丁苯酞對硝苯地平在大鼠體內藥動學及機制的影響研究Δ

薛朝軍，杜雨晗，趙 越，董占軍#

(1.河北省人民醫(yī)院藥學部，石家莊 050051； 2.河北省人民醫(yī)院神經內五科，石家莊 050051)

丁苯酞是從芹菜籽中提取的揮發(fā)油中的一種藥理活性成分，作為Ⅰ類新藥于2004年獲批上市，用于改善急性缺血性腦卒中患者的神經功能缺損。近年來研究結果顯示，丁苯酞對血管性癡呆[1]、帕金森病[2]等疾病也有一定的療效。丁苯酞的藥理作用包括抗血小板聚集、抗血栓、線粒體保護、神經元保護、抗氧化應激和促進神經再生等[3-4]。系統(tǒng)評價[5]與大量的臨床研究[6-7]結果顯示，丁苯酞治療缺血性腦卒中的療效和安全性良好，已被納入《中國腦卒中防治指導規(guī)范(2021年版)》[8]和《缺血性卒中基層診療指南(2021年)》[9]等最新的臨床實踐指南。

《中國腦卒中防治報告2019》[10]指出，我國的腦卒中整體發(fā)病率可達39.9%，居世界首位，近年來腦卒中已成為第一死亡原因，給我國造成沉重的經濟負擔，且其發(fā)病率呈快速升高趨勢。值得注意的是，在我國人群中，腦卒中最主要的心腦血管風險為高血壓。臨床上，鈣通道阻滯劑為治療高血壓病的一線藥物，也是腦卒中一級預防與二級預防中抗高血壓藥的首選[8]。鈣通道阻滯劑與丁苯酞在臨床存在廣泛聯(lián)合應用的現(xiàn)象[11-12]。但鈣通道阻滯劑與丁苯酞相互作用的研究較少。楊秀嶺等[13]的研究結果表明，丁苯酞可使大鼠體內硝苯地平吸收減少、消除加快。Wang等[14]的研究結果顯示，丁苯酞與尼莫地平在比格犬中沒有顯著的藥動學相互作用。丁苯酞與硝苯地平的相互作用可能導致腦卒中患者的高血壓不能達到治療目標。因此，進一步研究丁苯酞與硝苯地平可能的藥物相互作用及作用機制對臨床聯(lián)合用藥有著重要意義。本研究旨在探討丁苯酞對硝苯地平在大鼠體內藥動學的影響及其相關作用機制。

1 材料

1.1 動物

本研究所使用的雄性SD大鼠[平均體重(250±20)g]由河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供，生產合格證號為1707095，使用許可證號為SCXK(冀)2013-10003。

1.2 儀器

Sciex 5500型三重四級桿串聯(lián)質譜儀(美國AB公司)；Shimadzu LC-30AD型超高效液相色譜系統(tǒng)(日本島津公司)；Zentrifuge 1602型高速低溫離心機(德國Hettich公司)；AB204-S型標準型分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)；平衡透析袋(扁寬31 mm，截留分子量500 D)、PBS溶液(北京索萊寶科技有限公司)。

1.3 藥品與試劑

丁苯酞(石藥集團，純度>98%)；硝苯地平(索萊寶生物科技有限公司，批號201404，純度>98%)，尼莫地平(索萊寶生物科技有限公司，批號201424，純度>98%)。

2 方法

2.1 應用超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法(LC-MS/MS)建立生物樣品中硝苯地平的分析方法

2.1.1 色譜條件：色譜柱為Waters ACQUITY?UPLC HSS T3(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)；流動相為乙腈(B)-0.1%甲酸水(A)，梯度洗脫(0.5 min，50% B；1 min，60% B；3 min，80% B；4 min，90% B；4.5 min，停止)；流速為0.3 mL/min；進樣量為5 μL。

離子源選擇電噴霧電離源，使用多反應監(jiān)測模式下的正離子掃描，離子源噴射電壓為5 500 V；離子源溫度為500 ℃；源內氣流速(GS1，GS2)為50 L/min；氣簾氣壓力為68.95 kPa；碰撞氣壓力為68.95 kPa。Compound參數(shù)，硝苯地平DP 120 eV，CE 25 eV；尼莫地平DP 95 eV，CE 10 eV；EP均為10 eV，CXP均為14 eV。離子對，硝苯地平m/z347.1→254.1；內標尼莫地平m/z419.2→343.2。

2.1.2 儲備液和工作液制備：精密稱取適量的丁苯酞、硝苯地平和尼莫地平標準品，使用甲醇于10 mL棕色容量瓶溶解稀釋至刻度后搖勻，配制成儲備液。精密吸取適量儲備液后稀釋定容，制備成系列濃度的工作液。儲備液與工作液均需置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.3 生物樣品預處理：取大鼠血漿50 μL，加入內標5 μL，渦旋30 s，加入甲醇150 μL作為沉淀劑后渦旋混勻2 min，轉速11 573 r/min,離心半徑8 cm,離心10 min，取50 μL用于LC-MS/MS分析。

2.1.4 標準曲線和質控樣品：精密量取相應工作液5 μL，用大鼠空白血漿45 μL稀釋得到硝苯地平終濃度為1、5、10、50、100、500和1 000 ng/mL的血漿標準曲線及硝苯地平終濃度為 2、50和800 ng/mL的低、中及高濃度質量控制(QC)樣品。

2.1.5 專屬性考察：分別取6只大鼠的空白血漿，按照“2.1.4”項下要求，制備1 ng/mL的硝苯地平和尼莫地平血漿樣品，考察血漿成分是否干擾硝苯地平和尼莫地平的測定。

2.1.6 線性和最低定量限考察：按照“2.1.4”項下要求，制備3條標準曲線樣品，同批次處理并分析，以硝苯地平濃度為橫坐標，硝苯地平和尼莫地平的峰面積比值為縱坐標，回歸運算使用加權最小二乘法，使用軟件繪制標準曲線，計算線性回歸系數(shù)r2。當信噪比S/N>10時，最低定量為標準曲線的最低濃度。

2.1.7 精密度和準確度考察：按照“2.1.4”項下要求，制備平行5份的3個濃度的QC樣品，連續(xù)檢測3 d。每日計算QC樣品的濃度，對3 d的結果進行方差分析，得到QC樣品的日內和日間精密度。

2.1.8 回收率和基質效應考察：按照“2.1.4”項下要求，制備3個QC濃度的血漿樣品，為樣本Ⅰ。取大鼠的空白血漿100 μL，加入甲醇300 μL，渦漩30 s。轉速11 573 r/min，離心半徑8 cm，離心10 min后取上清液，取適量工作液配置成3個QC濃度的樣品，為樣本Ⅱ。取3個濃度的QC工作液，直接進樣，為樣本Ⅲ。計算公式為回收率=樣本Ⅰ/樣本Ⅱ；基質效應=樣本Ⅱ/樣本Ⅲ。

2.1.9 穩(wěn)定性：本研究考察了血漿樣品在室溫(25 ℃)放置4 h、經歷3次冷凍-解凍循環(huán)以及血漿樣品-20 ℃冷凍15 d的穩(wěn)定性。使用低、中和高濃度的QC血漿樣品，進行穩(wěn)定性分析。用空白大鼠血漿稀釋工作液，考察稀釋穩(wěn)定性，稀釋倍數(shù)為10、20、50和100。

2.1.10 生物樣品試用性：按照“2.1.4”項下要求，制備3個濃度的細胞裂解液QC樣品用來考察生物樣品試用性。

2.2 大鼠體內藥動學實驗

實驗前，大鼠禁食過夜，不限飲水。將實驗藥物混懸于0.5% CMC-Na溶液，對照組大鼠給予硝苯地平10 mg/kg，實驗組大鼠給予硝苯地平10 mg/kg聯(lián)合丁苯酞80 mg/kg，每組6只，灌胃給藥。在0、0.08、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、4、6、8、10和12 h于眼底靜脈叢取血0.5 mL，立即3 000 r/min(離心半徑8 cm)離心10 min，取血漿于-20 ℃保存。

2.3 大鼠體外翻轉腸實驗

實驗分組如下：單用組大鼠給予硝苯地平4 mg/L；合用1組、合用2組和合用3組大鼠分別給予硝苯地平4 mg/L+丁苯酞4、16和32 mg/L。取SD大鼠12只，麻醉后于腹中線打開腹腔，取約10 cm空腸，每只大鼠取2段共24段空腸，每組6段。將取出的空腸于冰冷的PBS中小心除去肌肉與脂肪，輕柔翻轉后使黏膜向外。將近心端固定于取樣口并結扎遠心端。腸囊內加入5%葡萄糖作為受藥體系，用預熱的37 ℃ PBS配制各實驗組濃度的藥液作為供藥體系，將腸囊垂直放入供藥體系溫孵平衡，受藥體系液面應高于供藥體系。于30、60和90 min收集受藥體系內溶液50 μL，保存于-20 ℃待測。

2.4 平衡透析法

2.4.1 透析袋預處理：將透析袋剪成10 cm小段，在2%NaHCO3(w/v)、1 mmol/L乙二胺四乙酸溶液中煮10 min，蒸餾水清洗后在1 mmol/L乙二胺四乙酸溶液(pH=8.0)中煮10 min，自然冷卻后于4 ℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4.2 平衡透析實驗：處理過的透析袋一端折疊后用縫線扎緊，在另一端加入新鮮大鼠血漿2 mL后用縫線扎緊，注意留一小段氣泡，將加入大鼠血漿的透析袋懸浮于20 mL含藥透析液的廣口棕瓶中。分組如下，對照組給予硝苯地平4 mg/L；丁苯酞低、中及高劑量組分別給予硝苯地平4 mg/L+丁苯酞2、4及8 mg/L。每組平行3次。根據預實驗結果，平衡時間12 h，平衡溫度2～8 ℃。待透析平衡后，精密吸取透析袋內外液各200 μL并測定，透析袋內藥物濃度為總濃度(Ct)；透析外液中的藥物濃度為離藥物濃度(Cf)。藥物血漿蛋白結合率=(Ct-Cf)/Ct×100%。

2.5 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 生物樣品中硝苯地平LC-MS/MS分析方法

3.1.1 專屬性、標準曲線和最低定量限：本方法專屬性高，硝苯地平和內標尼莫地平的保留時間分別為2.53和3.47 min，空白血漿中的內源性物質不干擾硝苯地平和內標的測定。標準曲線方程為Y=0.018 4X+0.026 7，r=0.995 6。線性范圍為1～1 000 ng/mL。硝苯地平在上述范圍內線性良好，最低定量限為1 ng/mL，RSD為5.50%<15%。結果見圖1。

A.硝苯地平保留時間；B.尼莫地平保留時間；C.硝苯地平空白血漿；D.尼莫地平空白血漿；E.硝苯地平最低定量限A. retention time of nifedipine; B. retention time of nimodipine; C. blank plasma of nifedipine; D. blank plasma of nimodipine; E. minimum limit of quantitation of nifedipine圖1 硝苯地平與尼莫地平的保留時間、空白血漿及硝苯地平最低定量限質譜圖Fig 1 Mass spectrum of retention time and blank plasma of nifedipine and nimodipine, and the minimum limit of quantitation of nifedipine

3.1.2 方法學驗證結果：(1)精密度和準確度。硝苯地平QC樣品(2、50及800 ng/mL)的日內精密度RSD為3.8%～10.5%；日間精密度RSD為-1.8%～11.5%；準確度RSD為4.5%～7.9%，均<15%。精密度、準確度符合方法學要求。(2)回收率和基質效應。硝苯地平QC樣品回收率均>90%，無顯著差異，基質效應>85%，基質效應恒定。(3)穩(wěn)定性。硝苯地平QC樣品室溫放置4 h、經歷3次冷凍-解凍循環(huán)、血漿樣品-20 ℃冷凍15 d，與新配制樣品相比，檢測結果無顯著差異。穩(wěn)定性符合方法學要求。(4)稀釋10、20、50及100倍后，硝苯地平的精密度和準確度可滿足要求，表明樣品可被稀釋。

3.2 大鼠體內藥動學結果

實驗組與對照組大鼠體內硝苯地平的藥時曲線見圖2，主要藥動學參數(shù)見表1。與對照組相比，實驗組大鼠硝苯地平的藥時曲線下面積(AUC)、峰濃度(Cmax)明顯降低，表觀分布容積(V/F)明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；半衰期(T1/2)縮短，清除率(CL/F)升高，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖2 硝苯地平在大鼠體內的藥時曲線Fig 2 Drug-time curve of nifedipine in rats

表1 硝苯地平在大鼠體內的藥動學參數(shù)Tab 1 Pharmacokinetic parameters of nifedipine in rats

3.3 大鼠體外翻轉腸實驗

翻轉腸腸囊內硝苯地平濃度結果見圖3。丁苯酞抑制硝苯地平在大鼠腸道的吸收，在30、60 min 2個時間點，與單用組相比，各合用組腸囊內硝苯地平濃度均降低，其中合用2組、合用3組與單用組的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。合用組中隨著丁苯酞濃度的增加，腸囊內硝苯地平濃度降低，丁苯酞對硝苯地平吸收的抑制作用表現(xiàn)出濃度依賴性。

圖3 丁苯酞對硝苯地平體外腸道吸收的影響Fig 3 Effects of butylphthalide on in vitro intestinal absorption of nifedipine

3.4 血漿蛋白結合率

丁苯酞對硝苯地平血漿蛋白結合率的作用見圖4。對照組硝苯地平的平均血漿蛋白結合率為(93.25±2.32)%；丁苯酞低、中及高劑量組硝苯地平的平均血漿蛋白結合率分別為(93.75±2.82)%、(94.50±2.35)%和(93.00±2.59)%，各組間的差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖4 丁苯酞對硝苯地平血漿蛋白結合率的影響Fig 4 Effects of butylphthalide on plasma protein binding rate of nifedipine

4 討論

一項約14 000名中老年高血壓受試者參與的臨床研究結果表明，收縮壓標準差增加5 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)，死亡風險、心血管事件風險分別增加10%、15%[15]。臨床上，腦卒中患者常合并高血壓，因此，腦卒中患者的高血壓達標治療對疾病預后有重要意義。血壓變異性(BPV)與靶器官損傷(包括左心室肥厚、腦小血管疾病和腎功能降低[16]等)、心腦血管事件及死亡率密切相關。因此，除了降低平均血壓外，控制BPV應該是一個新的目標[17]。藥物相互作用是影響B(tài)PV的重要因素[18]。腦卒中伴高血壓患者常聯(lián)合應用多種藥品，藥物相互作用對血壓控制的影響不容忽視。本實驗在大鼠體內證明了丁苯酞抑制硝苯地平的吸收(AUC、Cmax顯著降低)并增強其代謝(T1/2縮短、CL/F升高)，提示BNP與硝苯地平合用時可能影響患者的血壓控制，增加BPV。

藥物在吸收相的相互作用主要發(fā)生在腸道，通過體外翻轉腸囊實驗證明，丁苯酞抑制了硝苯地平在大鼠腸道的吸收，其抑制作用隨著丁苯酞濃度的升高有增強趨勢，表現(xiàn)出濃度依賴性。P糖蛋白(P-gp)是腸道藥物相互作用的重要靶點[19]。硝苯地平為P-gp的底物。P-gp的抑制劑吡格列酮[20]、氟伐他汀和辛伐他汀[21]等可以在腸道抑制硝苯地平的外排從而顯著增加硝苯地平在腸道的吸收。但P-gp的強抑制劑環(huán)孢素與硝苯地平合用并不引起硝苯地平藥動學參數(shù)的顯著變化，提示P-gp在腸道處置硝苯地平的過程并不占主要地位[22]。有研究結果表明，血腦屏障中P-gp參與了丁苯酞主要代謝物3-OH-NBP的外排，提示3-OH-NBP為P-gp的底物[23]。但丁苯酞與P-gp的關系尚未見報道。轉運體介導的丁苯酞與硝苯地平在大鼠腸道的相互作用尚需進一步研究探討。

硝苯地平主要經CYP3A4代謝[24]，丁苯酞主要經CYP3A4、CYP2E1和CYP1A2代謝[25]。兩者的主要代謝酶均為CYP3A4。但有研究結果表明，體外較高濃度丁苯酞僅對人CYP2C19有一定的抑制作用，且丁苯酞對肝微粒體CYP450主要同工酶無顯著誘導和抑制作用[26]。丁苯酞增強硝苯地平代

謝可能有其他機制的參與。硝苯地平血漿蛋白結合率為92%～98%，丁苯酞可能與硝苯地平競爭血漿蛋白結合位點從而增加硝苯地平的游離藥物濃度，由于肝臟只能攝取游離的藥物進行代謝，因此硝苯地平游離濃度的升高可能導致其代謝加快。但實驗結果表明，丁苯酞在體外并不能影響硝苯地平的蛋白結合率。值得注意的是，丁苯酞在體內的代謝產物多達49種，血漿中的主要代謝物分別為3-OH-NBP、M286-8和M284-2[25]，其主要代謝物3-OH-NBP的血漿蛋白結合率約為80%[23]。丁苯酞代謝物對硝苯地平的蛋白結合率的影響仍需進一步探究。