一種分離培養(yǎng)及鑒定小鼠牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞的方法

陳麗玲 徐振健 徐安平

間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）具有自我更新、多能分化和免疫調(diào)節(jié)的作用。近年研究顯示，MSC 可在包括變應(yīng)性結(jié)膜炎、變應(yīng)性鼻炎、急性青光眼、阿爾茨海默病和1 型糖尿病等多種疾病中發(fā)揮治療作用。MSC 可以從不同的組織中分離出來，包括骨髓、臍帶、胎盤、脂肪組織和人的牙齦。牙齦MSC（GMSC）是一種從牙齦組織中獲得的MSC 亞群，2009 年Zhang 等首次從人牙齦組織中分離出GMSC，并證實了其表型及功能活性。與其他MSC 類似，GMSC 也具有抑制炎癥和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的作用。小鼠和人源化動物模型研究顯示，GMSC 能夠通過減少效應(yīng)性T 淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、破骨細(xì)胞和增加調(diào)節(jié)性T 淋巴細(xì)胞等治療包括類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、1 型糖尿病、SLE、動脈粥樣硬化等多種疾病。既往文獻提及的小鼠GMSC 的提取方法需使用多種酶及復(fù)雜的培養(yǎng)基等。本研究以C57BL/6 小鼠進行實驗，旨在建立更為簡便、高效的GMSC 體外提取及培養(yǎng)體系，現(xiàn)報道如下。

材料與方法

一、動 物

SPF 級C57BL/6 小鼠5 只，雌雄不限，8～10周齡，體質(zhì)量15～20 g，購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心。實驗過程中嚴(yán)格遵循減少、替代、優(yōu)化的倫理規(guī)范操作，做到充分考慮動物的利益，善待動物，防止或減少動物的應(yīng)激、痛苦和傷害，尊重動物生命，采取痛苦最少的方法處置動物。

二、主要試劑

包括：α-MEM 培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素雙抗溶液、胎牛血清（FBS），均購自美國Gibco 公司；Ⅳ型膠原酶、地塞米松、β-甘油磷酸鈉、抗壞血酸、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX）、吲哚美辛、人胰島素、油紅O 染液，均購自美國Sigma 公司；細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒（CCK-8 法）購自美國APExBio 公司；結(jié)晶紫染液、茜素紅染液，均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；抗小鼠流式抗體CD29、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105，均購自美國BD 公司。

三、培養(yǎng)液配制

原代細(xì)胞培養(yǎng)液為α-MEM 培養(yǎng)基+20%FBS。完全培養(yǎng)液為α-MEM+10%FBS。成脂誘導(dǎo)液為α-MEM 培養(yǎng)基+10%FBS+200 μmol/L 吲哚美辛+10 mg/L 胰島素+1 μmol/L 地塞米松+500 μmol/L IBMX。成骨誘導(dǎo)液為α-MEM+10%FBS+10 nmol/L地塞米松+50 mg/L 抗壞血酸+10 mmol/L β-甘油磷酸鈉。

四、實驗方法

1. 小鼠GMSC 的分離培養(yǎng)

處死C57BL/6 小鼠，取小鼠下頜骨，清除多余皮膚及肌肉組織，用含有5%雙抗的磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗下頜骨多次。用注射器針頭輕輕分離磨牙區(qū)牙齦。收集分離到的組織于培養(yǎng)皿中，加入1 mg/L Ⅳ型膠原酶，于37 ℃中消化30 min，加入含有 FBS 的α-MEM 終止消化，離心，棄上清。將組織鋪于6 孔板中，每孔加1 mL 含20%FBS 的α-MEM，置于37℃、5%CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待2～3 d 后細(xì)胞爬出，換液把剩余組織塊洗出，每孔加2 mL 20%FBS 的α-MEM，3 d 換1 次液。細(xì)胞長滿板底80%后傳代，傳代后更換為含10%FBS的完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

2. 小鼠GMSC 的增殖能力檢測

按細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒（CCK-8法）說明書進行操作，連續(xù)8 d 在同一時間使用酶標(biāo)儀測量 450 nm 處的吸光度，根據(jù)結(jié)果繪制GMSC 生長曲線。

3. 小鼠GMSC 的表面標(biāo)志物流式細(xì)胞術(shù)檢測

將第2 代 GMSC（約1×10個細(xì)胞）細(xì)胞懸液用PBS 洗滌2 次，用100 μL PBS 重懸后分別加入 流 式 抗 體CD29、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105，4℃避光孵育20 min 后，PBS 洗滌3次，流式細(xì)胞儀檢測上述細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達。

4. 小鼠GMSC 的多向分化潛能誘導(dǎo)

成脂誘導(dǎo)分化：取第2 代GMSC 接種于6 孔板，每孔約3×10個細(xì)胞，待細(xì)胞鋪滿板底70%，更換培養(yǎng)液為成脂誘導(dǎo)液，每隔3 d 換1 次液。誘導(dǎo)21 d 后，PBS 洗滌細(xì)胞1 次，4%多聚甲醛固定30 min，去離子水洗滌2 次后油紅O 染液染色20 min，蒸餾水清洗3 次，干燥后倒置顯微鏡下觀察并拍照。

成骨誘導(dǎo)分化：取第2 代GMSC 接種于6 孔板，每孔約3×10個細(xì)胞，待細(xì)胞鋪滿板底70%，更換為成骨誘導(dǎo)液，每隔3 d 換1 次液。誘導(dǎo)28 d 后，PBS 洗滌細(xì)胞1 次，4%多聚甲醛固定30 min，去離子水洗滌2 次后茜素紅染液染色30 min，蒸餾水清洗3 次，干燥后倒置顯微鏡下觀察并拍照。

五、統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用GraphPad Prism 8 軟件進行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，以 表示，組間比較采用t 檢驗，多個時間點的比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t 檢驗。P ＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、小鼠GMSC 的分離培養(yǎng)結(jié)果

培養(yǎng)2～3 d 后，普通光學(xué)倒置顯微鏡下可見原代細(xì)胞從組織爬出，貼壁生長，細(xì)胞呈長梭狀（圖1A）?？梢娫?xì)胞培養(yǎng)至10～14 d 時細(xì)胞鋪滿皿底80%（圖1B、C），可進行傳代培養(yǎng)。

圖1 小鼠GMSC 的分離培養(yǎng)與形態(tài)（普通光學(xué)倒置顯微鏡）

二、小鼠GMSC 的增殖能力檢測結(jié)果

CCK-8 法結(jié)果顯示，GMSC 在第3～4 日增長最快，在第5～8 日增長變得緩慢，出現(xiàn)平臺期。普通光學(xué)倒置顯微鏡下可見GMSC 在第3～4 日數(shù)量增長明顯，在第5～8 日數(shù)量逐漸到達最大值，并進入平臺期。各時間點的變化組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F = 339.90，P ＜ 0.001）， 其中第0～2 日、第5～8 日的相鄰時間點比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞ 0.05），第2～5 日相鄰時間點比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P 均＜ 0.05），見圖2。

圖2 小鼠GMSC 的增殖能力檢測結(jié)果

三、小鼠GMSC 的細(xì)胞表面標(biāo)志物流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果

小鼠GMSC 高表達CD29、CD44、CD90、CD105，最高的表達率達90%及以上，CD73 最高表達率高于70%，CD39 最高表達率為26.3%，同時結(jié)果顯示所提取細(xì)胞幾乎不表達CD34、CD45，表達率均低于5%，說明所提取的細(xì)胞純度較高。以小鼠口腔黏膜上皮細(xì)胞為對照細(xì)胞，可見GMSC 的CD29（t = 2.686，P = 0.036）、CD44（t = 22.582，P ＜0.001）、CD73（t = 3.183，P = 0.019）、CD90（t =62.944，P ＜ 0.001）、CD105（t = 8.590，P ＜ 0.001）、CD39（t= 5.799，P ＜ 0.001）的表達均高于對照細(xì)胞，兩者CD34（t = 1.572，P = 0.140）、CD45（t =-1.643，P = 0.151）表達相似，見圖3。

圖3 小鼠GMSC 的細(xì)胞表面標(biāo)志物流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果

四、小鼠GMSC 的成脂誘導(dǎo)及鑒定結(jié)果

小鼠GMSC 經(jīng)成脂誘導(dǎo)液培養(yǎng)21 d 后，分化為脂肪細(xì)胞并分泌出脂滴，經(jīng)油紅O 染液染色后，在光學(xué)顯微鏡下可見葡萄串狀紅色脂滴形成，見圖4。

圖4 GMSC 成脂誘導(dǎo)分化的鑒定（油紅O 染液染色）

五、小鼠GMSC 的成骨誘導(dǎo)及鑒定結(jié)果

小鼠GMSC 經(jīng)成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)后，細(xì)胞逐漸從長紡錘形變?yōu)槎噙呅危⒊识鄬痈采w生長，可見陸續(xù)出現(xiàn)小的鈣化。成骨誘導(dǎo)28 d 后，小鼠GMSC 經(jīng)茜素紅染液染色后可見紅褐色鈣化結(jié)節(jié)，見圖5。

圖5 GMSC 成骨誘導(dǎo)分化的鑒定（茜素紅染液染色）

討 論

近年來，GMSC 在自身免疫性和炎癥性疾病中的抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用越來越受到重視。與其他組織來源的MSC 相比，GMSC 具有易于分離、便于獲取、增殖快、不具致瘤性、同源性好、免疫調(diào)節(jié)作用及再生功能強于其他MSC 等優(yōu)點。

目前，小鼠等動物GMSC 的提取方法為組織消化法或組織塊法：組織消化法使用膠原酶和分離酶消化分離的組織塊，再通過過濾器獲得單細(xì)胞懸液進行種板，操作步驟繁雜，且多種酶的消化易對原代GMSC 造成損傷，導(dǎo)致細(xì)胞提前分化失去其生物學(xué)特性；組織塊法則將沖洗無菌的組織塊直接種板，通過倒立培養(yǎng)瓶的方法獲取原代細(xì)胞，該法提取細(xì)胞數(shù)量少、效率低且成功率不穩(wěn)定。

本研究將2 種提取原代GMSC 的方法相結(jié)合并加以改良，對分離的牙齦組織僅用Ⅳ型膠原酶消化半小時，然后把消化后的牙齦組織直接種板，2～3 d 后可見細(xì)胞爬出。由此可見該改良方法具有以下優(yōu)點：①步驟過程簡單、易操作；②僅用一種消化酶，減短了消化時間，不僅減少了消化酶對原代細(xì)胞的損傷，而且節(jié)約了試劑成本；③經(jīng)膠原酶處理的牙齦組織變軟后再進行種板，更有利于種板后GMSC 從組織中爬出，短時間內(nèi)有較高的細(xì)胞獲得率，節(jié)約時間成本，同時通過換液、傳代可進一步純化細(xì)胞；④培養(yǎng)液成分更為簡單。與組織消化法及組織塊法相比，新的提取GMSC方法更為簡便、易行，見表1。

表1 小鼠GMSC 的3 種分離培養(yǎng)方法比較

本研究中小鼠GMSC 生長曲線從一定程度上可反映GMSC 的增殖規(guī)律，第3～4 日增殖活躍，第5 日始增殖進入平臺期，第7～8 日由于培養(yǎng)時間過長細(xì)胞生長過密，細(xì)胞開始出現(xiàn)凋亡，數(shù)量有少許下降。本研究所提取的細(xì)胞高表達CD29、CD44、CD90、CD105，最高表達率均高于90%，CD73 最高表達率高于70%，基本不表達造血細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)志物CD34、CD45，最高表達率均低于5%，符合GMSC 細(xì)胞標(biāo)志物特性，同時提示所取取的細(xì)胞純度較高。多向分化誘導(dǎo)實驗中，小鼠GMSC 在各自特定誘導(dǎo)條件下成功分化成對應(yīng)組織，證實了GMSC的多向分化功能。本研究表明，改良法提取的GMSC 具有快速增殖的優(yōu)點，同時通過該法所分離的細(xì)胞有較高的純度，且能表現(xiàn)多向分化的干細(xì)胞特性，因此該法提取GMSC 是可行的。

對GMSC 的相關(guān)研究表明，GMSC 在倫理學(xué)、獲取方法和分化潛能等方面具有明顯優(yōu)勢，被認(rèn)為是一種較好的MSC 來源，在細(xì)胞治療、再生醫(yī)學(xué)等方面具有重要的研究意義。本研究的動物GMSC 提取技術(shù)的研究與改良有助于促進各類疾病動物模型GMSC 的自體移植的實現(xiàn)，有利于深入研究GMSC 對疾病治療作用的可能機制。