.17) s和(5.74±0.26) s vs (7.41±0.33) s(P<0.05)；熱痛閾降低在高劑量碘乙酸鈉組維持5 d：注射MIA后第1天、第2天、第3天、第4天、第5天，高M(jìn)IA組 vs 對(duì)照組分別是(3.36±0.25) s vs (7.05±0.17) s、(3.68±0.23) s vs (7.41±0.33) s、(5.20±0.37) s vs (7.03±0.29) s、(5.32±0.23) s vs (6.91±0.23) s、(6.04±0.41) s vs (7.10±0.18) s(P<0.05)，見圖1。

注：MIA指碘乙酸鈉，各組動(dòng)物數(shù)=8；與同時(shí)間點(diǎn)的對(duì)照組相比，*表示P<0.05。

2.2 大鼠爪內(nèi)注射碘乙酸鈉產(chǎn)生機(jī)械痛敏 與對(duì)照組(注射生理鹽水100 μl)相比，低劑量和中劑量碘乙酸鈉組的機(jī)械痛閾值沒有明顯變化，但高劑量碘乙酸鈉組的機(jī)械痛閾值明顯降低，這種降低效應(yīng)長(zhǎng)達(dá)4 d：注射MIA后第1天、第2天、第3天、第4天，高M(jìn)IA組 vs 對(duì)照組分別是(15.09±0.66) g vs (25.72±1.77) g、(12.80±0.93) g vs (25.30±1.34) g、(16.40±1.14) g vs (26.22±0.86) g、(17.13±1.30) g vs (26.27±1.11) g(P<0.05)，見圖2。

注：MIA指碘乙酸鈉，各組動(dòng)物數(shù)=8；與同時(shí)間點(diǎn)的對(duì)照組相比，*表示P<0.05。

2.3 大鼠爪內(nèi)注射碘乙酸鈉降低足負(fù)重 與對(duì)照組(注射生理鹽水100 μl)相比，低、中、高劑量碘乙酸鈉組的足負(fù)重均出現(xiàn)降低。此降低效應(yīng)在低劑量和中劑量碘乙酸鈉組皆維持1 d：注射MIA后第1天，低MIA組(43.92±3.43)% vs 對(duì)照組(50.88±0.79)%，中MIA組(43.73±2.45)% vs 對(duì)照組(50.88±0.79)%(P<0.05)；此降低效應(yīng)在高劑量碘乙酸鈉組維持6 d：注射MIA后第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天，高M(jìn)IA組 vs 對(duì)照組分別是(36.85±2.60)% vs (50.88±0.79)%、(33.13±1.98)% vs (50.03±0.25%)、(39.60±2.51)% vs (50.33±0.40)%、(42.85±1.83)% vs (50.07±0.51)%、(43.25±1.81)% vs (50.09±0.33)%、(44.64±1.27)% vs (50.09±0.24)%(P<0.05)，見圖3。

注：MIA指碘乙酸鈉，各組動(dòng)物數(shù)=8；與同時(shí)間點(diǎn)的對(duì)照組相比，*表示P<0.05。

2.4 大鼠爪內(nèi)注射碘乙酸鈉增加爪體積 與對(duì)照組(注射生理鹽水100 μl)相比，高劑量碘乙酸鈉組(MIA劑量是 1 mg/100 μl)大鼠鼠爪體積增加明顯：注射MIA后第2天，高M(jìn)IA組(2.55±0.07)ml vs 對(duì)照組(1.56±0.03) ml(P<0.05)，見圖4。

注：MIA指碘乙酸鈉，各組動(dòng)物數(shù)=8；與對(duì)照組相比，*表示P<0.05。

2.5 辣椒平可反轉(zhuǎn)碘乙酸鈉誘導(dǎo)的熱痛閾值降低 注射高劑量碘乙酸鈉(1 mg/100 μl)后第2天，爪內(nèi)注射TRPV1受體特異性拮抗劑辣椒平(capsazepine，CPZ，低劑量、中劑量、高劑量分別是3 μg/100 μl、10 μg/100 μl、30 μg/100 μl)，產(chǎn)生長(zhǎng)達(dá)1 h以上的熱痛鎮(zhèn)痛效應(yīng)，且此效應(yīng)呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。與對(duì)照組(生理鹽水，NS，100 μl)相比，高劑量辣椒平組對(duì)碘乙酸鈉誘導(dǎo)的熱痛的反轉(zhuǎn)作用最為明顯：注射CPZ后第10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min，高CPZ組vs NS組分別是(5.68±0.55) s vs (3.31±0.24) s、(6.05±0.60) s vs (3.38±0.20) s、(5.45±0.41) s vs (3.80±0.44) s、(5.41±0.44) s vs (3.03±0.25) s、(5.21±0.42) s vs (3.28±0.15) s、(4.92±0.30) s vs (3.39±0.28) s(P<0.05)，見圖5。

注：CPZ指辣椒平，各組動(dòng)物數(shù)=8；與同時(shí)間點(diǎn)的對(duì)照組相比，*表示P<0.05。

2.6 辣椒平可反轉(zhuǎn)碘乙酸鈉誘導(dǎo)的機(jī)械痛閾值降低 注射高劑量碘乙酸鈉(1 mg/100 μl)后第2天，爪內(nèi)注射TRPV1受體特異性拮抗劑辣椒平(低、中、高劑量分別是3 μg/100 μl、10 μg/100 μl、30 μg/100 μl)，產(chǎn)生持續(xù)20 min左右的機(jī)械痛鎮(zhèn)痛效應(yīng)，且此效應(yīng)呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。與對(duì)照組(生理鹽水，NS，100 μl)相比，高劑量辣椒平組對(duì)碘乙酸鈉誘導(dǎo)的機(jī)械痛的反轉(zhuǎn)作用最為明顯：注射CPZ后第20 min、30 min、40 min，高CPZ組vs NS組分別是(22.63±1.49) g vs (14.70±2.08) g、(22.66±1.97) g vs (14.52±1.40) g、(23.98±0.89) g vs (14.38±2.65) g(P<0.05)，見圖6。

注：CPZ指辣椒平，各組動(dòng)物數(shù)=8；與同時(shí)間點(diǎn)的對(duì)照組相比，*表示P<0.05。

2.7 辣椒平可反轉(zhuǎn)碘乙酸鈉誘導(dǎo)的足負(fù)重降低 注射高劑量碘乙酸鈉(1 mg/100 μl)后第2天，爪內(nèi)注射TRPV1受體特異性拮抗劑辣椒平(低劑量、中劑量、高劑量分別是3 μg/100 μl、10 μg/100 μl、30 μg/100 μl)，足負(fù)重出現(xiàn)加重，且此效應(yīng)呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。與對(duì)照組(生理鹽水，NS，100 μl)相比，低劑量辣椒平不改變碘乙酸鈉誘導(dǎo)的足負(fù)重降低；中劑量辣椒平對(duì)碘乙酸鈉誘導(dǎo)的足負(fù)重降低產(chǎn)生短暫的緩解作用：注射CPZ后第20 min，中CPZ組(40.39±2.11)% vs NS組(32.44±3.03)% (P<0.05)；高劑量辣椒平對(duì)碘乙酸鈉誘導(dǎo)的足負(fù)重降低產(chǎn)生明顯的反轉(zhuǎn)作用：注射CPZ后第10 min、20 min、30 min、40 min、50 min，高CPZ組vs NS組分別是(42.02±2.83)%vs (30.96±2.85)%、(43.95±2.75)% vs (32.44±3.03)%、(44.88±2.72)% vs (34.58±2.58)%、(45.47±2.84)% vs (34.91±1.93)%、(39.93±1.75)% vs (33.57±1.43)%(P<0.05)，見圖7。

注：CPZ指辣椒平，各組動(dòng)物數(shù)=8；與同時(shí)間點(diǎn)的對(duì)照組相比，*表示P<0.05。

2.8 辣椒素對(duì)碘乙酸鈉炎性痛大鼠保衛(wèi)性行為的影響 鼠爪注射TRPV1激動(dòng)劑辣椒素(4.5 μg/50 μl)后，碘乙酸鈉組(1 mg/100 μl)大鼠保衛(wèi)性行為(抬爪、舔爪)累計(jì)時(shí)間顯著高于對(duì)照組：MIA組 vs 對(duì)照組(130.38±14.09) s vs(48.00±8.35) s(P<0.05)，見圖8。

注：MIA指碘乙酸鈉，各組動(dòng)物數(shù)=8；與對(duì)照組相比，*表示P<0.05。

3 討論

本次研究表明碘乙酸鈉鼠爪注射可產(chǎn)生長(zhǎng)達(dá)5 d的熱痛、長(zhǎng)達(dá)4 d的機(jī)械痛和長(zhǎng)達(dá)6 d的自發(fā)痛；碘乙酸鈉注射后，鼠爪變得腫脹；辣椒平有效緩解碘乙酸鈉誘導(dǎo)的熱痛、機(jī)械痛和自發(fā)痛；辣椒素刺激后，碘乙酸鈉炎性痛大鼠的疼痛行為明顯增加。

不同時(shí)程的炎性痛模型可分別用來(lái)研究臨床上相對(duì)應(yīng)的不同時(shí)程的慢性痛。目前鼠爪部位注射化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)的慢性炎性痛模型中，痛敏狀態(tài)持續(xù)一兩天的短程慢性炎性痛模型有蜜蜂毒模型[14]，痛敏狀態(tài)持續(xù)1周左右的中程慢性炎性痛模型有松節(jié)油模型[5]，痛敏狀態(tài)持續(xù)兩周以上的長(zhǎng)程慢性炎性痛模型有完全弗式佐劑模型[3]。本實(shí)驗(yàn)通過鼠爪注射碘乙酸鈉，觀察到持續(xù)4～6 d的熱痛過敏、機(jī)械痛過敏和自發(fā)痛，從而在痛敏時(shí)程位于一周左右的中程慢性炎性痛動(dòng)物模型中增加了一種新型的鼠爪炎性痛模型。

這種新型鼠爪炎性痛模型的痛敏程度顯著：熱痛閾值降低50%，機(jī)械痛閾值降低49%，足負(fù)重降低至33%；與之比較，同屬中程慢性炎性痛的松節(jié)油炎性痛模型的熱痛閾值降低55%[5]，機(jī)械痛閾值降低78%[5]，足負(fù)重降低至24%[15]。可以看出，碘乙酸鈉鼠爪炎性痛模型在疼痛時(shí)程、疼痛程度方面可以比擬現(xiàn)有的慢性炎性痛模型。不僅如此，由于碘乙酸鈉來(lái)源方便，使得該模型具有經(jīng)濟(jì)實(shí)用的優(yōu)勢(shì)。這個(gè)新型模型將為慢性疼痛的研究在慢性動(dòng)物炎性痛模型的選擇方面增加一個(gè)選項(xiàng)。接下來(lái)我們探討碘乙酸鈉鼠爪炎性痛的痛敏機(jī)制。TRPV1是一種在初級(jí)感覺神經(jīng)元中大量表達(dá)的陽(yáng)離子通道[11]，有報(bào)道揭示TRPV1介導(dǎo)福爾馬林誘導(dǎo)的炎性痛、角叉菜膠誘導(dǎo)的炎性痛[12]、完全弗式佐劑誘導(dǎo)的炎性痛[13]。TRPV1是否也介導(dǎo)碘乙酸鈉鼠爪炎性痛？我們從拮抗和激活TRPV1兩個(gè)方面去了解TRPV1在碘乙酸鈉鼠爪炎性痛中的作用。在碘乙酸鈉炎性痛大鼠鼠爪部位注射TRPV1拮抗劑辣椒平后，無(wú)論是誘發(fā)痛(熱痛敏、機(jī)械痛敏)還是自發(fā)痛(足負(fù)重)都得到緩解，這些結(jié)果提示TRPV1參與了碘乙酸鈉誘導(dǎo)的誘發(fā)痛和自發(fā)痛。碘乙酸鈉炎性痛大鼠鼠爪部位給予TRPV1激動(dòng)劑辣椒素后，注射側(cè)大鼠鼠爪產(chǎn)生了更多的痛覺行為(即以抬爪舔爪為特征的保衛(wèi)性行為，表現(xiàn)為抬爪時(shí)間明顯增多)，這種加劇的TRPV1激動(dòng)反應(yīng)提示TRPV1表達(dá)水平在碘乙酸鈉注射大鼠鼠爪后可能發(fā)生上調(diào)，而TRPV1的上調(diào)則暗示TRPV1在碘乙酸鈉誘導(dǎo)的炎性痛的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。以上結(jié)果提示碘乙酸鈉誘導(dǎo)的痛覺過敏至少部分是由TRPV1介導(dǎo)的。

總之，通過鼠爪注射碘乙酸鈉可以成功建立一種新型中程慢性炎性痛模型，這種模型為慢性疼痛研究領(lǐng)域提供了一種造模簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)實(shí)用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。碘乙酸鈉鼠爪炎性痛的發(fā)生發(fā)展至少部分是由TRPV1介導(dǎo)的。