槲皮素對(duì)脛骨平臺(tái)骨折新西蘭兔模型骨形態(tài)生成蛋白/Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2信號(hào)通路的影響Δ

韓勝義，胡 培，孟 和，高 宇，郭子龍

(張家口市第一醫(yī)院骨科，河北 張家口 075041)

脛骨平臺(tái)骨折作為骨科常見(jiàn)骨折類型，主要由墜落和內(nèi)、外翻性暴力撞擊膝關(guān)節(jié)所致[1]。研究結(jié)果表明，脛骨平臺(tái)作為前后交叉韌帶、內(nèi)外側(cè)副韌帶等多韌帶附著點(diǎn)，主要由脛骨近側(cè)干骺端及2個(gè)關(guān)節(jié)面組成[2]。脛骨平臺(tái)骨折病情復(fù)雜，多伴有半月板、周圍韌帶等損傷，對(duì)膝關(guān)節(jié)功能造成嚴(yán)重影響，嚴(yán)重威脅患者的日常生活[3]。隨著事故發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的增加，脛骨平臺(tái)骨折發(fā)生率升高，骨愈合過(guò)程等生物力學(xué)成為研究焦點(diǎn)[4]。相關(guān)研究結(jié)果指出，骨形態(tài)生成蛋白(BMP)/Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runx2)信號(hào)通路通過(guò)調(diào)節(jié)骨分化、礦化，參與骨骼生長(zhǎng)、修復(fù)、愈合及股骨形成等生理過(guò)程[5]。槲皮素作為植物界廣泛存在的五羥基黃酮類化合物，其藥用價(jià)值較高。槲皮素具有良好的抗炎、抗氧化、抗凋亡及抑制破骨細(xì)胞吸收等活性作用，但目前其多被應(yīng)用于腫瘤領(lǐng)域，對(duì)軟骨細(xì)胞影響的研究報(bào)道較少[6]。以上述內(nèi)容為背景，本研究建立了脛骨平臺(tái)骨折新西蘭兔模型，探討槲皮素對(duì)脛骨平臺(tái)骨折BMP/Runx2信號(hào)通路的影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取40只健康新西蘭大白兔，由湖南太平生物科技有限公司提供。兔齡8～11個(gè)月，平均(9.5±1.2)個(gè)月；體重3 213～4 009 g，平均(3 611.0±338.3)g。保持飼養(yǎng)環(huán)境相對(duì)濕度40%～50%，溫度(24.1±1.3)℃，12 h晝夜交替照明飼養(yǎng)1周。給予標(biāo)準(zhǔn)兔科動(dòng)物飼料喂養(yǎng)，不限制飲食、飲水。本研究已獲得我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，動(dòng)物批準(zhǔn)文號(hào)為WYZLL〔2020〕1479。

1.2 儀器

蘇木精-伊紅染色(HE染色)試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所，貨號(hào)為C0105)；DM750型顯微鏡(德國(guó)Leica公司)，MultiskanTMFC型酶標(biāo)儀[賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司]；骨鈣素酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(江蘇艾博因生物科技有限公司)；炎癥因子[腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素(IL)1β和IL-10]ELISA試劑盒(滁州仕諾達(dá)生物科技有限公司)。

1.3 藥品與試劑

槲皮素(美國(guó)MedChemExpress公司，批號(hào)為HY-18085，純度>98.0%)；戊巴比妥鈉(上海新亞藥業(yè)有限公司)；鼠抗BMP一抗(美國(guó)BD公司，貨號(hào)為D163283)；鼠抗Runx2二抗(美國(guó)Abcam公司，貨號(hào)為ab23981)。

2 方法

2.1 建模及分組

隨機(jī)選取10只新西蘭大白兔不做處理作為正常組。對(duì)剩余30只新西蘭大白兔通過(guò)骨缺損法建立脛骨3 mm骨缺損模型[7]。采用3%戊巴比妥鈉30 mg/kg進(jìn)行耳緣靜脈注射麻醉，麻醉后固定大白兔四肢，選取后肢剪毛，脫毛，消毒，依次切開(kāi)皮膚皮下組織關(guān)節(jié)囊，暴露脛骨平臺(tái)。采用雙層鋼鋸造成家兔脛骨平臺(tái)骨折，骨折處寬度約3 mm，深度約為脛骨1/3。術(shù)畢縫合傷口，手術(shù)操作均在嚴(yán)格無(wú)菌條件下進(jìn)行，術(shù)后給予常規(guī)抗炎抗感染治療，見(jiàn)圖1。術(shù)后分籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食。通過(guò)X線檢查證實(shí)造模成功。建模過(guò)程中死亡1只，成功29只，分為模型組9只，低、高劑量組各10只。

圖1 脛骨平臺(tái)骨折建模過(guò)程Fig 1 Modeling process of tibial plateau fracture

2.2 給藥干預(yù)

對(duì)各組新西蘭兔進(jìn)行藥物干預(yù)，參考人與動(dòng)物體表面積等效劑量比值，計(jì)算新西蘭兔給藥劑量，以1/2等效劑量為低劑量，2倍為高劑量，對(duì)低、高劑量組新西蘭兔分別按照100、200 mg/kg槲皮素灌胃，灌胃體積為20 mL/kg，1日1次，正常組、模型組新西蘭兔給予等體積0.9%氯化鈉溶液干預(yù)，1日1次，各組均連續(xù)干預(yù)7 d。

2.3 標(biāo)本采集及HE染色

藥物干預(yù)7 d后，抽取新西蘭兔靜脈血5 mL，離心處理20 min(轉(zhuǎn)速2 500 r/min，離心半徑10 cm)，分離上清液，-70 ℃環(huán)境下待檢。栓塞致死，取左脛骨標(biāo)本(骨折斷端及其周圍骨痂組織約1 cm)，置于4%甲醛溶液中固定，24 h后脫水處理，石蠟包埋，切成4 μm切片，依次經(jīng)二甲苯、梯度乙醇水化后，蘇木精浸染5 min，鹽酸乙醇分色，流水沖洗，1%伊紅染色2～3 min，脫水、透明、封片，光鏡下(倍數(shù)200，視野0.75)進(jìn)行觀察。

2.4 觀察指標(biāo)

(1)血清骨鈣素、炎癥因子(TNF-α、IL-1β和IL-10)水平檢測(cè)：采用雙抗體夾心ELISA法測(cè)定，在酶標(biāo)儀下測(cè)定具體數(shù)值，參照試劑盒說(shuō)明書和儀器操作進(jìn)行。(2)蛋白質(zhì)印跡法測(cè)定各組新西蘭兔骨痂組織中BMP、Runx2蛋白表達(dá)：取出待檢新西蘭兔骨痂組織加入RIPA裂解液裂解、勻漿，以BCA試劑盒測(cè)定總蛋白濃度，SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜后，5%脫脂牛奶封閉2 h，加入一抗(1∶400)，過(guò)夜孵育。加入二抗(1∶5 000)孵育2 h，顯影、定影、沖洗、晾干，掃描膠片，采用Image J軟件分析BMP、Runx2表達(dá)，以β-actin為內(nèi)參，目標(biāo)蛋白水平=目標(biāo)條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 四組新西蘭兔骨痂組織病理圖

正常組骨小梁密集、排列整齊有序；模型組骨小梁稀少，存在明顯炎癥反應(yīng)；低劑量組骨小梁較少，結(jié)構(gòu)稍稀疏；高劑量組骨小梁結(jié)構(gòu)增多，配列較為整齊，見(jiàn)圖2。

A.正常組；B.模型組；C.低劑量組；D.高劑量組A.normal group; B.model group; C.low-dose group; D.high-dose group圖2 四組新西蘭兔骨痂組織病理圖(HE，×200)Fig 2 Pathologic figure of bone callus of four groups of New Zealand rabbits (HE，×200)

3.2 四組新西蘭兔血清骨鈣素水平比較

正常組、模型組、低劑量組和高劑量組新西蘭兔血清骨鈣素水平分別為(3.79±0.25)、(2.36±0.18)、(3.00±0.21)和(3.57±0.29)ng/mL。相比正常組，模型組、低劑量組和高劑量組新西蘭兔血清骨鈣素水平降低；相比模型組，低劑量組、高劑量組新西蘭兔血清骨鈣素水平較高；與低劑量組相比，高劑量組新西蘭兔血清骨鈣素水平升高，上述差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3.3 四組新西蘭兔脛骨平臺(tái)骨折炎癥因子水平比較

相比正常組，模型組、低劑量組和高劑量組新西蘭兔血清TNF-α、IL-1β和IL-10水平升高；相比模型組，低劑量組、高劑量組新西蘭兔血清TNF-α、IL-1β和IL-10水平較低；相比低劑量組，高劑量組新西蘭兔血清TNF-α、IL-1β和IL-10水平較低，上述差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 四組新西蘭兔血清TNF-α、IL-1β和IL-10水平比較Tab 1 Comparison of serum levels of TNF-α, IL-1β and IL-10 among four groups of New Zealand rabbits

3.4 四組新西蘭兔骨痂組織中BMP、Runx2蛋白表達(dá)比較

相比正常組，模型組、低劑量組和高劑量組新西蘭兔骨痂組織BMP、Runx2表達(dá)升高；相比模型組，低劑量組、高劑量組新西蘭兔骨痂組織BMP、Runx2表達(dá)較高；相比低劑量組，高劑量組新西蘭兔骨痂組織BMP、Runx2表達(dá)較高，上述差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2、圖3。

表2 四組新西蘭兔骨痂組織BMP、Runx2蛋白表達(dá)比較Tab 2 Comparison of BMP and Runx2 protein expression in bone callus tissues of four groups of New Zealand rabbits

A.正常組；B.模型組；C.低劑量組；D.高劑量組；與正常組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05；與低劑量組相比，cP<0.05A.normal group; B.model group; C.low-dose group; D.high-dose group； vs. normal group, aP<0.05; vs. model group, bP<0.05;vs. low-dose group, cP<0.05圖3 四組新西蘭兔骨痂組織中BMP、Runx2蛋白表達(dá)比較Fig 3 Comparison of BMP and Runx2 protein expression in bone callus tissues of four groups of New Zealand rabbits

4 討論

脛骨平臺(tái)位于股骨與脛骨下段接觸面，屬于膝關(guān)節(jié)重要負(fù)荷結(jié)構(gòu)。其骨折發(fā)生多因高能量創(chuàng)傷所致，因其損傷復(fù)雜多變，且極易造成周圍韌帶及半月板損傷，對(duì)患者膝關(guān)節(jié)功能及穩(wěn)定性造成影響[8-9]。目前，手術(shù)治療作為主要手段，在穩(wěn)定關(guān)節(jié)面的同時(shí)會(huì)導(dǎo)致炎癥反應(yīng)發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加，對(duì)預(yù)后造成威脅。降鈣素、甲狀旁腺素等化學(xué)藥在骨折治療方面具有一定的效果，但存在一定的不良反應(yīng)，因此不適合長(zhǎng)期使用[10-11]。

槲皮素屬于黃酮類化合物，在金絲桃苷、蕓香苷和槲皮苷中含量較高，可有效促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞的成骨細(xì)胞分化，對(duì)RAW264.7細(xì)胞中破骨細(xì)胞生成產(chǎn)生抑制[12]。相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，槲皮素可有效促進(jìn)成骨細(xì)胞分化、增殖，并提高骨鈣素、骨保護(hù)素等骨標(biāo)志物及骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的表達(dá)[13]。有研究結(jié)果指出，槲皮素可阻止核因子κB(NF-κB)受體活化，NF-κB和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶信號(hào)級(jí)聯(lián)激活受到抑制進(jìn)而消除破骨細(xì)胞生成及分化[14]。本研究結(jié)果顯示，通過(guò)槲皮素對(duì)脛骨平臺(tái)骨折新西蘭兔進(jìn)行干預(yù)，可提高血清骨鈣素水平，與既往研究結(jié)果一致[13]。表明槲皮素可有效提高骨鈣素水平，干預(yù)效果顯著。

骨愈合過(guò)程屬于高度復(fù)雜且有序的生物學(xué)修復(fù)過(guò)程，生物化學(xué)、生物物理因子和血液循環(huán)狀態(tài)的調(diào)控及人體微量因子水平均對(duì)骨愈合過(guò)程造成影響[15]。相關(guān)研究結(jié)果顯示，多條信號(hào)通路在骨形成控制中積極參與，常見(jiàn)通路包括Smad、BMP和Runx2通路[16]。相關(guān)資料表明，成骨細(xì)胞分化受BMP/Runx2等多種信號(hào)通路調(diào)控，且BMP/Runx2信號(hào)通路與骨形成具有密切關(guān)聯(lián)[17-18]。Runx2作為成骨細(xì)胞分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，是BMP的下游靶點(diǎn)。Runx2可對(duì)成骨細(xì)胞特異性基因的表達(dá)產(chǎn)生直接調(diào)節(jié)作用，同時(shí)在骨形成的多個(gè)階段中均發(fā)揮重要調(diào)控作用[19-20]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，槲皮素可對(duì)骨痂組織中的BMP、Runx2 mRNA的表達(dá)產(chǎn)生促進(jìn)效果。BMP屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子超家族成員，是骨形成的重要蛋白質(zhì)，可誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，是骨形成的重要蛋白質(zhì)，其缺失會(huì)導(dǎo)致自發(fā)性骨折。由此表明，槲皮素可顯著提高骨愈合效果，BMP/Runx2信號(hào)通路參與其中。但臨床中有關(guān)槲皮素對(duì)BMP/Runx2信號(hào)通路影響的相關(guān)研究較少，其實(shí)效性有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，在脛骨平臺(tái)骨折新西蘭兔實(shí)驗(yàn)中，槲皮素可有效抑制炎癥介質(zhì)活性，為新西蘭兔骨質(zhì)生長(zhǎng)提供良好的生物環(huán)境，加速骨愈合，并證實(shí)槲皮素作用機(jī)制與激活BMP/Runx2信號(hào)通路具有相關(guān)性，為脛骨平臺(tái)骨折藥物研究提供重要參考依據(jù)。但本研究樣本量較小、觀察時(shí)間有限，且未對(duì)不同藥物使用劑量進(jìn)行研究，需進(jìn)一步增加樣本量對(duì)其干預(yù)效果進(jìn)行深入研究。